陳 濤，向紅莉，張 配，鄭 操，付 杰，謝鑫磊 ，陳明鍇， 唐孝鵬，肖 敏，何東平

(1. 武漢輕工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,武漢 430023； 2. 中國科學(xué)院 武漢病毒研究所，武漢 430071；3. 遵義市糧油質(zhì)量監(jiān)測(cè)中心,貴州 遵義 563000； 4. 武漢大學(xué)人民醫(yī)院，武漢430064；5. 嘉必優(yōu)生物技術(shù)(武漢)股份有限公司,武漢430200)

油脂營養(yǎng)

含DHA藻油的大豆調(diào)和油對(duì)SD大鼠大腦皮層和視網(wǎng)膜形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

陳 濤1,2，向紅莉3，張 配1，鄭 操1，付 杰1，謝鑫磊1，陳明鍇4， 唐孝鵬5，肖 敏5，何東平1

(1. 武漢輕工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,武漢 430023； 2. 中國科學(xué)院 武漢病毒研究所，武漢 430071；3. 遵義市糧油質(zhì)量監(jiān)測(cè)中心,貴州 遵義 563000； 4. 武漢大學(xué)人民醫(yī)院，武漢430064；5. 嘉必優(yōu)生物技術(shù)(武漢)股份有限公司,武漢430200)

以SD大鼠為試驗(yàn)對(duì)象，向其灌胃含不同含量DHA藻油的大豆調(diào)和油，應(yīng)用超薄切片技術(shù)觀察SD大鼠大腦皮層和視網(wǎng)膜形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化。結(jié)果表明：含DHA藻油的大豆調(diào)和油有利于大鼠大腦皮層細(xì)胞的發(fā)育，在一定含量范圍內(nèi)有利于形成完整的視網(wǎng)膜形態(tài)結(jié)構(gòu)，而高含量DHA藻油的大豆調(diào)和油會(huì)導(dǎo)致視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)的不完整。

DHA藻油；SD大鼠；大腦皮層；視網(wǎng)膜；超薄切片

DHA是人體大腦和眼睛必不可少的多不飽和脂肪酸,尤其是在大腦皮層和視網(wǎng)膜中可占某些磷脂中的總脂肪酸的30%～55%[1-2]。DHA不但有利于大腦、視網(wǎng)膜的發(fā)育生長[3-8],而且可以減少神經(jīng)細(xì)胞和光感受器細(xì)胞凋亡[9-12],對(duì)防治因腦細(xì)胞衰退而引發(fā)的老年癡呆、智力低下和視網(wǎng)膜色素變性而引發(fā)的視力下降等疾病均有功效[13-14]。

研究表明[15-16]，在食用植物油中添加DHA藻油飼喂SD大鼠，有利于SD大鼠的生長發(fā)育和行為學(xué)的優(yōu)化。

在前期研究的基礎(chǔ)上，本文對(duì)SD大鼠飼喂添加DHA藻油的食用植物油，在飼喂一段時(shí)間后處死，取其大腦前區(qū)皮層組織和眼睛視網(wǎng)膜組織進(jìn)行制樣、切片，并在電子顯微鏡下透射觀察和拍片，研究含DHA藻油的大豆調(diào)和油對(duì)SD大鼠大腦皮層和視網(wǎng)膜形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響，以期為DHA藻油在食用油中的廣泛應(yīng)用奠定良好的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣品、試劑和藥品

DHA藻油來源于嘉必優(yōu)生物技術(shù)(武漢)股份有限公司；一級(jí)大豆油來源于益海嘉里集團(tuán)；所用其他樣品、材料和藥品見參考文獻(xiàn)[15-16]。

1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

試驗(yàn)動(dòng)物SD大鼠來源于武漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。取初斷乳SD雄性大鼠25只，體重75～95 g，分為5組，每組5只。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品制備

DHA藻油添加大豆油的制備方法見參考文獻(xiàn)[15]。

1.2.2 動(dòng)物試驗(yàn)

