陳相如，汪勁松，王衛(wèi)東，張新潮，潘繼承

(1.湖北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，湖北 黃石 435002； 2.食用野生植物保育與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 黃石 435002)

黃芩苷與人源RANKL胞外結(jié)構(gòu)域相互作用的研究

陳相如1,2，汪勁松1,2，王衛(wèi)東1,2，張新潮1,2，潘繼承1,2

(1.湖北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，湖北 黃石 435002； 2.食用野生植物保育與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 黃石 435002)

細(xì)胞核因子κB受體活化因子配體(receptor activator of NF-kappa B ligand，RANKL)源于成骨細(xì)胞，對(duì)于破骨細(xì)胞分化和激活具有重要作用。RANKL能與破骨細(xì)胞表面受體RANK(receptor activator of NF-kappa B)結(jié)合，骨保護(hù)素(osteoprotegerin，OPG)作為誘騙受體競(jìng)爭(zhēng)性地與RANKL結(jié)合，兩者共同調(diào)節(jié)骨平衡。兩者調(diào)節(jié)異常會(huì)引起骨形成與骨吸收失衡，導(dǎo)致骨代謝性疾病發(fā)生，如骨質(zhì)疏松癥、關(guān)節(jié)炎等。黃芩苷，是從傳統(tǒng)中藥黃芩中提取的黃酮類化合物，在醫(yī)藥行業(yè)中被廣泛應(yīng)用。熒光光譜法實(shí)驗(yàn)表明：在體外黃芩苷對(duì)RANKL胞外結(jié)構(gòu)域的內(nèi)源熒光有明顯的猝滅作用，黃芩苷使RANKL內(nèi)部生色基團(tuán)所處微環(huán)境的極性增大；蛋白ANS熒光峰強(qiáng)度隨著黃芩苷的濃度先增后降，在8×10-5mol/L時(shí)達(dá)到峰值，說(shuō)明RANKL疏水面暴露程度可能先增大后減小，在8×10-5mol/L時(shí)，疏水面暴露程度最大；分子模擬結(jié)果顯示：黃芩苷與人源RANKL/OPG-CRD復(fù)合物之間有較強(qiáng)的相互作用，且位于該復(fù)合物中心內(nèi)部空腔，說(shuō)明兩者結(jié)合緊密，預(yù)測(cè)了兩者相互作用的氨基酸位點(diǎn)。但黃芩苷是否抑制RANKL-RANK結(jié)合需進(jìn)一步研究。研究黃芩苷與RANKL相互作用對(duì)闡明調(diào)節(jié)骨代謝紊亂及抗癌機(jī)理具有重要意義。

RANKL/RANK/OPG；黃芩苷；熒光光譜法；分子模擬

骨平衡由成骨細(xì)胞的骨形成功能和破骨細(xì)胞的骨吸收功能共同調(diào)節(jié)。細(xì)胞核因子κB受體活化因子配體(receptor activator for nuclear factor κB ligand，RANKL)是一種Ⅱ型跨膜蛋白，由成骨細(xì)胞產(chǎn)生，對(duì)于破骨細(xì)胞分化和激活具有重要作用[1]。細(xì)胞核因子κB活化因子受體(receptor activator for nuclear factor κB，RANK)是一種Ⅰ型跨膜蛋白，在破骨細(xì)胞表面表達(dá)，與其配體RANKL都屬于腫瘤壞死因子家族(tumor necrosis factor receptor-ligand family)，介導(dǎo)破骨細(xì)胞生成[2]。骨保護(hù)素(osteoprotegerin，OPG)作為誘騙受體競(jìng)爭(zhēng)性地與RANKL結(jié)合，能有效地抑制破骨細(xì)胞的成熟與激活[3-4]。RANKL與OPG的結(jié)合比能很好地調(diào)節(jié)骨代謝的方向，即骨形成或骨吸收。因此，RANKL與OPG的結(jié)合比調(diào)節(jié)異常會(huì)引起骨形成與骨吸收失衡，導(dǎo)致骨代謝紊亂性疾病發(fā)生，如骨質(zhì)疏松癥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等[5-8]。在發(fā)展治療骨吸收過(guò)量引起的骨代謝紊亂性疾病時(shí)，RANKL/RANK/OPG系統(tǒng)是調(diào)控破骨細(xì)胞生成的關(guān)鍵點(diǎn)，同時(shí)也成為公認(rèn)的靶標(biāo)[9]。 RANKL/RANK/OPG系統(tǒng)還參與了癌細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移，乳腺癌是女性患病和死亡人數(shù)最高的惡性腫瘤，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是乳腺癌致死的主要原因，阻斷RANKL與RANK的結(jié)合可以達(dá)到間接抗癌的療效。

