侯文思，李玉潔，王媛媛，陶 虎

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 理學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.西北農(nóng)林科技大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

東方粘蟲(chóng)中腸V-ATP酶A亞基突變體TSCA的原核表達(dá)及復(fù)性純化

侯文思1，李玉潔1，王媛媛2，陶 虎1

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 理學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.西北農(nóng)林科技大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

根據(jù)得到的東方粘蟲(chóng)[Mythimnaseparate(Walker)]中腸V-ATPase A亞基(VHA-A)基因(VATPA)，預(yù)測(cè)其三維結(jié)構(gòu)，構(gòu)建定點(diǎn)突變并復(fù)性。利用Swiss-Model在線預(yù)測(cè)VHA-A三維結(jié)構(gòu)，確定突變位點(diǎn)，通過(guò)重折疊PCR(Overlap-PCR)技術(shù)構(gòu)建突變基因并將其整合到pET-22b(+)載體上，得到重組質(zhì)粒pET-22b(+)-TSCA，轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21中表達(dá)，最后通過(guò)親和層析純化包涵體蛋白質(zhì)并進(jìn)行透析復(fù)性。結(jié)果表明，成功構(gòu)建突變基因和融合表達(dá)載體，融合蛋白質(zhì)以包涵體形式表達(dá)，并得到大量純化的可溶性蛋白。

V-ATP酶A亞基；定點(diǎn)突變；原核表達(dá)；包涵體復(fù)性

液泡型ATP酶(V-ATPase)是由14個(gè)不同亞基組成的復(fù)合體，作為持家基因廣泛分布于細(xì)胞膜系統(tǒng)中[1]。V-ATPase利用水解ATP釋放能量將H+轉(zhuǎn)運(yùn)到囊泡或胞外，從而維持胞質(zhì)pH的平衡，形成跨膜電化學(xué)勢(shì)梯度，為細(xì)胞活動(dòng)的正常進(jìn)行及各種離子和代謝物的轉(zhuǎn)運(yùn)提供必不可少的條件[2]。在昆蟲(chóng)中腸，V-ATPase存在于上皮杯狀柱細(xì)胞，是唯一的離子運(yùn)輸啟動(dòng)器，嚴(yán)格調(diào)控昆蟲(chóng)中腸的離子運(yùn)輸[3]。V-ATPase的缺失會(huì)導(dǎo)致昆蟲(chóng)出現(xiàn)病理變化甚至死亡[4]。近年來(lái)越來(lái)越多的學(xué)者將V-ATP酶作為藥物靶標(biāo)來(lái)研究[5]。已有學(xué)者利用Western雜交和質(zhì)譜等方法鑒定出多種昆蟲(chóng)中腸的V-ATP酶A亞基可以和蘇云金芽孢桿菌[Bacillusthuringiensis(Bt)]毒素結(jié)合。徐麗娜[6]通過(guò)雙向凝膠電泳、配體雜交等方法發(fā)現(xiàn)亞洲玉米螟[Ostriniafurnacalis(Guenée)]幼蟲(chóng)刷狀緣膜囊(Brush border membrane vesicles，BBMV )的V-ATP酶A亞基是Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1Ah、Cry1Ie蛋白的結(jié)合位點(diǎn)。V-ATPase A 亞基是高度保守的催化亞基[7]，研究表明A亞基上walker A motif (GXXXXGKT) 特定殘基具有重要作用：將極端嗜熱桿菌V-ATPase A亞基第232位絲氨酸突變?yōu)楸彼?，?35位蘇氨酸突變?yōu)榻z氨酸能夠降低ADP反饋抑制，提高全酶催化活性[8]。目前，V-ATPase A亞基的重組表達(dá)已有文獻(xiàn)報(bào)道，如靳婷婷等[9]構(gòu)建原核表達(dá)載體在大腸桿菌中表達(dá)玉米螟幼蟲(chóng)中腸A亞基。已有的文獻(xiàn)[10-11]均顯示，原核表達(dá)的V-ATPase A亞基在大腸桿菌中均以包涵體形式存在，而利用真核系統(tǒng)表達(dá)蛋白質(zhì)代價(jià)昂貴。本研究通過(guò)分析東方粘蟲(chóng)[Mythimnaseparata(Walker)]中腸V-ATP酶A亞基核酸結(jié)合區(qū)域，篩選可能提高酶活力的氨基酸位點(diǎn)，進(jìn)行基因定點(diǎn)突變，通過(guò)原核表達(dá)、包涵體復(fù)性等方法獲得大量可溶性蛋白質(zhì)，為進(jìn)一步研究東方粘蟲(chóng)A亞基的結(jié)構(gòu)與功能奠定基礎(chǔ)，也為相關(guān)抑制劑的開(kāi)發(fā)和篩選新農(nóng)藥奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒 表達(dá)載體pET-22b(+)和大腸桿菌Turbo、BL21(DE3) 為西北農(nóng)林科技大學(xué)理學(xué)院蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)研究實(shí)驗(yàn)室保存；克隆載體pMD 19-T-Simple購(gòu)自TaKaRa公司；質(zhì)粒pET-22b(+)-VATPA由西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)藥所提供。

