朱天輝,彭嬌洋,劉 倩,賀敬宣,馬欣欣，黃祖惠,吳繼云,張 霞

(1.四川農(nóng)業(yè)大學,四川 溫江 611130;2.大邑縣農(nóng)林局,四川 大邑 611330)

萊氏野村菌復合粉炮防治杜仲夢尼夜蛾試驗研究

朱天輝1,彭嬌洋1,劉 倩1,賀敬宣1,馬欣欣1，黃祖惠2,吳繼云2,張 霞2

(1.四川農(nóng)業(yè)大學,四川 溫江 611130;2.大邑縣農(nóng)林局,四川 大邑 611330)

夢尼夜蛾是危害杜仲的重要食葉害蟲，本文以成都市大邑縣杜仲人工種植林為試驗基地，采集罹病的杜仲夢尼夜蛾僵蟲，分離獲得10株4種生長良好的純菌種，表型特征、顯微形態(tài)結(jié)合分子生物學檢測該4種天敵微生物分別為：桔青霉，產(chǎn)黃青霉，球孢白僵菌(次優(yōu)勢菌)，萊氏野村菌(優(yōu)勢菌株)。經(jīng)室內(nèi)幼蟲毒力比較試驗證明萊氏野村菌強于球孢白僵菌，電子顯微鏡下可觀察到該菌在幼蟲表皮下生長，二者可望作為林間無公害防治杜仲夢尼夜蛾的原型生防菌株。將萊氏野村菌與球孢白僵菌制成復合粉炮在林間施用333.33 hm2，一般在1周后開始產(chǎn)生防治效果(蟲口減退率：70%)，隨著時間增加，生防菌不斷繁殖，防效可持續(xù)提高，穩(wěn)定在85.1%～90%間，示范區(qū)與試驗區(qū)趨勢一致，粉炮施用后每半月收集的僵蟲可分離到萊氏野村菌、球孢白僵菌，說明兩菌能有效在幼蟲上定殖。

杜仲夢尼夜蛾；白僵菌；萊氏野村菌；生物防治

杜仲(學名EucommiaulmoidesOliver)，為杜仲科植物，多年生落葉喬木，為我國特有藥用植物，其應用涵蓋醫(yī)藥、保健食品、特種工業(yè)、木材加工、環(huán)境保護等方面。杜仲具有較高的醫(yī)療保健價值和經(jīng)濟價值，市場前景看好。但近年來一種專門取食杜仲嫩葉的杜仲夢尼夜蛾為害[1]，大大降低了杜仲的質(zhì)量和產(chǎn)量，成為影響杜仲發(fā)展的又一要素，曾采用化學藥物防治該蟲[2]，但易造成環(huán)境污染。為科學、生態(tài)、綠色防控杜仲夢尼夜蛾危害，在2015年～2016年發(fā)現(xiàn)大邑杜仲林間蟲生真菌自然感染夢尼夜蛾基礎(chǔ)上，開展了萊氏野村菌、白僵菌分離純化、毒力測定研究及復合粉炮用于杜仲夢尼夜蛾的防控試驗，取得了較好成效，能將其危害控制在經(jīng)濟閾值以內(nèi)。

1 材料與方法

1.1 蟲生真菌樣品采集

在四川省大邑縣斜源鎮(zhèn)杜仲種植基地，將杜仲林區(qū)按蟲害發(fā)生程度劃分為重、中、輕、無4個區(qū)。從每個林區(qū)隨機選擇3株杜仲在樹干及樹根周圍獲取自然感染蟲尸(因樹冠較高，取樣不便，且被真菌浸染死亡的蟲體無法攀附樹葉，死亡的蟲尸大都墜落地表，故未從樹葉上取樣)，蟲體僵硬、包被菌絲體，用培養(yǎng)皿分裝標記好帶回實驗室分離。未能及時分離的樣本放入0℃的冰箱保存。

1.2分離方法

(1)在超凈工作臺中，將感染真菌但體表未長霉層的僵蟲用蒸餾水沖洗干凈后，75%酒精侵3 s～5 s， 5%NaClO消毒 3 min～5 min, 滅菌水沖洗3次，吸水紙吸干表面；用滅菌刀將蟲體切成50 mm小塊，置于PDA培養(yǎng)基上，重復3次，25℃，培養(yǎng)5 d～7 d，用接種針挑取蟲體或培養(yǎng)基上長出的菌絲，轉(zhuǎn)接到SDAY培養(yǎng)基上，培養(yǎng)10 d后觀察菌落生長和產(chǎn)孢情況。