試驗(yàn)用SD大鼠的分組處理、飼養(yǎng)、飼喂樣品、藥品及試驗(yàn)觀察見參考文獻(xiàn)[16]。具體分組情況見表1。

表1 DHA藻油大豆調(diào)和油的SD大鼠試驗(yàn)分組情況

1.2.3 動(dòng)物組織預(yù)固定

當(dāng)動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，在宰殺過程中，即刻提取各處理組SD大鼠的大腦皮層組織和眼睛組織，用4%多聚甲醛(含DEPC)固定，冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 SD大鼠腦組織的切片制備及電鏡觀察

將預(yù)固定的大腦皮層組織，用鋨酸做后固定，用乙酸做逐級(jí)脫水處理，接著用丙酮置換后，再用環(huán)氧樹脂與丙酮置換。將置換完成的樣品在恒溫干燥箱內(nèi)放置72 h，進(jìn)行聚合作用。經(jīng)Leica ultracutr超薄切片機(jī)切片，用醋酸鈾、檸檬酸鉛對(duì)超薄切片樣品進(jìn)行雙染色。將染色后的大腦前區(qū)皮層超薄切片經(jīng)H-600透射電鏡進(jìn)行觀察并照相。

1.2.5 SD大鼠眼睛視網(wǎng)膜的制備及電鏡觀察

1.2.5.1 雙固定

將冰箱保存的眼睛組織，剝離出視網(wǎng)膜，浸入PBS(0.1 mol/L，不含NaCl)的溶液中，漂洗3次，每次20 min。再用4℃預(yù)冷的1%的鋨酸在4℃下固定2～3 h，然后用PBS(0.1 mol/L，不含NaCl)浸洗3～5次，每次20 min。

1.2.5.2 脫水

用系列梯度的乙醇(50%、70%、80%、85%、90%、95%、100%)脫水，每種體積分?jǐn)?shù)的乙醇脫水1次，每次約10 min(一般為15 min)，最后再用100%乙醇脫水。

1.2.5.3 滲透

滲透劑依次為丙酮-環(huán)氧樹脂(2∶1)、丙酮-環(huán)氧樹脂(1∶1)、環(huán)氧樹脂，在37℃恒溫干燥箱中，每次滲透過夜12 h。

1.2.5.4 包埋

將滲透過的樣品放入小膠囊中，加入包埋劑環(huán)氧樹脂，將樣品按所需方向放入包埋板的尖端，60℃恒溫干燥箱中固化48 h。

1.2.5.5 切片和電鏡觀察

將包埋樣品進(jìn)行修塊，修成合適的大小和形態(tài)，置于Leica ultracutr超薄切片機(jī)切片，厚度為60～100 nm，用鉛和鈾染色后即可在TecnaiG2 200TWFn透射電子顯微鏡(美國FEI公司)下觀察樣品并拍照，本工作由中國科學(xué)院武漢病毒研究所電鏡室完成。

