楊 丹，徐元芬，張 馳，2*

(湖北民族學(xué)院 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 恩施 445000； 2. 湖北民族學(xué)院 生物資源保護與利用湖北省重點實驗室，湖北 恩施 445000)

正交試驗優(yōu)化板栗中硒蛋白的提取工藝

楊 丹1，徐元芬1，張 馳1，2*

(湖北民族學(xué)院 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 恩施 445000； 2. 湖北民族學(xué)院 生物資源保護與利用湖北省重點實驗室，湖北 恩施 445000)

本實驗優(yōu)選恩施市富硒板栗，采用磷酸鹽緩沖液浸提法提取硒蛋白，正交試驗法優(yōu)化板栗硒蛋白的提取條件，采用考馬斯亮藍G-250試劑結(jié)合法測定蛋白含量，原子熒光法測定硒含量。結(jié)果表明，影響富硒板栗含硒蛋白提取率的主次因素為:pH值>料液比>提取時間>提取溫度，富硒板栗中含硒蛋白提取的最佳工藝條件是:pH值 8.2，提取溫度50℃，提取時間1 h，料液比1∶55。富硒板栗干粉中的總硒含量為2.79μg/g，富硒板栗蛋白粉中的硒含量為5.125μg/g。本研究旨在為恩施富硒板栗的精深加工和綜合利用奠定了理論和技術(shù)基礎(chǔ)。

板栗；硒蛋白；提取分離；抗氧化活性

20世紀50年代，伴隨著各種現(xiàn)代合成技術(shù)的出現(xiàn)，尤其是硒作為哺乳動物(包括人類)的必需微量元素地位的確立，關(guān)于硒的有機化學(xué)得到蓬勃發(fā)展，硒的營養(yǎng)作用也成為人們研究的熱點。已有文獻報道，癌癥、心血管疾病、克山病、白內(nèi)障、肌肉萎縮癥等40多種疾病的發(fā)病率與缺硒密切相關(guān)[1]。硒具有很強的抗氧化及抗衰老作用。在防癌抗癌、預(yù)防和治療心血管疾病、克山病及大骨節(jié)病等方面的重要作用已為世人所公認[2]。硒還具有解除重金屬中毒等特殊的生理功能[3-4]。全世界有四十多個國家和地區(qū)屬于缺硒地區(qū)。中國是一個缺硒的大國，根據(jù)《中華人民共和國地方疾病與環(huán)境因素圖集》揭示，從東北三省起，斜穿至云貴高原地區(qū)，存在一條低硒地帶，占據(jù)中國國土面積高達72%的地區(qū)，而30%為嚴重缺硒地區(qū)[5-6]。

糧食作物等天然食物的硒含量較低[7]，目前人們正廣泛應(yīng)用微生物和動植物作為硒的生物有機化載體來進行富硒功能性食品研究開發(fā)，如富硒大米、富硒茶、富硒雞蛋等[8-10]。這些都是使用簡單的富集方法，生產(chǎn)出來的產(chǎn)品硒含量不高，產(chǎn)品技術(shù)含量低，滿足不了人們對于富硒產(chǎn)品的需求。因此，利用高新技術(shù)對富硒食品進行深加工以及富硒食品的生產(chǎn)將會是今后的發(fā)展方向。板栗(學(xué)名:Castanea mollissimain )，是殼斗科栗屬的植物，原產(chǎn)于中國，與棗桃杏李同為我國古代五大名果之一，也是世界上著名的干果樹種，生長于海拔370～2800 m的地區(qū)，多見于山地，已由人工廣泛栽培，國外稱之為“健康食品”，是健胃補腎、延年益壽的上等果品[11-12]。板栗易貯藏保鮮，可以延長市場的供應(yīng)時間。本研究以當(dāng)前硒蛋白研究的現(xiàn)狀為出發(fā)點，在查閱相關(guān)文獻的基礎(chǔ)上，結(jié)合前人的大量的研究經(jīng)驗，以恩施高硒區(qū)的板栗為研究對象，旨在通過單因素和正交試驗，探討板栗中硒蛋白的最佳提取工藝，在此基礎(chǔ)上，對硒蛋白的生物活性，主要是對硒蛋白的抗氧化性做一定程度的研究。為恩施硒資源的開發(fā)利用提供理論支持和應(yīng)用基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 原料及儀器