(2)將體表長有霉層的僵蟲放置于培養(yǎng)皿中，用接種環(huán)輕輕挑取蟲體表面的孢子粉在PDA上劃線接種培養(yǎng)，重復3次。待長出菌落后挑取菌絲轉(zhuǎn)接到SDAY培養(yǎng)基上，25℃下培養(yǎng)培養(yǎng)，觀察菌落生長和產(chǎn)孢情況。

1.3 蟲生真菌分子生物學檢測

1.3.1 菌絲收集與DNA提取

將純化后菌株轉(zhuǎn)接鋪有玻璃紙的SDAY培養(yǎng)基表面，25℃下培養(yǎng)7 d～10 d，刮取表面菌絲，冷凍干燥后備用。稱取100 mg左右的菌絲，用液氮迅速研磨成粉末，按照天根植物基因組DNA提取試劑盒說明書提取基因組DNA。

1.3.2 PCR擴增

采用真菌通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)/ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)，擴增包含 ITS1-5.8 S-ITS2 全部序列和部分18 S 以及28 S rDNA在內(nèi)的ITS片段，引物由上海生工合成。

25 μL的擴增體系，其中2.5 μL 10×PCR buffer，10 μmol/L的引物ITS1/ITS4各0.8 μL，2.5 mmol·L-1的dNTP 2 μL，25 mmol/L的MgCl22 μL，5 U·μL-1TaqDNA聚合酶0.2 μL，DNA提取液1 μL，加滅菌雙蒸水補足25 μL。以ddH2O代替模板DNA設置陰性對照。擴增程序：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性40 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，共35個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。反應結(jié)束后，取5 μL PCR產(chǎn)物在1 %的瓊脂糖凝膠中電泳檢測，100 V電泳30 min，在凝膠成像系統(tǒng)上拍照并觀察。

1.3.3 產(chǎn)物測序與序列比對分析

PCR產(chǎn)物純化后交由上海生工進行雙向測序，用DNAStar-SeqMan軟件對測序結(jié)果進行拼接整合。將菌株的ITS序列與GenBank核酸數(shù)據(jù)庫中相關(guān)菌株進行同源性比較，從GenBank上下載真菌菌屬相關(guān)的ITS序列，并用MEGA5.0軟件進行同源性分析，用Clustal W算法進行聚類分析，ITS序列相似性大于95%小于99%，鑒定為相同屬，小于等于95%，鑒定為同科，以白僵菌(Beauveriabassiana)外群，構(gòu)建蟲生真菌的系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 蟲生真菌的致病力比較

選取健康的各齡期及蟲態(tài)的杜仲夢尼夜蛾，采用浸蘸法用上述分離純化獲得的真菌分別對其進行感染，觀察發(fā)病癥狀，比較分析蟲生真菌的致病力。

取感染萊氏野村菌12 h以內(nèi)的蟲體，在超凈工作臺內(nèi)，先刮取蟲體表皮，小心祛除表皮上脂肪和其他雜質(zhì)，刮至表皮呈半透明狀即可，將表皮置于載玻片上，滴1滴無菌水，蓋上蓋玻片，將做好的載玻片放置于電子顯微鏡下觀察，觀察菌絲在杜仲夢尼夜蛾表皮的侵染情況。

1.5 萊氏野村菌白僵菌復合型粉炮防治試驗

將上述萊氏野村菌、白僵菌加工成復合型粉炮后進行野外林間試驗。

1.5.1 試驗區(qū)防效測定

333.33 hm2試驗區(qū)分兩部分：對照區(qū)和防治區(qū)， 分別在試驗后定期取樣調(diào)查(以未施菌粉為對照)，在對照區(qū)、防治區(qū)分別設置標準株各20株，用高枝剪剪取枝條，調(diào)查活蟲數(shù)。蟲口密度以百葉活蟲數(shù)表示。每半月收集僵蟲于實驗室分離致病微生物(萊氏野村菌、球孢白僵菌)。每666.7 m2用粉炮2個(250 g·個-1)。

