孫 云 馬定遠 王彥云 程 威 梁曉威 蔣 濤

南京醫(yī)科大學附屬婦產(chǎn)醫(yī)院 遺傳醫(yī)學中心新生兒篩查室（江蘇南京 210004）

新生兒篩查發(fā)現(xiàn)的原發(fā)性肉堿缺乏癥臨床與基因分析

孫 云 馬定遠 王彥云 程 威 梁曉威 蔣 濤

南京醫(yī)科大學附屬婦產(chǎn)醫(yī)院 遺傳醫(yī)學中心新生兒篩查室（江蘇南京 210004）

目的探討原發(fā)性肉堿缺乏癥的臨床和基因突變特點。方法 回顧分析2013年12月—2016年12月以串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)新生兒篩查發(fā)現(xiàn)的6例原發(fā)性肉堿缺乏癥及2例母源性肉堿缺乏患兒的臨床資料。結(jié)果 8例患兒血游離肉堿初篩值為（5.85±1.65）μmol/L，召回復(fù)查值（5.22±1.02）μmol/L，其中6例原發(fā)性肉堿缺乏癥患兒采用基于Ion Torrent半導體測序技術(shù)的遺傳代謝病Panel進行基因診斷，均檢測到2個等位基因致病性突變；口服左旋肉堿治療后血游離肉堿（20.24±3.88）μmol/L，繼續(xù)隨訪中；另2例母源性肉堿缺乏患兒混合喂養(yǎng)1周后血游離肉堿基本恢復(fù)正常，未進行基因診斷。結(jié)論 采用串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)新生兒篩查及二代測序Panel可有效檢出原發(fā)性肉堿缺乏癥，早期規(guī)范治療預(yù)后良好。

原發(fā)性肉堿缺乏癥； 游離肉堿； SLC22A5基因

原發(fā)性肉堿缺乏癥（primary carnitine deficiency，PCD）是由于細胞膜上的肉堿轉(zhuǎn)運蛋白出現(xiàn)異常，不能將肉堿轉(zhuǎn)運至細胞內(nèi)，從而導致長鏈脂肪酸無法進入線粒體基質(zhì)參與脂肪酸β氧化，為機體供能，該病是脂肪酸氧化代謝病中最常見的一種，屬于常染色體隱性遺傳。PCD是可治療的遺傳代謝病，隨著串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)新生兒篩查在我國的推廣，越來越多的PCD患兒得以早期篩查、診斷和治療，預(yù)后改善。南京醫(yī)科大學附屬婦產(chǎn)醫(yī)院2013年12月—2016年12月通過串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)新生兒篩查發(fā)現(xiàn)并診斷6例PCD及2例母源性肉堿缺乏，現(xiàn)將臨床和基因分析情況報告如下。

1 臨床資料

2013年12月—2016年12月南京醫(yī)科大學附屬婦產(chǎn)醫(yī)院采用串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)篩查新生兒66 396例，診斷PCD 6例，其中男2例，女4例。

新生兒出后72小時采集足跟血，制成干血濾紙片，采用串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)（Waters Quattro API 串聯(lián)質(zhì)譜儀，試劑購自PerkinEImer）測定游離肉堿濃度，檢測方法參考文獻[1]。游離肉堿參考值范圍：10～49.5μmol/L。初篩血游離肉堿低于10μmol/L立即召回復(fù)查，同時檢測母親血游離肉堿水平。初篩及召回復(fù)查血游離肉堿均低于10μmol/L者在父母知情同意下，采用遺傳代謝病基因診斷Panel進行基因診斷（經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核）。

遺傳代謝病基因診斷Panel覆蓋51個病種98個基因，其中Panel1覆蓋氨基酸代謝病18個病種35個基因，Panel 2覆蓋有機酸代謝病和糖原代謝病17個病種42個基因，Panel 3覆蓋脂肪酸代謝病16個病種21個基因。采用OMEGA 基因組DNA提取試劑盒（美國OMEGA生物技術(shù)公司）提取外周靜脈血基因組DNA。文庫構(gòu)建采用Life technologies公司發(fā)布的Ion AmpliSeq? Inherited Disease Panel 試劑盒及Ion AmpliSeq? Library Kit 2.0 (catalog no.4475345)對Panel3的21個基因全外顯子進行擴增。PCR擴增反應(yīng)體系及條件按說明書進行。采用Ion XpressTM Barcode Adapters 1-16 Kit ( catalog no. 4471250) 對樣品加上序列標簽及Ion Torrent個體化基因組測序儀(personal genome machine，PGM)測序平臺兼容的測序接頭。乳液PCR和ISPs富集采用Ion PGM 200 Xpress Template Kit (catalog no.4474280)，操作步驟按說明書進行。Ion Torrent PGM平臺測序采用Ion PGM 200 Sequencing Kit(catalog no. 4474004，Life Technologies)及Ion Torrent 316芯片在Ion Torrent PGM平臺進行測序反應(yīng)，共65個測序循環(huán)。結(jié)果分析采用Ion Torrent Suite v4.4軟件進行Ion Torrent數(shù)據(jù)提取、序列比對及SNPs和Indels提取，得到的SNPs和indels經(jīng)dbSNP 138數(shù)據(jù)庫過濾后，可疑致病突變經(jīng)Sanger測序法進行驗證。