富硒板栗來自恩施土家族苗族自治州沙地產(chǎn)的板栗，取板栗干粉為實驗原料。

試驗使用試劑見表1。

表1 試劑

試驗使用儀器見表2。

表2 設(shè)備

1.2 方法與步驟

1.2.1 板栗粉的制備及硒含量測定

富硒板栗→60℃烘干→粉碎→80目過篩→板栗標準粉。

參照文獻[13-14]采用微波消解、原子熒光光度計測定樣品中硒含量，三組平行實驗。

1.2.2 蛋白質(zhì)含量測定方法

蛋白含量的測定采用考馬斯亮藍G-250試劑結(jié)合法[15]。722型分光光度計595nm處測定吸光度值，繪制標準曲線。

1.2.3 單因素試驗

1.2.3.1 pH值大小對硒蛋白提取得率的影響

精確稱取樣品0.20 g于4個50mL小燒杯中，按料液比1∶40向小燒杯中加入不同pH值大小的0.05 mol/L的PBS磷酸緩沖液，pH值分別為6.3、7.3、8.2、9.1，置于40℃水浴鍋中，提取1 h，然后3000 r/min離心分離10min。取上清液加入兩倍體積過飽和硫酸銨溶液鹽析過夜,離心取沉淀(7000r/min，10min)溶于磷酸鹽中定容至25 mL容量瓶中，采用考馬斯亮藍G-250試劑結(jié)合法測得吸光度值。各pH值條件下通過4次平行實驗來考察pH值大小對板栗蛋白得率的影響。

1.2.3.2 提取溫度對硒蛋白提取得率的影響

分別準確稱取板栗樣品0.20g于4個50 mL小燒杯中，按料液比1∶40向小燒杯中各加入0.05 mol/L的PBS磷酸鹽緩沖液(pH值=8.2)8 mL，溫度分別控制在40、50、70、90℃，置于電熱恒溫水浴鍋中，提取1h，然后3000 r/min離心10min，取上清液加入兩倍體積過飽和硫酸銨溶液鹽析過夜,離心取沉淀(7000 r/min，10min)溶于磷酸鹽中定容至25mL容量瓶中，采用考馬斯亮藍G-250試劑結(jié)合法測得吸光度值。各溫度水平通過4次平行實驗來考察溫度對板栗蛋白得率的影響。

1.2.3.3 提取時間對硒蛋白提取得率的影響

分別準確稱取板栗樣品0.20 g于4個50 mL小燒杯中，按料液比1∶40向小燒杯中各加入0.05 mol/L的PBS磷酸鹽緩沖液(pH值=8.2)8 mL，置于40℃水浴鍋中，分別提取30、60、90、120min，然后3000 r/min離心分離10min。取上清液加入兩倍體積過飽和硫酸銨溶液鹽析過夜,離心取沉淀(7000r/min，10min)溶于磷酸鹽中定容至25mL容量瓶中，采用考馬斯亮藍G-250試劑結(jié)合法測得吸光度值。各提取時間水平通過4次平行實驗來考察溫度對板栗蛋白得率的影響。