黃芩苷(Baicalin)是黃芩主要活性成分之一，屬于黃酮類化合物，具有降壓、鎮(zhèn)靜、抗菌、消炎、解熱、抗病原體、抗癌、修復(fù)腦損傷、保肝利膽、改善糖尿病腎病等多種藥理作用[10]。近年來(lái)，黃芩苷在口腔醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究較多，尤其是治療牙周炎方面有明顯效果，黃芩苷可以有效的抑制 LPS 誘導(dǎo)的大鼠牙周炎牙槽骨的吸收，可以降低人牙周膜細(xì)胞表面RANKL/OPG比值等[11]。Guo A J等人報(bào)道，黃芩苷通過(guò)Wnt/β-catenin誘導(dǎo)成骨細(xì)胞的分化，增強(qiáng)OPG mRNA表達(dá)水平，直接參與破骨細(xì)胞的活性的調(diào)控[12]。黃芩苷在骨質(zhì)疏松癥預(yù)防與治療領(lǐng)域研究較少，由于黃芩苷可以調(diào)控RANKL/OPG表達(dá)，從理論上可以推測(cè)黃芩苷可以成為骨質(zhì)疏松癥的潛在藥物。最近，桂林源等人(2016年5月)發(fā)現(xiàn)，用黃芩提取物(以總黃酮含量計(jì)算)對(duì)雌性骨質(zhì)疏松模型SD大鼠進(jìn)行腹腔注射后，骨體積和骨小梁數(shù)目增加，促進(jìn)了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖和成骨分化，可以在一定程度上預(yù)防和治療雌激素缺乏所致的骨質(zhì)疏松[13]。

在人源RANKL/RANK信號(hào)通路中，黃芩苷與RANKL相互作用的研究尚無(wú)相關(guān)研究報(bào)道。為使傳統(tǒng)中藥黃芩在預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松方面具有更深入的研究，充分發(fā)揮其藥用價(jià)值，達(dá)到舊藥新用的目的，同時(shí)為體外研究人源RANKL的結(jié)構(gòu)提供依據(jù)。因此，挖掘黃芩有效成分新功能以及深入研究人源RANKL的結(jié)構(gòu)十分必要。本項(xiàng)研究采用熒光光譜法和分子模擬，研究黃芩苷與人源RANKL胞外結(jié)構(gòu)域相互作用的熒光猝滅，同時(shí)預(yù)測(cè)黃芩苷與RANKL/RANK復(fù)合物相互作用的活性位點(diǎn)，嘗試解釋兩者的作用機(jī)理，但黃芩苷是否抑制RANKL與RANK結(jié)合以及臨床效果需進(jìn)一步研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

載體和菌種：pGEX-6P-1和E.coli Rosseta(DE3)，由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 試劑與儀器

試劑：黃芩苷(黃石市藥品檢驗(yàn)所提供)；氨芐霉素(Amp)、異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)等購(gòu)自Amresco；1-苯胺基萘-8-磺酸(ANS)、苯甲基磺酰氟(PMSF)均購(gòu)自Sigma；Ni親和層析柱填料購(gòu)自GE。

實(shí)驗(yàn)中常見(jiàn)溶液的配制參見(jiàn)《分子克隆(第三版)》[14]。

儀器：熒光分光光度計(jì)F-4500(Hitachi,Japan)、XO-650超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(南京先歐生物科技有限公司)、HD-3紫外檢測(cè)儀(上海滬西分析儀器廠有限公司)、YC-1型電腦恒溫層析柜(北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)。