2 結(jié)果與討論

2.1 SD大鼠大腦前區(qū)皮層超薄切片的形態(tài)結(jié)構(gòu)

SD大鼠大腦前區(qū)皮層顯微結(jié)構(gòu)如圖1所示。

從圖1可以看出，大鼠大腦前區(qū)皮層神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)有明顯差異。在圖1b中，細(xì)胞排列緊密，細(xì)胞邊緣清晰，細(xì)胞內(nèi)核體著色深且很清楚；而在圖1a中，細(xì)胞邊緣模糊，細(xì)胞大，核體小，整個(gè)著色不清晰。這說明用DHA藻油大豆調(diào)和油飼喂的SD大鼠腦細(xì)胞生長旺盛，年輕有活力；而在陰性對(duì)照組中SD大鼠的大腦皮層細(xì)胞生長停滯、衰老。另外，在SD大鼠大腦前區(qū)皮層的神經(jīng)元突觸間隙也有明顯差異。在圖1b中，箭頭所指神經(jīng)元突觸間隙在單位空間內(nèi)的數(shù)量明顯多于圖1a中箭頭所指的數(shù)量。這也表明用DHA藻油大豆調(diào)和油飼喂的SD大鼠大腦前區(qū)皮層神經(jīng)元細(xì)胞比正常飼喂的SD大鼠大腦前區(qū)皮層神經(jīng)元細(xì)胞具有活力、年輕、延緩衰老的特征。除此之外還有助于神經(jīng)沖動(dòng)傳導(dǎo)、釋放和交換更多的化學(xué)傳遞物質(zhì)，刺激靶細(xì)胞反應(yīng)，使神經(jīng)元細(xì)胞間建立更多的離子通道。最終達(dá)到神經(jīng)細(xì)胞年輕活力，從而提高SD大鼠神經(jīng)傳導(dǎo)效率，加強(qiáng)神經(jīng)對(duì)肌肉及其他組織的控制能力。

注：a為陰性對(duì)照組；b為DHA藻油中含量處理組。

2.2 SD大鼠視網(wǎng)膜的超薄形態(tài)結(jié)構(gòu)

2.2.1 陰性對(duì)照組(見圖2)

注：a為標(biāo)尺2 μm；b、c、d為標(biāo)尺1 μm。

從圖2可以看出，視細(xì)胞呈不規(guī)則形，細(xì)胞核為近圓形或橢圓形，核邊緣清晰，核質(zhì)分布不均勻，錐狀細(xì)胞、桿狀細(xì)胞邊緣不整齊，呈衰老狀，但外叢層(圖2c)及節(jié)細(xì)胞層(圖2d)可見?？傮w來講，大鼠視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)不夠完整。

2.2.2 陽性對(duì)照組(見圖3)

圖3 陽性對(duì)照組的大鼠視網(wǎng)膜顯微結(jié)構(gòu)(標(biāo)尺2 μm)

從圖3可以看出，每天飼喂DHA藻油的SD大鼠的視網(wǎng)膜切片中，不但看不到完整的視網(wǎng)膜而且結(jié)構(gòu)破碎，也未見有典型的桿狀、錐狀細(xì)胞結(jié)構(gòu)，表明細(xì)胞變成不規(guī)則的排列分布。

2.2.3 DHA藻油低含量處理組(見圖4)

在DHA藻油低含量處理組中，可見典型視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)圖，如圖4a所示，結(jié)構(gòu)清楚，如人的視網(wǎng)膜圖，色素上皮層、桿體椎體層、外顆粒層層次分明，細(xì)胞結(jié)構(gòu)典型。椎體細(xì)胞經(jīng)放大后，可見螺旋的錐狀體排列整齊有序(見圖4b)。

注：a為標(biāo)尺2 μm；b為標(biāo)尺1 μm。下同。

2.2.4 DHA藻油中含量處理組(見圖5)

圖5 DHA藻油中含量處理組的大鼠視網(wǎng)膜顯微結(jié)構(gòu)

在DHA藻油中含量處理組中，可見視網(wǎng)膜的典型完整結(jié)構(gòu)，如圖5a所示，可見色素上皮層、視細(xì)胞層，包括桿狀、錐狀細(xì)胞，細(xì)胞排列緊密有活力。錐體細(xì)胞螺旋紋路清晰，桿狀細(xì)胞清晰可見。經(jīng)放大后，視網(wǎng)膜細(xì)胞排列有序，邊緣整齊，具有年輕活力的特征(見圖5b)。

2.2.5 DHA藻油高含量處理組(見圖6)

從圖6可以看出，在DHA藻油高含量處理組中，可見完整的視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)，但層次結(jié)構(gòu)不如低含量處理組和中含量處理組明顯?？梢娚厣掀印⒁暭?xì)胞層即桿狀細(xì)胞和錐狀細(xì)胞。

圖6 DHA藻油高含量處理組的大鼠視網(wǎng)膜顯微結(jié)構(gòu)