1.2.3.4 料液比對硒蛋白提取得率的影響

精確稱取樣品0.20 g于4個50 mL小燒杯中，分別按料液比1∶10、1∶25、1∶40、1∶55向小燒杯中加入0.05 mol/L的PBS磷酸緩沖液(pH值=8.2)，置于40 ℃水浴鍋中，提取1 h，然后3000 r/min離心分離10min。取上清液加入兩倍體積過飽和硫酸銨溶液鹽析過夜,離心取沉淀(7000r/min，10min)溶于磷酸鹽中定容至 25 mL容量瓶中，采用考馬斯亮藍G-250試劑結(jié)合法測得吸光度值。各料液比條件下通過4次平行實驗來考察溫度對板栗蛋白得率的影響。

1.2.4 正交實驗

采用正交試驗優(yōu)化提取工藝條件，根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選擇合適的提取溫度、提取時間和料液比水平，進行四因素四水平的正交試驗設(shè)計，每個因素水平組合試驗重復(fù)4次，見表3。

表3 正交試驗因素水平表

1.2.5 板栗中硒蛋白的制備

稱取板栗粉10 g→最優(yōu)條件提取，離心取上清液(3000r/min，10min)→加入兩倍體積過飽和硫酸銨溶液鹽析過夜→離心取沉淀(7000r/min，10min)→溶于磷酸鹽中→室溫下透析4天，除去小分子雜質(zhì)→透析液→蛋白質(zhì)沉淀→真空干燥→板栗含硒蛋白樣品。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白質(zhì)標準曲線

圖1 蛋白質(zhì)標準曲線

2.2 單因素試驗結(jié)果

2.2.1 pH值大小對板栗蛋白質(zhì)提取率的影響

圖2 提取pH值對蛋白提取得率的影響

由圖2可知，提取pH值在6.3～7.3范圍內(nèi)，板栗蛋白提取率持續(xù)增大，且增幅較大；pH值在7.3～8.2范圍內(nèi)，板栗蛋白提取率仍有所增加，但增幅減緩；pH值為8.2時，蛋白提取率達到最高。8.2～9.1變化較平穩(wěn)。因此，實驗中板栗蛋白最佳提取pH值為8.2。

2.2.2 提取溫度對板栗蛋白質(zhì)提取率的影響

圖3 提取溫度對蛋白提取率的影響

由圖3可知，提取溫度在40～50℃范圍內(nèi)，板栗蛋白提取率持續(xù)增大，且增幅較大，50℃時，蛋白提取率達到最高。溫度在50～70℃范圍內(nèi)，板栗蛋白提取率急劇減小。溫度為70℃以后，由于溫度過高，蛋白質(zhì)被破壞，板栗蛋白提取率一直下降。因此，實驗中板栗蛋白最佳提取溫度為50℃。

2.2.3 提取時間對板栗蛋白質(zhì)提取率的影響

分別按30、60、90、120min處理板栗樣品，最終得到板栗蛋白提取率結(jié)果如圖4所示。

圖4 提取時間對蛋白提取率的影響

由圖4可知，隨著提取時間的延長，板栗蛋白的提取率逐漸升高再下降。60～90min的時間內(nèi)板栗蛋白提取率增幅較大；當(dāng)提取時間達到90min時，板栗蛋白提取率達到最大。90min以后，由于板栗蛋白提取率出現(xiàn)下降。因此，此實驗中板栗蛋白的最佳提取時間為90min。

2.2.4 料液比對板栗蛋白質(zhì)提取率的影響

分別按料液比1∶10、1∶25、1∶40、1∶55處理板栗樣品時，得到板栗蛋白的提取率如圖5所示。

圖5 提取料液比對蛋白提取率的影響

由圖5可知，料液比由1∶10增到1∶25時，板栗蛋白提取率增幅最大。當(dāng)料液比達到1∶25時，蛋白提取率開始下降。因此，最佳提取料液比是1∶25。

2.3 正交試驗結(jié)果

2.3.1 正交試驗結(jié)果數(shù)據(jù)