6例PCD患兒SLC22A5基因均找到2個已報道的致病位點突變（表1，圖1），分別來自父親和母親；2例母源性肉堿缺乏女性患兒家屬拒絕基因診斷。8例均為足月兒，無臨床癥狀。

表1 6例PCD患兒臨床及基因分析

圖1 SLC22A5基因突變Sanger測序圖

確診后6例PCD患兒均以左旋肉堿100 mg/(kg·d)，分3次口服。治療初期每兩周門診隨訪1次，血游離肉堿正常且穩(wěn)定后每3個月門診隨訪1次，治療期間定期復(fù)查串聯(lián)質(zhì)譜（游離肉堿控制在20μmol/L左右，其他多種酰基肉堿均在正常范圍）。隨訪項目：體格檢查、血糖、血氨、肝功能、肌酸激酶、血紅蛋白等，影像學檢查包括腹部超聲、超聲心動圖，評估生長、智力及運動發(fā)育情況。末次隨訪年齡為0.2～2歲，末次隨訪時，6例患兒生長發(fā)育均在正常范圍內(nèi)，仍在繼續(xù)隨訪中。

2 討論

1975年Karpmi 等[2]首次報道PCD，不同國家或地區(qū)的PCD患病率從1/120 000到1/40 000，人群中雜合子的發(fā)生率為0.5%～1%[2，3]。我國尚無全國性患病率的統(tǒng)計數(shù)據(jù)，上海統(tǒng)計發(fā)病率約1/45 000[4，5]，浙江省約為1/22 384[6]，本研究共篩查新生兒66 396例，診斷PCD 6例，發(fā)病率為1/11 066，與上海杭州等地相比偏高，考慮與地域差異和統(tǒng)計年限較短有關(guān)。

PCD的致病基因為SLC22A5，定位于染色體5q31.1，包含10個外顯子和3個內(nèi)含子，目前已經(jīng)檢測出110余種突變類型，多為錯義突變，不同地區(qū)人群中的熱點突變有所不同，國內(nèi)大多數(shù)研究認為c,760C＞T(p,R254X)和c,1400C＞G(p,S467C)是中國大陸地區(qū)的熱點突變[5]。本研究中的6例患兒均檢測到2個致病性突變，其中c,760C＞T(p,R254X)和c,400C＞G(p,S467C)突變的出現(xiàn)頻率高達50%，也證實了這一結(jié)論。

PCD的診斷主要依賴于血游離肉堿水平、臨床表現(xiàn)和基因突變分析。本研究中的6例PCD患兒及2例母源性肉堿缺乏患兒初篩血游離肉堿均低于實驗室截斷值（＜10μmol/L），均值只有6.42μmol/L，證實了串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)新生兒篩查對于PCD診斷的意義，同時也能有效檢出母親PCD。由于肉堿可通過胎盤轉(zhuǎn)運至胎兒體內(nèi)，因此新生兒出生后短時間內(nèi)的血漿游離肉堿水平往往反映的是母親血漿游離肉堿水平，即部分新生兒患者由于母體的保護作用導致新生兒期血漿游離肉堿水平未明顯低于正常，另有部分新生兒攜帶者由于母體(PCD患者)的影響導致其血漿游離肉堿水平低下。因此，對于可疑PCD患兒，同時檢測母親血游離肉堿水平很有必要。本研究中2例母源性肉堿缺乏者，初篩游離肉堿偏低，召回復(fù)查時同時檢測母親也偏低，經(jīng)混合喂養(yǎng)1周后復(fù)查，新生兒游離肉堿均升高至接近正常水平，符合母源性肉堿缺乏的臨床表現(xiàn)。詳細詢問病史，此2例PCD母親均無臨床癥狀。另外，臨床有一部分患兒為繼發(fā)性肉堿缺乏，如早產(chǎn)兒、重癥營養(yǎng)不良、透析丟失過多以及其他有機酸或脂肪酸代謝病，僅憑串聯(lián)質(zhì)譜篩查游離肉堿降低以及臨床特征很難明確診斷，需依賴于基因診斷[7]。

