路志芳 蔣鵬飛

（安陽(yáng)工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，河南安陽(yáng) 455000）

香菇多糖的抑菌效果試驗(yàn)

路志芳 蔣鵬飛

（安陽(yáng)工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，河南安陽(yáng) 455000）

香菇中的多糖成分具有多種生物活性，廣泛應(yīng)用于各個(gè)行業(yè)，在食品行業(yè)中可做為天然防腐劑。本試驗(yàn)以干香菇為主要原料，利用熱水浸提法充分提取香菇中的活性多糖，用葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出香菇多糖純度。為探究香菇多糖對(duì)細(xì)菌的抑制作用，我們采用紫外分光光度法研究香菇多糖對(duì)枯草芽孢桿菌、大腸桿菌的抑制性能，并探討在不同時(shí)間、pH值和多糖濃度與其抗菌活性之間的關(guān)系。試驗(yàn)結(jié)果表明，香菇多糖對(duì)大腸桿菌抑制作用在24h時(shí)達(dá)到最大，對(duì)枯草芽孢桿菌在12h時(shí)達(dá)到最大；pH值為5時(shí)對(duì)枯草芽孢桿菌、大腸桿菌的抑制作用最大。

香菇多糖；抑菌活性；分光光度法；熱水浸提法

香菇多糖廣泛應(yīng)用于醫(yī)療行業(yè)，目前已利用香菇多糖開(kāi)發(fā)出一系列抗病毒、抗腫瘤藥物。香菇多糖不僅可制成針劑，用來(lái)作為抑制肝炎和癌癥擴(kuò)散的輔助藥物，而且香菇多糖硫酸酯化產(chǎn)品還可用來(lái)制備抑制艾滋病的輔助藥物。香菇多糖也廣泛應(yīng)用于保健食品領(lǐng)域，其中活性多糖作為功能性因子，具有提高或調(diào)整人體免疫機(jī)能、降低膽固醇、預(yù)防冠心病和心腦血管疾病等作用。本試驗(yàn)以干香菇為原材料，利用熱水浸提法來(lái)提取香菇多糖，研究香菇多糖在不同時(shí)間、pH值、濃度等條件下對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌的抑菌性能，為香菇多糖作為抑菌劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為干香菇，食品級(jí)，安陽(yáng)市丹尼斯責(zé)任有限公司提供；氯仿、正丁醇、濃硫酸、苯酚、無(wú)水乙醇、醫(yī)用紗布、蛋白胨、牛肉膏、檸檬酸、氯化鈉、葡萄糖、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌，安陽(yáng)工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院試驗(yàn)室提供。試驗(yàn)設(shè)備為電熱恒溫水浴鍋，型號(hào)HH-6，國(guó)華電器有限公司生產(chǎn)；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，型號(hào)TU-1810DASPC，北京普析通用有限責(zé)任公司生產(chǎn)；立式壓力蒸汽滅菌器，型號(hào)LDZH-100KBS，上海申安醫(yī)療器械廠；渦旋振蕩器，型號(hào)Vortex 4 basic，德國(guó)IKA公司生產(chǎn)；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，型號(hào)DGG-970B，上海森信試驗(yàn)儀器有限公司生產(chǎn)；雙人單面凈化工作臺(tái)，型號(hào)SW-CJ-2D，蘇州凈化設(shè)備有限公司生產(chǎn)；全溫震蕩培養(yǎng)箱，型號(hào)MX-QUAN，常州梅香儀器有限公司生產(chǎn)；離心機(jī)，型號(hào)TGL-19，四川蜀科儀器有限公司生產(chǎn)；粉碎機(jī)，型號(hào)FW-400A，北京中興偉業(yè)儀器有限公司生產(chǎn)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，型號(hào)41K30RA-C，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司生產(chǎn)。