1.1.2 主要生化試劑TaqDNA Polymerase、T4DNA Ligase、限制性內(nèi)切酶NdeⅠ、HindⅢ、DNA Marker、核酸酶均購(gòu)于TaKaRa公司；Pfu DNA Polymerase、蛋白質(zhì)Markers購(gòu)于Thermo公司；膠回收試劑盒、廣譜蛋白Markers購(gòu)于康為世紀(jì)公司；Bradford試劑盒購(gòu)于天根生化科技有限公司；Ni-NTA agarose柱購(gòu)于GE公司；其他相關(guān)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純，購(gòu)自楊凌三力化玻站。

1.2 方 法

1.2.1 原核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定 以嗜熱桿菌(Thermusthermophiles,PDB:3GQ)A亞基氨基酸序列及其突變體TSSA為模板，利用NCBI Blast軟件，與東方粘蟲(chóng)中腸V-ATPase酶A亞基序列比較，確定東方粘蟲(chóng)中腸V-ATPase A亞基突變位點(diǎn)。根據(jù)選定的突變點(diǎn)C254突變?yōu)锳254，T257突變?yōu)镾257，設(shè)計(jì)引物(小寫(xiě)部分為突變位點(diǎn)氨基酸對(duì)應(yīng)密碼子)(表1)。

表1 重折疊PCR引物序列Table 1 Primers for Overlap-PCR

利用overlap PCR方法構(gòu)建定點(diǎn)突變基因[12]，以pET-22b(+)-VATPA質(zhì)粒為模板，引物F、RM，F(xiàn)M、R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分別擴(kuò)增出上下游片段A、B；以等量的A、B基因?yàn)槟０?，引物F、R進(jìn)行PCR擴(kuò)增并回收。將回收的PCR產(chǎn)物加A尾后與pMD19-T-Simple連接，轉(zhuǎn)化至E.coliTurbo，提取質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒與pET-22b(+)載體均進(jìn)行NdeⅠ、HindⅢ雙酶切并連接，得到表達(dá)載體pET-22b(+)-TSCA，轉(zhuǎn)入E.coliTurbo，挑取單克隆進(jìn)行PCR驗(yàn)證后測(cè)序。

1.2.2 目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 將測(cè)序結(jié)果正確的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3) 感受態(tài)細(xì)胞，并將其涂布于含氨芐青霉(Amp)的LB平板，過(guò)夜培養(yǎng)。挑取陽(yáng)性單克隆于5 mL含100 mg/L Amp的新鮮LB培養(yǎng)液中37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)。次日以1% 接種量接種至50 mL含100 mg/L Amp的LB培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)至OD600≈ 0.6時(shí)，將培養(yǎng)物以每管5 mL分裝于4個(gè)無(wú)菌15 mL EP管中，分別加入異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度為0.1、0.2、0.5和1 mmol/L，于37 ℃誘導(dǎo)表達(dá)4 h。 6 000 r/min、4 ℃離心5 min 收集菌體，用PBS緩沖液重懸，超聲破碎，于12 000 r/min、4 ℃離心30 min，分別取37 ℃誘導(dǎo)上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。