1.5.2 示范區(qū)粉炮防治

300 hm2示范區(qū)施用時間約10 d～12 d，與試驗區(qū)間設有隔離帶，并設有20株杜仲定點觀察防效。每666.7 m2用粉炮2個(125 g·個-1)。示范區(qū)防效評價以同期試驗區(qū)所設對照數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)。

1.5.3 粉炮施放時間與管理

選擇清晨或傍晚時間施用以提高防效。粉炮施用后，由專人定點定期觀察記錄，定期在實驗基地觀察實驗效果，交流試驗進展情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 蟲生真菌ITS序列分析與系統(tǒng)發(fā)育

經(jīng)3次分離，獲得10株4種類型分離比例較高、菌落單一生長良好的疑似蟲生真菌，通過ITS基因序列分析，在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行同源性比對，結(jié)果證明：類型Ⅰ的菌株與桔青霉的同源性為99%；類型Ⅱ的菌株與產(chǎn)黃青霉的同源性為99%；類型Ⅲ的菌株與球孢白僵菌的同源性為99%；類型IV的3個菌株m11a，m11b和m12 的ITS基因長度分別為623 bp、613 bp、624 bp，通過在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行同源性比對，發(fā)現(xiàn)菌株m11a，m11b和m12與萊氏野村菌(登錄號AF368501)的同源性均為99%，表明類型IV的3菌株均為萊氏野村菌。

根據(jù)萊氏野村菌rDNA-ITS電泳結(jié)果如圖1，構(gòu)建以白僵菌為外群的萊氏野村菌系統(tǒng)發(fā)育樹如圖2所示。

圖1 萊氏野村菌rDNA-ITS電泳圖

圖2 基于萊氏野村菌rDNA-ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2 蟲生真菌致病力

4種真菌對杜仲夢尼夜蛾的致病力測定表明萊氏野村菌毒力最高，白僵菌次之，產(chǎn)黃青霉、橘青霉無毒力(表1)。萊氏野村菌初感染時，蟲體抵抗力減弱，進食減少，表皮出現(xiàn)局部黑斑；12 h后，蟲體死亡，蟲身變僵直，手戳蟲身尚有彈性；24 h后，蟲體局部出現(xiàn)白色絲狀，手戳無彈性，蟲尸徹底僵硬；36 h后，蟲體足漸失水皺縮，每個體節(jié)環(huán)內(nèi)均有白色綠色絲狀菌絲長出；48 h后，菌絲布滿蟲體表面，肉眼可見蟲尸周散落圍綠色粉狀孢子粉；72 h后，蟲體內(nèi)外均被菌絲侵染，不再皺縮，僵直干硬，肉眼可見綠色粉狀孢子粉包裹蟲身。

表1 4種蟲生真菌對幼蟲毒力比較

在電子顯微鏡下觀察初侵染12 h以內(nèi)的蟲體表皮，可清晰的看到附著于表皮生長的萊氏野村菌菌絲(圖3)。

圖3 電子顯微鏡下蟲體表皮生長的萊氏野村菌菌絲

2.3 復合粉炮林間防效顯著

試驗區(qū)設在仰天窩藥場的場部周圍和吶叭崗。根據(jù)夢妮夜蛾在大邑的生物學特性(第1代幼蟲出現(xiàn)在5月上中下旬、第2代幼蟲出現(xiàn)在6月中下旬～7月上旬、第3代幼蟲出現(xiàn)在7月下旬～8月上中旬)，試驗區(qū)復合粉炮分別在施用后不同時間(持續(xù)4個月區(qū)間)取樣調(diào)查(以未施菌粉為對照)，在對照區(qū)、防治區(qū)分別設置標準株各20株，用高枝剪剪取枝條，調(diào)查活蟲數(shù)。蟲口密度以百葉活蟲數(shù)表示。相對防效(蟲口減退率)%=1-防治區(qū)百葉活蟲數(shù)/對照區(qū)百葉活蟲數(shù)。在1周后開始有生防效果(蟲口減退率：70%)，以后持續(xù)增高，維持一個高水平防效86%～90%(表2)。每半月收集的僵蟲可分離到萊氏野村菌、球孢白僵菌。