見表4。

表4 富硒板栗中硒蛋白提取條件正交試驗結(jié)果

2.3.2 正交試驗結(jié)果分析

使用SPSS統(tǒng)計軟件對正交實驗的結(jié)果進行方差分析，并得出各因素的估算邊際均值。設(shè)因變量為蛋白提取率，固定因子分別為A(提取pH值)、B(提取溫度)、C(提取時)、D(料液比)，軟件輸出的分析結(jié)果如表5所示。

表5 方差分析

由表5可知，矯正模型的的顯著水平為0.01，表明模型有極好的顯著性。因素A 顯著水平小于0.01，表明提取pH值對富硒板栗含硒蛋白提取率有極顯著影響。因素B、C、D顯著水平大于0.05，表明提取溫度、時間、料液比對富硒板栗含硒蛋白提取率沒有顯著影響。把因變量設(shè)為板栗蛋白的提取率，得到各因素的估算邊際均值結(jié)果如表6。

由表6可知，因素A(提取pH值)各水平的邊際均值大小為：8.2>9.1>6.3>7.2，所以選取的最佳提取pH值為8.2。

表6 pH值大小的邊際均值分析表

表7 溫度的邊際均值分析表

由表7可知，因素A(提取溫度)各水平的邊際均值大小為：50℃>70℃>90℃> 40℃，所以選取的最佳提取溫度為50℃。

表8 時間的邊際均值分析表

由表8可知，因素C提取時間各水平的邊際均值大小為:60min>30min>120min> 90min，所以本試驗選取的最佳提取時間為60min。

表9 料液比的邊際均值分析表

由表9可知，因素D料液比的各個水平的均值比較結(jié)果為：1∶55>1∶40>1∶10> 1∶25，所以選取的最佳提取料液比為1∶55。

綜上所述，富硒板栗硒蛋白提取的最佳工藝條件組合為 A3B2C2D4，即提取pH值8.2，提取溫度50℃，提取時間60min，提取料液比1∶55。

2.4 樣品硒含量結(jié)果

通過計算后得板栗粉硒含量為2.79μg/g，板栗中硒蛋白硒含量為5.125μg/g。

3 結(jié)論與討論

根據(jù)本實驗研究可知，影響富硒板栗硒蛋白提取率的主次因素為:pH值大小>料液比>提取時間>提取溫度，富硒板栗中含硒蛋白提取的最佳工藝條件是:pH值8.2，提取溫度50℃，提取時間1 h，料液比1∶55。本實驗所采用的恩施地區(qū)富硒板栗的硒含量比較高，富硒板栗干粉中的總硒含量為2.79μg/g，富硒板栗蛋白粉中的硒含量為5.125μg/g，表明板栗的富硒能力還比較好。中國營養(yǎng)學(xué)會推薦，成年人硒的日攝入量為50～250μg，該板栗適合作為硒攝入不足的人群的補硒劑。根據(jù)推薦可每天攝入17.9～89.6g板栗干粉，或者9.8～48.8g板栗蛋白粉。作為世界硒都的恩施，板栗資源十分豐富，研究高硒區(qū)生產(chǎn)的板栗硒蛋白的含量及提取分離純化方法，將對豐富板栗資源的開發(fā)利用開辟新的思路，以及可以作為開發(fā)形式更加豐富、經(jīng)濟效應(yīng)更好硒源食品的基礎(chǔ)。

[1] 吳永堯,彭振坤.硒的多重生物學(xué)功能與人和動物的健康[J].湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,1997,23(3):294-300.

[2] 羅世煒,史麗英,吳永堯.植物硒研究進展[J].生物學(xué)教學(xué),2008,33(1):2-3.

[3] Gupta U C,Gupta S C.Selenium in soil and crops,its defici encies in livestock and human implications for management[J].Commun Soil Sci Plant Anal,2000,31:1791-1807.

[4] Rayman M P.The importance of selenium tohuman health[J].Lancet,2000,356:233 -241.

[5] 于 振. 陜西漢陰富硒地區(qū)主要農(nóng)作物硒富集能力及其農(nóng)產(chǎn)品中硒賦存形態(tài)和分布規(guī)律研究[D].西安：陜西師范大學(xué),2013.