PCD可于任何年齡發(fā)病，主要表現(xiàn)為擴張型心肌病、肝腫大、肌無力等，若不及時治療，可導致死亡，故早期診斷、及時治療是改善預(yù)后的關(guān)鍵。PCD的治療主要是口服或靜滴左旋肉堿，靜滴左旋肉堿主要適用于病情危重、無法進食的重癥患兒，本研究中的6例患兒經(jīng)新生兒篩查發(fā)現(xiàn)，無臨床癥狀，因此均予口服左旋肉堿治療，所有患兒末次隨訪時血游離肉堿及其他多種酰基肉堿濃度正常，生長發(fā)育正常。然而，臨床上發(fā)現(xiàn)，PCD患兒絕大部分無明顯臨床癥狀，僅須口服左卡尼丁，患兒及家長的治療依從性較差，反復(fù)中斷治療，由于中斷治療可誘發(fā)脂肪代謝紊亂甚至猝死等嚴重后果[8，9]，因此，詳細告知病情并簽署知情同意書，囑咐規(guī)范治療很重要。

本研究中的二代測序Panel，將串聯(lián)質(zhì)譜新生兒篩查的病種進行了整合，覆蓋了目前所有篩查病種并加入了須鑒別診斷的多個病種，對于遺傳代謝病的診斷優(yōu)勢明顯，較之單純采用二代測序技術(shù)檢測，極大程度地縮短診斷時間，避免誤診漏診，并且更加經(jīng)濟方便。早期規(guī)范左旋肉堿治療的原發(fā)性肉堿缺乏癥患兒預(yù)后良好。

[1]王彥云,呂伶,孫云,等.應(yīng)用百分位數(shù)法聯(lián)合ROC曲線探討建立新生兒11種氨基酸非衍生化串聯(lián)質(zhì)譜法的正常值范圍[J].中華檢驗醫(yī)學雜志, 2016, 39(10): 756-760.

[2]Karpati G, Carpenter S, Engel AG, et a1. The syndrome of systemic carnitine deficiency．Clinical，morphologic，biochemical，and pathophysiologic features [J]．Neurology,1 975, 25(1): 16-24．

[3]Amat di San Filippo C, Taylor MR, Mestroni L, et a1.Cardiomyopathy and camitine deficiency [J]．Mol Genet Metab, 2008, 94(2): 162-166．

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[6]馬平悅. 50例新生兒原發(fā)性肉堿缺乏癥的基因譜及臨床特征分析[D]. 浙江大學, 2015

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[8]Magoulas PL, El-Hattab AW. Systemic primary carnitine deficiency: an overview of clinical manifestations, diagnosis,and management [J]. Orphanet J Rare Dis, 2012 ,7: 68.

[9]Deswal S, Bijarnia-Mahay S, Manocha V, et al. Primary carnitine deficiency - a rare treatable cause of cardiomyopathy and Massive Hepatomegaly [J]. Indian J Pediatr, 2017, 84(1):83-85.

Clinical and gene analysis of primary carnitine deficiency found by neonatal screening

SUN Yun, MA Dingyuan,WANG Yanyun, CHENG Wei, LIANG Xiaowei, JIANG Tao (Center of Genetic Medicine, Obstetrics and Gynecology Hospital Affiliated to Nanjing Medical University, Nanjing 210004, Jiangsu, China)

ObjectiveTo explore the clinical feature and gene types in patients with primary carnitine deficiency.MethodsClinical data of 6 patients with primary carnitine deficiency and 2 patients with maternal carnitine deficiency found in the screening by tandem mass spectrometry technology during December 2013 to December 2016 were retrospectively analyzed.ResultsThe free carnitine levels of 8 patients in initial and recall screening were 5.85±1.65 μmol/L and 5.22±1.02 μmol/L.Two pathogenic alleles were detected in each patient with primary carnitine deficiency by genetic and metabolic disease panel based on Ion Torrent semiconductor sequencing. After treatment with oral L-carnitine, the free carnitine levels of 6 patients with primary carnitine deficiency were 20.24±3.88 μmol/L. The carnitine levels returned to normal after mixed feeding for one week in 2 patients with maternal carnitine deficiency, and no genetic diagnosis was carried out. Conclusion Primary carnitine deficiency can be effectively detected using tandem mass spectrometry technology and next generation sequencing panel and the prognosis is good with early standard treatment.

primary carnitine deficiency; free carnitine; SLC22A5 gene

2016-11-25）

（本文編輯：梁 華）

10.3969/j.issn.1000-3606.2017.09.008

國家自然科學基金（No.81541064，81671475）；南京市醫(yī)學科技發(fā)展重點項目（No.ZKX14041）

蔣濤 電子信箱：jiangzhang784@163.com