1.2 熱水浸提法提取香菇多糖的工藝流程

先剔除干香菇中的雜質(zhì)，然后將香菇用刀切塊，用粉碎機(jī)打成粉，置于陰涼處備用。取10g香菇粉置于500mL燒杯中，按1∶40比例加入400mL蒸餾水，經(jīng)過(guò)90℃水浴加熱3h。水浴過(guò)程中用玻璃棒不斷攪拌，使其充分加熱。水浴后，用8層紗布將燒杯內(nèi)液體過(guò)濾，去除殘?jiān)?，濾液轉(zhuǎn)入另一燒杯中待用。將燒杯中濾液倒入旋轉(zhuǎn)濃縮儀上的圓底燒瓶中，用旋轉(zhuǎn)濃縮儀進(jìn)行濃縮，濃縮條件為-0.1MPa、70℃，濃縮后的溶液體積為原體積的1/4左右。用10000r/min離心機(jī)將濃縮液離心10min，將濃縮液轉(zhuǎn)移至燒杯中，除去殘留的雜物。在濃縮液中加入等體積的氯仿正丁醇溶液（體積比為4∶1），用玻璃棒充分?jǐn)嚢?min，靜置30min。將混合液體在5000r/min離心機(jī)下離心20min，分離水相。加入濃度為80%的酒精，用玻璃棒攪拌均勻后，靜置20min，在5000r/min離心機(jī)下離心20min。取出粗多糖，放入已稱重的干燥的表面皿中，在真空干燥箱中干燥（80℃，6h）。稱重，計(jì)算粗多糖的產(chǎn)率。稱取干燥后粗多糖10mg置于燒杯中加蒸餾水溶解，于250mL容量瓶中定容。取定容后的溶液2mL加入6%苯酚1mL，混合均勻，再慢慢加入濃硫酸5mL，充分混勻，放置20min后，用分光光度計(jì)于波長(zhǎng)490nm測(cè)吸光度。稱取葡萄糖10mg加蒸餾水溶解于燒杯，于250mL容量瓶中定容，分別取0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL、1.4mL、1.6mL及1.8mL，補(bǔ)水至2mL，加入6%苯酚1mL，混合均勻，再慢慢加入濃硫酸5mL，充分混勻，放置20min后，用分光光度計(jì)于波長(zhǎng)490nm測(cè)吸光度A，根據(jù)葡萄糖濃度和吸光度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)香菇多糖吸光度和葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算粗多糖純度。

1.3 香菇多糖抑菌試驗(yàn)流程

（1）制備牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基：準(zhǔn)確稱取蛋白胨10g、牛肉膏5g、氯化鈉5g，倒入1000mL蒸餾水中水浴加熱，用玻璃棒攪拌溶解，充分溶解。用酸度計(jì)檢測(cè)，用2%NaOH溶液或0.1moL/L檸檬酸溶液調(diào)節(jié)pH值至7.2，分裝在三角瓶中，包扎，高壓滅菌鍋滅菌（121℃濕熱滅菌15min），待用。（2）配制無(wú)菌生理鹽水：稱取9g NaCL溶于1000mL蒸餾水中，分裝在三角瓶中，加塞，包扎，高壓滅菌（121℃，15min），備用。（3）菌懸液制備：在無(wú)菌操作臺(tái)，用接種環(huán)挑取斜面培養(yǎng)基上1～2個(gè)大小適宜的菌落接種在液體培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)（37℃培養(yǎng)24h）即可得到一定濃度的菌懸液。在無(wú)菌環(huán)境中用無(wú)菌生理鹽水稀釋菌懸液，使菌懸液的吸光值分布在0.6～0.8之間，封口放置在4℃冰箱中保存?zhèn)溆?。?）不同時(shí)間香菇多糖對(duì)兩種菌的抑制作用：在無(wú)菌條件下，分別取稀釋過(guò)的菌懸液18mL置于試管中，用移液槍吸取400μL濃度為1g/L香菇多糖溶液，并用旋渦混勻器混勻后，在37℃搖床中培養(yǎng)，以不加香菇多糖溶液的菌懸液作對(duì)照，以蒸餾水作為空白對(duì)照。每隔12h測(cè)定1次菌懸液的吸光度值A(chǔ)，共測(cè)定4次，重復(fù)3次，取平均值，計(jì)算其抑菌率，確定最適作用時(shí)間。（5）不同pH值香菇多糖對(duì)兩種菌的抑制作用：在無(wú)菌條件下，分別取上述菌懸液18mL，用移液槍吸取400μL濃度為1g/L香菇多糖溶液，用酸度計(jì)檢測(cè)，用0.2moL/L檸檬酸或1.0%NaOH溶液調(diào)解菌懸液pH值為5、6、7、8、9，用旋渦混合器混勻后，在37℃搖床培養(yǎng)24h，以不加香菇多糖液的菌懸液作對(duì)照，以蒸餾水作空白對(duì)照，測(cè)其吸光度值A(chǔ)，重復(fù)3次，取平均值，計(jì)算出抑菌率，確定最適作用的pH值。（6）不同濃度香菇多糖對(duì)兩種菌的抑制作用：在上述最適條件下，用蒸餾水將香菇多糖溶液的濃度稀釋成1g/L、0.5g/L、0.25g/L、0.125g/L、0.0625g/L。在超凈工作臺(tái)中，分別取上述菌懸液18mL，用移液槍吸取不同濃度的香菇多糖液400μL，用旋渦混合器混勻，在37℃搖床培養(yǎng)24h，以不加香菇多糖液的菌懸液作對(duì)照，以蒸餾水作空白對(duì)照，測(cè)其吸光度值A(chǔ)，重復(fù)3次，取平均值，并計(jì)算出抑菌率。