3 結(jié) 論

本研究對(duì)SD大鼠飼喂含DHA藻油的大豆調(diào)和油，取其大腦前區(qū)皮層組織和眼睛視網(wǎng)膜組織進(jìn)行超薄切片、染色和電子顯微鏡觀察，比對(duì)照片，經(jīng)分析獲得以下結(jié)論：

(1)DHA藻油大豆調(diào)和油飼喂SD大鼠后與陰性對(duì)照組對(duì)比，腦前區(qū)皮層細(xì)胞生長緊密、旺盛，數(shù)量明顯增多。這是嬰幼兒腦細(xì)胞數(shù)量增加、腦細(xì)胞生長發(fā)育良好、增強(qiáng)智力的關(guān)鍵所在。因?yàn)镈HA有利于神經(jīng)細(xì)胞的傳導(dǎo)、釋放和交換作用，刺激靶細(xì)胞新陳代謝，使神經(jīng)元細(xì)胞建立更多的離子通道，提高腦神經(jīng)細(xì)胞的傳導(dǎo)效率，增強(qiáng)記憶。

(2)DHA藻油大豆調(diào)和油飼喂SD大鼠后，提取的眼睛視網(wǎng)膜組織經(jīng)電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，DHA藻油低含量處理組、DHA藻油中含量處理組與陰性對(duì)照組相比有明顯差異，前兩者視網(wǎng)膜細(xì)胞層次清楚，細(xì)胞生長正常，排列緊密，桿狀細(xì)胞、錐狀細(xì)胞清晰可見，細(xì)胞間間隙小，而陰性對(duì)照組視網(wǎng)膜細(xì)胞雖有層次，但不完整，細(xì)胞邊緣不整齊，胞內(nèi)核質(zhì)較小，細(xì)胞數(shù)量減少，桿狀細(xì)胞和錐狀細(xì)胞斷裂，可能是衰老的表現(xiàn)。

(3)DHA藻油高含量處理組與DHA藻油低含量處理組相比有明顯差異，大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞層次排次不齊，細(xì)胞破碎嚴(yán)重，桿狀細(xì)胞和錐狀細(xì)胞均有破碎、不完整，這說明補(bǔ)充DHA藻油每天不宜過量，要適量食用。

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EffectofsoybeanformulatedoilcontainingDHAalgaeoilonmorphologicalstructuresofcerebralcortexandretinaofSDrat

CHEN Tao1,2, XIANG Hongli3, ZHANG Pei1, ZHENG Cao1, FU Jie1, XIE Xinlei1, CHEN Mingkai4, TANG Xiaopeng5, XIAO Min5, HE Dongping1

(1. College of Food Science and Engineering, Wuhan Polytechnic University, Wuhan 430023, China; 2. Wuhan Institute of Virology, CAS, Wuhan 430071, China; 3. Zunyi Grain and Oil Quality Monitoring Center, Zunyi 563000, Guizhou, China; 4. Renmin Hospital of Wuhan University, Wuhan 430064, China; 5. CABIO Bioengineering (Wuhan) Co., Ltd., Wuhan 430200, China)

SD rats were fed with soybean formulated oil containing DHA algae oil, and then morphological structures of cerebral cortex and retina of SD rat were observed by ultrathin sectioning technique. The results showed that soybean formulated oil containing DHA algae oil had the positive effect on the development of cerebral cortex of SD rat, and it was beneficial to the integrity of morphological structure of retina in a suitable range. While soybean formulated oil containning high content of DHA led to incomplete structure of retina of SD rat.

DHA algae oil; SD rat; cerebral cortex; retina; ultrathin sectioning

2016-11-21；

：2017-04-13

國家糧食局糧食公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(201313012-03)

陳 濤(1943)，男，教授，研究方向?yàn)槲⑸镉椭c微生物代謝(E-mail)1729268260@qq.com。

何東平，教授(E-mail)hedp123456@163.com。

TS225；R285.5

：A

：1003-7969(2017)07-0124-05