1.3 人源RANKL胞外結(jié)構(gòu)域的表達(dá)與純化

本實(shí)驗(yàn)室已將人源RANKL(141-317)號(hào)位氨基酸的活性區(qū)域重組至原核表達(dá)載體pGEX-6P-1，并通過(guò)表達(dá)菌株E.coliRosseta(DE3)進(jìn)行人源RANKL胞外結(jié)構(gòu)域(RANKL ectodomain,eRANKL)的誘導(dǎo)、表達(dá)與純化。操作過(guò)程中的具體條件參照文獻(xiàn)[15]。

1.4 黃芩苷與RANKL相互作用的熒光光譜法測(cè)定

1.4.1 黃芩苷工作液的配置

用DMSO作溶劑配置濃度為0.01 mol/L的黃芩苷母液，用0.01 mol/L PBS逐級(jí)稀釋得到0、2、4、6、8、10、20、40、60、80、100×10-5mol/L的工作液。保證每組中DMSO和PBS量一致，黃芩苷濃度為單一變量，配置體系見(jiàn)表1。

表1 黃芩苷濃度體系(1 mL)

1.4.2 內(nèi)源熒光的測(cè)定

調(diào)整RANKL濃度為22.56 μmol/L(A280=0.8)，采用表1中黃芩苷濃度梯度。固定反應(yīng)體系中RANKL蛋白濃度，增加黃芩苷用量，考察RANKL的熒光強(qiáng)度變化。反應(yīng)體系見(jiàn)表2。

表2 內(nèi)源熒光反應(yīng)體系

分別在10、20、30℃水浴30 min后，進(jìn)行熒光光譜掃描，激發(fā)光波長(zhǎng)295 nm，激發(fā)狹縫2.5 nm，發(fā)射狹縫5 nm，電壓700V，掃描速度1200 nm/min，記錄300～400 nm波段光譜數(shù)據(jù)。

1.4.3 外源熒光的測(cè)定

調(diào)整RANKL濃度為22.56 μmol/L(A280=0.8)，采用表1中黃芩苷濃度梯度。避光稱取ANS，蒸餾水溶解，離心(12000 r/min,5min)，避光取上清，立即使用。ANS濃度為蛋白50倍，按1:100加入蛋白溶液。反應(yīng)體系見(jiàn)表3。

30℃水浴避光反應(yīng)30min后，進(jìn)行熒光光譜掃描，激發(fā)光波長(zhǎng)380 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫均設(shè)為5 nm，電壓700V，掃描速度1200 nm/min，記錄400～600 nm波段光譜數(shù)據(jù)。

表3 ANS熒光反應(yīng)體系

1.5 黃芩苷與人源RANKL/OPG復(fù)合物的分子模擬

人源RANKL與人源OPG上4個(gè)半胱氨酸富集區(qū)(cysteine rich domain,CRD)結(jié)合所形成的復(fù)合體(RANKL /OPG-CDR)的3D晶體結(jié)構(gòu)是從PDB (http://www.pdb.org/,PDB ID: 3URF)中獲取。參照文獻(xiàn)[16]方法，在Sybyl-X 2.1.1中對(duì)蛋白和黃芩苷優(yōu)化，柔性對(duì)接。

2 結(jié)果和分析

2.1 RANKL表達(dá)與純化

M：Marker；0：上清；1：40 mmol/L；2：80 mmol/L；

由圖1看出，通過(guò)Ni親和層析在150 mmol/L和200 mmol/L洗脫下來(lái)的蛋白經(jīng)過(guò)SDS-PAGE的檢測(cè)，目標(biāo)蛋白約為21 KD，且均一性較高。