抑菌率（%）=｛［菌懸液吸光度值-（菌懸液加多糖吸光度值-多糖的吸光度值）］/菌懸液吸光度值］｝×100。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖1為葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)香菇多糖吸光度和葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出粗多糖純度為42.15%。

2.2 不同時(shí)間對(duì)香菇多糖抑菌性能的影響

由圖2可知，香菇多糖對(duì)大腸桿菌和枯草芽孢桿菌都有明顯的抑制作用，但抑菌效果達(dá)到峰值的時(shí)間有所差異。對(duì)枯草芽孢桿菌的抑制作用在12h時(shí)達(dá)到最大，對(duì)大腸桿菌的抑菌效果在24h時(shí)達(dá)到最大，并且對(duì)大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的抑菌率均達(dá)到90%以上，但隨著時(shí)間的推移，香菇多糖的抑菌性能不斷減弱。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 不同時(shí)間對(duì)香菇多糖抑菌性能的影響

2.3 不同pH值對(duì)香菇多糖抑菌性能的影響

由圖3可知，不同pH值條件下，香菇多糖對(duì)大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的抑菌性能有少許不同。pH值為5時(shí)，香菇多糖對(duì)兩種菌的抑菌效果均為峰值，達(dá)到了100%，隨著pH值增大，香菇多糖對(duì)大腸桿菌的抑菌效果明顯降低，而對(duì)枯草芽孢桿菌的抑菌效果沒(méi)有顯著變化。

2.4 不同濃度對(duì)香菇多糖抑菌性能的影響

根據(jù)圖2和圖3確定了香菇多糖的最佳抑菌條件，由圖4可知，隨著香菇多糖溶液濃度的升高，其對(duì)大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的抑菌性能均逐漸增大，當(dāng)香菇多糖溶液的濃度達(dá)1g/L時(shí)，抑菌率分別達(dá)100%和95%左右。

圖3 不同pH值對(duì)香菇多糖抑菌性能的影響

圖4 不同濃度對(duì)香菇多糖抑菌性能的影響

3 小結(jié)

本試驗(yàn)采用熱水浸提法從干香菇中提取活性多糖，通過(guò)苯酚硫酸法繪制葡萄糖的濃度與吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出粗多糖的純度，采用分光光度法測(cè)定了香菇多糖在不同條件下的抑菌活性。用熱水浸提法提取香菇多糖提取率為3.2%，純度為42.15%。香菇多糖對(duì)大腸桿菌和枯草芽孢桿菌均有一定的抑制作用，對(duì)大腸桿菌抑制效果在24h時(shí)達(dá)到最大，對(duì)枯草芽孢桿菌抑菌效果在12h時(shí)達(dá)到最大。對(duì)兩種菌的抑菌效果，酸性條件下好于堿性條件下。不同濃度的香菇多糖對(duì)兩種菌的抑制效果有所不同，但都隨著香菇多糖溶液濃度的升高而升高。