1.2.3 蛋白質(zhì)復(fù)性與純化 參照文獻(xiàn)[13]，在37 ℃ 條件下以0.2 mmol/L的IPTG終濃度大量誘導(dǎo)(1 L液體LB培養(yǎng)基) pET-22b(+)-TSCA在大腸桿菌BL21中表達(dá)5 h，離心取菌體，用Lysis buffer(20 mmol/L Tris-HCl , 150 mmol/L NaCl pH 7.0)重懸，加溶菌酶至150 μg/mL，冰浴30 min，超聲破碎，加入0.5倍體積含15 g/L Triton X-100的洗滌液(100 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，pH 7.0)攪拌混勻，12 000 r/min、4 ℃ 離心30 min，棄上清。將沉淀用35 mL含5 g/L Triton X-100的洗滌液重懸，再用勻漿器研磨15 min，12 000 r/min、4 ℃ 離心30 min，棄上清。用不含Triton X-100的洗滌液重復(fù)上述步驟2次。洗滌后將包涵體溶解于35 mL溶解液(100 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L DTT，8 mol/L 尿素，pH 8.0)中，室溫?cái)嚢?～3 h，12 000 r/min，4 ℃離心30 min，取上清，用0.22 μm濾膜過(guò)濾后溶液即為包涵體蛋白液。pET-22b(+)表達(dá)的融合蛋白C端含有一個(gè)His-tag，可使用Ni-NTA親和層析純化變性后包涵體蛋白。用結(jié)合緩沖液(100 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L DTT，8 mol/L 尿素，pH 8.0)平衡Ni-NTA層析柱，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)樣品pH至8.0，以1.5 mL/min流速上樣，用洗滌緩沖液(100 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L DTT，8 mol/L 尿素，pH=6.3)洗去雜蛋白，用洗脫緩沖液(100 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L DTT，8 mol/L 尿素，pH 4.5)洗脫目的蛋白。收集的洗脫液用Bradford試劑盒測(cè)蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度后于-80 ℃ 凍存。取適當(dāng)體積Ni-NTA純化后蛋白質(zhì)樣品用新鮮溶解液稀釋至終體積100 mL，終質(zhì)量濃度0.1～0.2 mg/mL。稀釋后的蛋白質(zhì)樣品于復(fù)性緩沖液Ⅰ(1 mol/L L-精氨酸，1 mmol/L DTT，50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0)4 ℃透析24 h，12 000 r/min，4 ℃離心30 min，上清繼續(xù)用復(fù)性緩沖液Ⅱ (20 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，1 mmol/L DTT，1 mmol/L 苯甲脒，pH 7.3)透析12 h，換新鮮溶液Ⅱ繼續(xù)透析，12 000 r/min，4 ℃離心 30 min，上清為復(fù)性成功的蛋白質(zhì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 同源建模和突變位點(diǎn)的選擇

選用與蛋白一級(jí)序列相似度最高(一致性65.24%)且已獲得3D蛋白結(jié)構(gòu)的酵母V-ATP酶A亞基( PBD:3J9T )為模板，利用Swiss-Model( http://swissmodel.expasy.org/interactive )軟件進(jìn)行同源建模，獲得東方粘蟲(chóng)中腸V-ATPase A亞基三維結(jié)構(gòu)模型(圖1)。

圖1 東方粘蟲(chóng)中腸V-ATPase A亞基三維結(jié)構(gòu)模擬圖Fig.1 Simulative tertiary structure ofMythimna separata subunit A

2.2 原核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

提取重組質(zhì)粒pET-22b(+)-TSCA轉(zhuǎn)入E.coliTurbo后，挑取陽(yáng)性克隆并提取質(zhì)粒，進(jìn)行PCR驗(yàn)證，電泳條帶與預(yù)期大小一致(圖2)，且質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果正確，重組質(zhì)粒pET-22b(+)-TSCA構(gòu)建成功。

M. DM 2000 DNA marker；1. pET-22b(+)-TSCA的PCR結(jié)果 Result of pET-22b(+)-TSCA gene by PCR

圖2 PCR驗(yàn)證pET-22b(+)-TSCA表達(dá)載體

Fig.2 Identification of pET-22b(+)-TSCA expression vector by PCR

2.3 融合蛋白的表達(dá)