2.2 內(nèi)源熒光光譜

2.2.1 黃芩苷對(duì)RANKL內(nèi)源熒光的猝滅作用

在本實(shí)驗(yàn)條件下，熒光譜340 nm處有一熒光發(fā)射峰，不同溫度下的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖(a)、(b)、(c)分別表示在10℃、20℃以及30℃溫度下，黃芩苷對(duì)RANKL作用，RANKL濃度為22.56 μmol/L，1～10分別代表表1中黃芩苷的濃度梯度。內(nèi)插圖中“▲”表示最大熒光發(fā)射峰強(qiáng)度，“●”表示最大熒光發(fā)射峰強(qiáng)度對(duì)應(yīng)的發(fā)射波長(zhǎng)

圖2 三種溫度下黃芩苷與RANKL相互作用的內(nèi)源熒光圖譜

由圖2可以看出，隨著黃芩苷濃度增加，RANKL熒光發(fā)射峰強(qiáng)度減弱，發(fā)射波長(zhǎng)明顯紅移，說(shuō)明黃芩苷使RANKL內(nèi)部生色基團(tuán)所處微環(huán)境的極性增大，RANKL構(gòu)象發(fā)生變化。

2.3 外源熒光圖譜

ANS通過(guò)非共價(jià)結(jié)合蛋白分子的非極性區(qū)域中，其熒光光譜會(huì)隨著非極性的增加而發(fā)生藍(lán)移，且熒光強(qiáng)度也會(huì)隨之提高。30℃下，黃芩苷與RANKL相互作用的ANS熒光見(jiàn)圖3。

RANKL濃度為22.56 μmol/L，1～12分別代表表1中黃芩苷的

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著黃芩苷濃度的增加，蛋白ANS熒光峰強(qiáng)度先逐漸增加后逐漸下降，在8×10-5mol/L時(shí)達(dá)到峰值。說(shuō)明RANKL疏水面暴露程度先增大后減小，在8×10-5mol/L時(shí)，疏水面暴露程度最大。

2.4 黃芩苷與人源RANKL/OPG復(fù)合物的分子模擬

Xudong Luan等人發(fā)表的人源RANKL結(jié)構(gòu)域與OPG中4個(gè)半胱氨酸富集區(qū)所形成的晶體結(jié)構(gòu)用于與黃芩苷分子對(duì)接，其中OPG中4個(gè)半胱氨酸的富集區(qū)(OPD-CRD)與人源RANK胞外結(jié)構(gòu)域中4個(gè)半胱氨酸的富集區(qū)(RANK-CRD)序列相同[17]，這也是OPG能作為RANKL誘騙受體的主要原因。分子對(duì)接全局和局部情況見(jiàn)圖4，作用位點(diǎn)信息見(jiàn)表4。

(a)全局圖展示了黃芩苷在RANKL/OPG-CRD復(fù)合物中的具體位置；(b)局部圖顯示了黃芩苷分別在RANKL和OPG-CRD分別作用的氨基酸位點(diǎn)，黃色虛線表示氫鍵，黃色數(shù)字表示氫鍵鍵長(zhǎng)，藍(lán)色β-折疊帶來(lái)自RANKL，綠色β-折疊帶來(lái)自O(shè)PG-CRD。

圖4 黃芩苷與人源RANKL/OPG-CRD復(fù)合物分子對(duì)接

黃芩苷與人源RANKL/OPG-CRD復(fù)合物分子對(duì)接的總得分為7.638，屬于高分，兩者作用的氫鍵有9個(gè)，表明黃芩苷與RANKL/OPG-CRD間氫鍵相互作用力較強(qiáng)，結(jié)合緊密。從對(duì)接的全局圖來(lái)看，黃芩苷恰好被復(fù)合物內(nèi)部中心空腔包裹。從局部圖來(lái)看具體作用的氨基酸位點(diǎn)，很可能是黃芩苷發(fā)揮作用的位點(diǎn)。分子模擬結(jié)果為黃芩苷阻止RANKL/RANK復(fù)合物形成的機(jī)制提供理論依據(jù)。