[6] 高 婧. 中國典型高硒與硒缺乏區(qū)硒營養(yǎng)攝入規(guī)律研究[D].北京：中國科學(xué)技術(shù)大學(xué),2010.

[7] 況 沖，郭曉玲，張永忠，等.富硒大豆蛋白的研制[J].食品工業(yè)科技,2008(6):192-194.

[8] 王慶華,黃 偉,李前勇,等. 中國富硒食品的生產(chǎn)現(xiàn)狀及趨勢[J]. 廣東微量元素科學(xué),2008(3):7-10.

[9] 溫立香,郭雅玲. 富硒茶的研究進展[J]. 熱帶作物學(xué)報,2013(1):201-206.

[10] 張現(xiàn)偉,鄭家奎,張 濤,等. 富硒水稻的研究意義與進展[J].雜交水稻,2009(2):5-9.

[11] 肖佩明,任延碌.集安市在退耕還林中發(fā)展板栗產(chǎn)業(yè)的必要性[J].中國園藝文摘,2010,26(8):66-67.

[12] 龐文淥.板栗食用價值與加工技術(shù)[J]. 中國食物與營養(yǎng),2003(11):48-49.

[13] 張修景. 微波消解-氣相色譜法測定羅漢參中硒的含量[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2014(1):198-201.

[14] 盧 麗,韋曉群,劉二龍,等. 微波消解-氫化物發(fā)生原子熒光光譜法測定嬰兒配方乳粉中硒含量[J]. 食品科學(xué),2014(20):208-212.

[15] 李 娟，張耀庭，曾 偉，等.應(yīng)用考馬斯亮藍法測定蛋白含量[J].中國生物制品學(xué)雜志,2000,13(2):118-120.

(本文文獻格式：楊 丹，徐元芬，張 馳.正交試驗優(yōu)化板栗中硒蛋白的提取工藝[J].山東化工,2017,46(7):10-14.)

Optimization of Extraction of Selenoprotein from Castanea Mollissimain by Orthogonal Test

YangDan1,XuYuanfen1,ZhangChi1,2*

(1．School of Biological Science and Technology，Hubei Minzu University, Enshi 445000，China; 2．Key Laboratory of Biologic Resources Protection and Utilization of Hubei Province，Hubei Minzu University，Enshi 445000，China)

Enshi Selenium-enriched chestnut was used as materials to extract selenoprotein by phosphate buffer extraction method and to optimize the extraction process of selenoproteins by using the orthogonal experiment. Proteins and selenium content was measured by coomassie brilliant blue G-250 reagent and AFS (atomic fluorescence spectrometry) respectively.Results showed that the factors affecting extraction rate was as follows: pH> ratio of solid-liquid>extraction time>extraction temperature.The optimum extraction conditions of selenoprotein from chestnuts were pH 8.2,extraction temperature 50℃,extraction time 1 hour and the ratio of solid-liquid 1∶55.The selenium content in Selenium-rich chestnut powder and Selenium-rich chestnut protein powder was 2.79 μg/g and 5.125 μg/g respectively.The aim of this study was to lay a theoretical and technical foundation for the intensive processing and comprehensive utilization of Se-enriched chestnut.

Castanea mollissimai；selenoprotein；extraction method

2016-12-25

國家自然科學(xué)基金項目(21461009)；湖北省科技廳重點基金項目(2011CDA011)；湖北省大學(xué)科技創(chuàng)新項目(201610517019)；2016年湖北省食品科學(xué)與工程省級實習(xí)基地建設(shè)項目

楊 丹(1990—)，女，本科，研究方向為食品化學(xué)；通信作者：張 馳(1965—)，男，教授，主要從事植物生物化學(xué)及硒資源研究。

O657.31

A

1008-021X(2017)07-0010-05