將測(cè)序驗(yàn)證正確的pET-22b(+)-TSCA表達(dá)載體轉(zhuǎn)入BL21(DE3)表達(dá)菌株中，在37 ℃不同IPTG終濃度誘導(dǎo)該蛋白質(zhì)表達(dá)。融合蛋白分子質(zhì)量理論值約為69.7 ku，目的蛋白與廣譜蛋白標(biāo)準(zhǔn)比對(duì)條帶位置正確(圖3)。且不同誘導(dǎo)劑濃度下，菌體超聲破碎后的上清液中均沒(méi)有明顯的目的條帶，沉淀中有明顯的目的蛋白條帶。這表明絕大多數(shù)的蛋白以包涵體形式存在，且IPTG終濃度為0.2 mmol/L時(shí)沉淀中目的蛋白含量最大。

M. 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量 Protein molecular weight marker; 1. 未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的細(xì)胞總蛋白質(zhì) Total cell proteins without induced by IPTG；2-9:不同濃度IPTG誘導(dǎo)后的上清液和沉淀，IPTG濃度分別為0.1 mmol/L、0.2 mmol/L、0.5 mmol/L和1 mmol/L Supernatant and pellet induced by IPTG，and the inducer concentrations were 0.1 mmol/L, 0.2 mmol/L, 0.5 mmol/L and 1 mmol/L

圖3 37 ℃下不同濃度IPTG表達(dá)蛋白的鑒定

Fig.3 Identification of TSCA expression at 37 ℃ under different IPTG concentration

2.4 包涵體的純化與復(fù)性

細(xì)胞裂解后的包涵體蛋白質(zhì)用Triton X-100處理，再利用Ni-NTA層析柱純化，上樣后用洗雜蛋白液洗去部分雜蛋白(圖4-A、4-B)。透析液Ⅱ透析后的蛋白質(zhì)為復(fù)性好的可溶性蛋白質(zhì)，經(jīng)10% SDS-PAGE檢測(cè)為一條帶，且條帶位置與理論分子質(zhì)量一致(圖4-C)。包涵體用8 mmol/L尿素溶解后，用bradford試劑盒測(cè)粗蛋白質(zhì)樣品，其質(zhì)量濃度為4.13 mg/mL，體積約為35 mL。復(fù)性好的蛋白質(zhì)經(jīng)Bradford蛋白質(zhì)點(diǎn)定量試劑盒測(cè)得質(zhì)量濃度約為48 μg/mL，體積約為110 mL，一次復(fù)性效率約53%。培養(yǎng)1 L菌體最終可獲得純蛋白質(zhì)約67 mg。

A. pET-22b(+)-TSCA融合蛋白表達(dá)分析 Analysis of the expression of pET-22b(+)-TSCA (M.蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分子量 Protein molecular weight marker ; 1.未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的細(xì)胞總蛋白質(zhì) Total cell proteins without induced by IPTG ; 2.IPTG誘導(dǎo)的細(xì)胞總蛋白質(zhì) Total cell proteins induced by IPTG ; 3.細(xì)胞裂解后上清 Supernatant proteins of cell disruption ; 4.細(xì)胞裂解后沉淀 Pellet of cell disruption；5.洗滌后包涵體 Washed inclusion bodies); B.目的蛋白的純化檢測(cè) SDS-PAGE of the purified proteins (M.蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分子量 Protein molecular weight marker ; 1.Ni-NTA純化后蛋白質(zhì) Recombinant protein purified by Ni-NTA ); C.復(fù)性蛋白質(zhì)的檢測(cè) Analysis of the refolded proteins (M.蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分子量 Protein molecular weight marker ; 1.重折疊蛋白質(zhì) Refolded proteins)

圖4 TSCA誘導(dǎo)表達(dá)與純化檢測(cè)

Fig.4 SDS-PAGE analysis of the expression and the purification of recombinant proteins

3 結(jié)論與討論

V-ATPase廣泛存在于真核細(xì)胞的內(nèi)膜系統(tǒng)上，由胞內(nèi)的V1結(jié)構(gòu)域和鑲嵌在膜上的V0結(jié)構(gòu)域組成[14]。V 1由A～H 8個(gè)亞基組成，具有ATP水解作用；V0由a、d、e、c和c′′亞基組成，負(fù)責(zé)質(zhì)子運(yùn)輸。酵母包含1個(gè)額外的亞基c′[15]，更高級(jí)的真核生物則有額外的蛋白質(zhì)Ac45[16]。V-ATPase A亞基是催化亞基[17]，由4個(gè)結(jié)構(gòu)域組成：N端的β桶狀結(jié)構(gòu)域，包含凸起的非同源結(jié)構(gòu)域；中心的α/β結(jié)構(gòu)域和C端結(jié)構(gòu)域[18]。C端結(jié)構(gòu)域包含Walker A motif、Walker B motif。Walker A motif與核酸結(jié)合有關(guān)，而Walker B motif與天冬氨酸介導(dǎo)的Mg2+反應(yīng)有關(guān)[19-20]。