3 結(jié)論

我們通過(guò)研究黃芩苷影響RANKL胞外結(jié)構(gòu)域的聚集狀態(tài)，進(jìn)而影響RANKL/RANK通路的形成。熒光光譜學(xué)數(shù)據(jù)表明：在體外，黃芩苷對(duì)RANKL內(nèi)源熒光強(qiáng)度的減弱均呈劑量依賴關(guān)系，黃芩苷對(duì)RANKL的內(nèi)源熒光有明顯的猝滅作用，黃芩苷使RANKL內(nèi)部生色基團(tuán)所處微環(huán)境的極性增大；蛋白ANS熒光峰強(qiáng)度與黃芩苷濃度并無(wú)劑量依賴關(guān)系，而是先增加后降低，在8×10-5mol/L時(shí)達(dá)到峰值，說(shuō)明RANKL疏水面暴露程度可能先增大后減小，在8×10-5mol/L時(shí)，疏水面暴露程度最大。分子模擬結(jié)果顯示，黃芩苷與人源RANKL/OPG-CRD復(fù)合物之間有較強(qiáng)的相互作用，且位于該復(fù)合物中心內(nèi)部空腔，說(shuō)明兩者結(jié)合緊密，預(yù)測(cè)了兩者相互作用的氨基酸位點(diǎn)。推測(cè)黃芩苷可能有利于阻止RANKL-RANK復(fù)合物的形成，但在體外還需要通過(guò)等溫滴定量熱法進(jìn)一步證明。黃芩苷在細(xì)胞水平和動(dòng)物水平是否有效還需進(jìn)一步深入研究，同時(shí)可以結(jié)合結(jié)構(gòu)生物學(xué)方法準(zhǔn)確地找出兩者結(jié)合的具體位置以及開展動(dòng)物學(xué)實(shí)驗(yàn)。

綜上所述，在體外黃芩苷能影響RANKL的結(jié)構(gòu)變化，可能影響RANKL與RANK的結(jié)合，從而可能阻止RANKL/RANK信號(hào)通路的開啟，達(dá)到間接治療骨質(zhì)疏松和抗癌藥效。因此，黃芩苷可能成為骨質(zhì)疏松、乳腺癌等疾病的潛在藥物。

[1] Willard D,Chen W J,Barrett G,et al. Expression,purification,and characterization of the human receptor activator of NF-kB ligand(RANKL) extracellular domain[J]. Protein Expr Purif,2000,20:48-57.

[2] Ta H M,Nguyen G T,Nguyen G T,et al. Structure-based development of a receptor activator of nuclear factor-κB ligand (RANKL) inhibitor peptide and molecular basis for osteopetrosis[J]. Proc Natl Acad Sci USA,2010,107:20281-20286.

[3] Simonet W S,Lacey D L,Dunstan C R,et al. Osteoprotegerin: A novel secreted protein involved in the regulation of bone density[J]. Cell,1997,89:309-319.

[4] Yasuda H,Shima N,Nakagawa N,et al. Identity of osteoclastogenesis inhibitory factor (OCIF) and osteoprotegerin (OPG): A mechanism by which OPG/OCIF inhibits osteoclastogenesis in vitro[J]. Endocrinology,1998,139:1329-1337.

[5] Tanaka S,Nakamura K,Takahasi N,et al. Role of RANKL in physiological and pathological bone resorption and therapeutics targeting the RANKL-RANK signaling system[J]. Immunol Rev,2005,208:30-49.

[6] Vega D,Maalouf N M,Sakhaee K. CLINICAL Review: The role of receptor activator of nuclear factor-kappaB (RANK)/RANK ligand/osteoprotegerin: clinical implications[J].J Clin Endocrinol Metab,2007,92:4514-4521.

[7] Theoleyre S,Wittrant Y,Tat S K,et al. The molecular triad OPG/RANK/RANKL: Involvement in the orchestration of pathophysiological bone remodeling[J]. Cytokine Growth Factor Rev,2004,15:457-475.

[8] Wright H L,McCarthy H S,Middleton J,et al. RANK,RANKL and osteoprotegerin in bone biology and disease[J]. Curr Rev Musculoskelet Med,2009,2:56-64. [9] Hur J,Ghosh A,Kim K,et al. Design of a RANK-mimetic peptide inhibitor of osteoclastogenesis with enhanced RANKL-binding affinity[J]. Mol Cells,2016,39:316-321.