大面積(300 hm2)示范區(qū)防治設在仰天窩場的灰窯崗、火挾溝一帶。示范區(qū)復合粉炮施用與試驗區(qū)同步進行。示范區(qū)設置標準株20株，用高枝剪剪取枝條，調(diào)查活蟲數(shù)，蟲口密度以百葉活蟲數(shù)表示(同上)，以試驗區(qū)的未施菌粉數(shù)據(jù)為對照。粉炮施用1周后蟲口減退率為70%，隨著時間增加，生防菌不斷繁殖，防效可持續(xù)提高，穩(wěn)定在85.1%～90%間(表3)。示范區(qū)與試驗區(qū)趨勢一致。

粉炮施用7 d后夢尼夜蛾發(fā)生明顯感染復合感染率較高。

表2復合粉炮試驗區(qū)監(jiān)測與防治效果

表中平均每株杜仲100張葉片蟲口數(shù)說明：*對照區(qū)數(shù)據(jù)：4.8頭——(19株每株5頭，1株1頭)；1.0頭——(20株每株1頭)；1.1頭——(19株每株1頭，1株3頭)；4.3頭——(10株每株5頭，9株每株4頭，1株0頭)；4.7頭——(15株每株4頭，4株每株7頭，1株6頭)；4.5頭——(10株每株5頭，10株每株4頭)；1.5頭——(10株每株1頭，10株每株2頭)；2.9頭——(11株每株2頭，9株每株4頭)；0.5頭.(10株每株1頭，10株每株0頭)

防治區(qū)數(shù)據(jù)：0.3頭——6株每株1頭，14株0頭；0.15——3株每株1頭，17株0頭；0.6——12株每株1頭，8株0頭；0.65——13株每株1頭，7株0頭；0.2——4株每株1頭，16株0頭；0.5——10株每株1頭，10株0頭；0.45——9株每株1頭，11株0頭；0.05——1株為1頭，19株為0頭。

表3復合粉炮示范區(qū)監(jiān)測與防治效果

表中平均每株杜仲100張葉片蟲口數(shù)說明：*示范區(qū)對照以試驗區(qū)對照數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)。

示范區(qū)防治數(shù)據(jù)：0.3——6株每株1頭，14株0頭；0.6——12株每株1頭，8株0頭；0.7——14株每株1頭，6株0頭；0.5——10株每株1頭，10株0頭；0.15——3株每株1頭，17株0頭；0.05——1株為1頭，19株為0頭

3 討論與結(jié)論

球孢白僵菌(B.bassiana)為常見蟲生真菌，是國內(nèi)外廣泛用于害蟲生物防治的殺蟲真菌之一[3]。國內(nèi)外研究人員利用球孢白僵菌防治玉米螟、松毛蟲、小蔗螟、盲椿、谷象、柑桔紅蜘蛛和蚜蟲等農(nóng)林害蟲。特別是對玉米螟和松毛蟲的生物防治，在國內(nèi)已作為常規(guī)手段連年使用。由于球孢白僵菌能有效地控制蟲口數(shù)量，同時不傷害其他天敵昆蟲和有益生物，完全符合有害生物綜合治理的宗旨，同時由于其容易大量生產(chǎn)，防治成本較有競爭力，因而被認為是最具開發(fā)潛力的一種昆蟲病原真菌，其生產(chǎn)工藝相對成熟，其產(chǎn)品可滿足生產(chǎn)上需要。