本試驗(yàn)通過(guò)預(yù)測(cè)V-ATPase A亞基蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)，同源比對(duì)確定突變位點(diǎn)，利用over-lap PCR等分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建突變工程菌。在前期，對(duì)誘導(dǎo)溫度、時(shí)間和IPTG濃度進(jìn)行摸索，期望能得到更多的可溶性蛋白質(zhì)，但結(jié)果目的蛋白質(zhì)絕大多數(shù)以包涵體形式存在?？赡苁且?yàn)樵吮磉_(dá)系統(tǒng)缺乏引導(dǎo)多肽正確折疊的分子伴侶或者調(diào)解機(jī)制，使得蛋白質(zhì)無(wú)法正確折疊，失去原有特性和功能，最終以包涵體形式存在。本試驗(yàn)最終決定通過(guò)復(fù)性獲得可溶性目的蛋白，考慮到純化方法和復(fù)性步驟，選用pET-22b(+)構(gòu)建表達(dá)載體，采取一步透析法，在透析液pH 8.0，添加終濃度為1 mol/L的L-精氨酸，獲得高收率的可溶性蛋白質(zhì)。本試驗(yàn)1 L菌體最終可得到67 mg左右較純的可溶性蛋白質(zhì)，復(fù)性效率為53%，為后續(xù)研究V-ATP酶活性，A亞基的功能和結(jié)構(gòu)，利用突變體TSCA篩選ATP酶抑制劑提供條件。

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(責(zé)任編輯：郭柏壽 Responsible editor:GUO Baishou)

Prokaryotic Expression, Refolding and Purification of V-ATPase Subunit A Mutant TSCA in the Midgut ofMythimnaseparate

HOU Wensi1, LI Yujie1, WANG Yuanyuan2and TAO Hu1

(1.College of Science, Northwest A&F University, Yangling Shaanxi 712100, China;2.College of Life Sciences, Northwest A&F University, Yangling Shaanxi 712100,China)

Based on V-ATPase A subunit gene(VATPA) in the midgut ofMythimnaseparate, three-dimensional structure was predicted, site-directed mutant was built and recombinant protein was obtained after renaturing.The protein structure of VHA-A was analyzed, three-dimensional structure was predicted by Swiss-Model online,and the mutation site was designed.The mutant gene was constructed with overlap PCR, and inserted into pET-22b(+) vector. The recombinant plasmid pET-22b(+)-TSCA was transformed intoE.coliBL21(DE3) for expression. After purified by Ni-NTA column, the inclusion body was renatured. The results showed the recombinant plasmid was successfully built, the fusion proteins were expressed as inclusion bodies, and the soluble proteins were successfully obtained in large scale.The study will facilitate the investigation of structure and function of V-ATPase subunit A and creation of environmental friendly pesticides.

V-ATPase subunit A; Designated mutation; Protein prokaryotic expression; Refolding of inclusion body

2016-05-29 Returned 2016-06-15

Special Talent Recruitment Fund of Northwest A&F University(No.Z111021101); the National Natural Science Foundation of China(No.21403168 )

HOU Wensi, female, master student. Research area:protein expression and purification. E-mail:956850986@qq.com

TAO Hu, male, professor, master supervisor.Research area:protein-protein interaction and structural resolution. E-mail:taohu@nwsuaf.edu.cn

日期：2017-08-18

2016-05-29

2016-06-15

西北農(nóng)林科技大學(xué)引進(jìn)人才專項(xiàng)資金(Z111021101 )；國(guó)家自然科學(xué)基金(21403168)。 第一作者：侯文思，女，碩士研究生，從事蛋白質(zhì)表達(dá)和純化研究。E-mail:956850986@qq.com

陶 虎，男，教授，碩士生導(dǎo)師，從事蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)研究。E-mail：taohu@nwsuaf.edu.cn

Q786

A

1004-1389(2017)08-1248-05

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20170818.0939.040.html