[10] 歐陽(yáng)俊杰. 黃芩苷及其衍生物抗病原體作用研究新進(jìn)展[J]. 宜春學(xué)院學(xué)報(bào)，2015，37:28-30.

[11] 陳 悅.黃芩苷抑制牙周炎牙槽骨吸收的作用及機(jī)理研究[D].西安：第四軍醫(yī)大學(xué)，2008.

[12] Guo A J,Choi R C,Cheung A W,et al. Baicalin,a flavone,induces the differentiation of cultured osteoblasts[J]. J Biol Chem,2011,286:27882-27893.

[13] 桂林源，劉世宇，邱新毓，等. 黃芩小分子化合物對(duì)雌激素缺乏骨質(zhì)疏松的預(yù)防和治療作用[J].牙體牙髓牙周病學(xué)雜志,2016,26(5):294-300.

[14] 莎姆布魯克 J,拉塞爾 D W.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南[M].3版.黃培堂,譯.北京：科學(xué)出版社，2002.

[15] 習(xí)雪麗. 生物活性多糖及黃酮類化合物與人源RANKL胞外結(jié)構(gòu)域相互作用的研究[D].黃石：湖北師范大學(xué)，2014.

[16] Mi R,Li P Q,Hu Y J,et al. Biophysical studies on the interactions of jatrorrhizine with bovine serum albumin by spectroscopic and molecular modeling methods[J]. Mol Biol Rep,2013,40:4397-4404.

[17] Luan X,Lu Q,Jiang Y,et al. Crystal structure of human RANKL complexed with its decoy receptor osteoprotegerin[J]. J Immunol,2012,189:245-252.

(本文文獻(xiàn)格式：陳相如，汪勁松，王衛(wèi)東，等.黃芩苷與人源RANKL胞外結(jié)構(gòu)域相互作用的研究[J].山東化工,2017,46(7):56-60.)

The Study of the Interaction Between Baicalin and Human RANKL Ectodomain

ChenXiangru1,2,WangJinsong1,2,WangWeidong1,2,ZhangXinchao1,2,PanJicheng1,2*

(1.College of Life Science, Hubei Normal University; Huangshi 435002,China; 2.Hubei Key Laboratory of Edible Wild Plants Conservation and Utilization, Huangshi 435002,China)

RANKL (receptor activator of NF-kappa B ligand), steming from osteoblast, play an important role in the osteoclast differentiation and activation. RANKL can bind osteoclast surface receptor RANK(receptor activator of NF-kappa B), and OPG (osteoprotegerin), as decoy receptor,competitively combine with RANKL,which they jointly regulate the bone balance. The RANKL/RANK/OPG dysregulation causes the imbalance between bone formation and resorption,which results in bone metabolic diseases,such as osteoporosis,arthrophlogosis,et al. Baicalin,a kind of flavonoid extracted from Scutellaria baicalensis Georigi―a traditional Chinese medicine,are widely applied in the field of medicine. Fluorescence spectral measurements data showed that with the baicalin’s concentration increasing,accompanied with the fluorescence emission intensity dropping,the emission wavelength red-shift occurred. Further,ANS fluorescence data also showed that baicalin could result emission intensity obvious change. Thus,combined with intrinsic and ANS fluorescence evidences,and an conclusion seemed to be drawn that baicalin could cause RANKL’s conformational change. The results of molecular simulation revealed the existence of combination between baicalin and human RANKL/OPG-CRD (cysteine rich domain) ,which located in the inner cavity of RANKL/OPG-CRD compound,and predict the concrete amino acid residue sites of the stronger binding. The study of the interaction between baicalin and human RANKL carry important implication on the demonstration of the dysregulation of bone metabolism and the anticancer mechanism.

RANKL/RANK/OPG;baicalin;fluorescence spectral measurements;molecular simulation

2017-02-20

陳相如(1990—)，男，湖北武穴人，碩士研究生，研究方向：蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能；通訊作者：潘繼承，教授。

TQ461

A

1008-021X(2017)07-0056-05