萊氏野村菌(Nomuraearileyi)是一種重要的昆蟲病原真菌[4]，能感染30多種鱗翅目昆蟲，尤其對夜蛾科害蟲的致病力很強,且常能引起病害流行，對人體和其他非目標生物包括昆蟲寄生蟲和捕食者無毒害作用，因而受到人們的重視。至1883年Farlow首次報道發(fā)現(xiàn)萊氏野村菌以來，很多國家都相繼發(fā)現(xiàn)了此菌并對其做了大量研究，名稱各異，Kish等對其做了大量系統(tǒng)種屬研究后，于1974年正式確定其名稱為萊氏野村菌，將其他名稱作為異名，得到該界的普遍承認和使用。在美國、巴西、阿根廷、澳大利亞等國，萊氏野村菌已經(jīng)廣泛的應用于田間的害蟲防治，其中防治對象主要為鱗翅目尤其是夜蛾類害蟲，通常采用的方法是以孢子懸浮液的形式噴施到田間植株上或以土壤緩釋的方式來感染靶標害蟲。Devi[5](1995 )做過兩組對比，一是將萊氏野村菌的分生孢子配成懸浮液噴施于葉片上，并在夜間灌溉以調(diào)節(jié)濕度條件；二是直接將分生孢子連同培養(yǎng)基施入靠近植株的土壤中，前4 d灌溉調(diào)節(jié)土壤濕度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：第1組處理前4 d的持效性降低為70%， 6 d起開始快速降低，到第12 d菌株的殺蟲效率降低到了零。而第2組的殺蟲效果降低相對較慢，直到施藥后的第14 d，殺蟲效果只降低到了77%，而且土壤里的培養(yǎng)基上仍然能夠觀察到有孢子的繼續(xù)形成。這個試驗為田間病害提供了一個思路，可以利用土壤緩釋的方法，避開紫外線對真菌孢子的殺傷作用，延長孢子壽命和持效期。

與其它蟲生真菌相比，萊氏野村菌在控制害蟲種群和對非靶標生物的安全性上具有較為明顯的優(yōu)勢，具有較強的開發(fā)和應用潛力。我國對此菌的研究較晚，首次發(fā)現(xiàn)和分離得到此菌是在1975年，此后也做了大量培養(yǎng)及應用試驗，但重點大都放在了此菌的分離鑒定和致病性測定等方面，近幾年已對其生物學、幾丁質(zhì)酶發(fā)酵條件及幾丁質(zhì)酶基因克隆、蛋白質(zhì)測序等進行過研究報道，還對其進行了附著胞的熒光顯微及掃描電鏡觀察[6]，相關(guān)發(fā)酵條件優(yōu)化的報道也有所增加，但大都停留在實驗室內(nèi)，而此菌分生孢子粉的生產(chǎn)、在環(huán)境中的宿存能力等問題雖然已有學者開始著手研究，但并未見有將此菌成功用于大規(guī)模生產(chǎn)相關(guān)的報道，成為了影響其大規(guī)模開發(fā)和應用的制約因素，建議此蟲生真菌可立項研究，以解決其規(guī)?；a(chǎn)工藝問題。

本研究中的復合粉炮林間防效顯著，一般在1周后開始有產(chǎn)生防治效果(蟲口減退率：70%)，以后持續(xù)增高，維持一個高水平防效85.1%～90%。，示范區(qū)與試驗區(qū)趨勢一致。并從僵蟲上可分離到萊氏野村菌、球孢白僵菌。目前球孢白僵菌粉炮生產(chǎn)已成熟，將萊氏野村菌、球孢白僵菌制成復合制劑成本較高，有關(guān)技術(shù)尚需進一步研究。

[1] 高貴珍, 曹穩(wěn)根, 劉小陽, 等. 兩種藥用植物葉的營養(yǎng)成分和藥用價值分析[J]. 淮北煤師院學報, 2003(1)44～46.

[2] 李建林，呂永財.利用毒環(huán)毒繩防治杜仲夜蛾[J].西北林業(yè)學報,1994,4.

[3] 夏如冰.中國生物防治科技的發(fā)展及其動因初探[J].中國農(nóng)史, 2000,8.

[4] 陸永躍,尹楚道．萊氏野村菌對棉鈴蟲致病力及田間控制作用初步研究[J]．植物保護,1998,24(4):14～17.

[5] Devi P S V.Soil treatment with Nomuraearileyi: a promising technique for the control of Spodopteralitura on groundnut.Biocontrol Science and Technology,1995,5(3):361～364.

[6] 樊美珍,黃勃,王建樹，等.幾種蟲生真菌附著胞的熒光顯微及掃描電鏡觀察[J].菌物系統(tǒng)，1999，18 (3):249～253.

2017-03-16

朱天輝(1963-)，男，教授，博士生導師，主要從事林木病蟲害及生物防治的研究。

10.16779/j.cnki.1003-5508.2017.04.006

S763.7

:A

:1003-5508(2017)04-0025-05