洪自兵，孫潔瓊，劉 梅，王 可，李 森，姚向陽(yáng)

（蚌埠學(xué)院 食品與生物工程學(xué)院，安徽 蚌埠 233030）

決明子多糖酵母微囊制備條件優(yōu)化及對(duì)HepG2細(xì)胞抑制作用研究

洪自兵，孫潔瓊，劉 梅，王 可，李 森，姚向陽(yáng)*

（蚌埠學(xué)院 食品與生物工程學(xué)院，安徽 蚌埠 233030）

以包埋時(shí)間、加水量、芯材比、包埋溫度為正交實(shí)驗(yàn)的因素考察對(duì)決明子多糖微囊化的影響。結(jié)果顯示包埋時(shí)間6小時(shí)、加水量 4mL、芯材比為3∶1（g/g）和包埋溫度 40℃，決明子多糖微囊的包埋率為 49.3%。HepG2細(xì)胞在決明子多糖酵母微囊（100mg/mL）中的MTT生存率是46.9%，LDH活性是176.9%，且HepG2細(xì)胞會(huì)皺縮、分離。

決明子多糖；酵母微囊；正交實(shí)驗(yàn)；HepG2細(xì)胞；抑制作用

0 引言

決明子味苦、甘、咸，具降壓、降脂、保肝、抗菌的功效[1]。決明子多糖是決明子重要的藥理活性物質(zhì)。決明子多糖具有降血脂[2-3]，增強(qiáng)動(dòng)物的免疫[4-5]和抗氧化作用[6]。

酵母微囊為球形或橢球形，粒徑一般在幾微米到二十微米，可分散到不同的體系中。決明子多糖分子量大，不易吸收，將其制成微囊避免在發(fā)揮藥效前被降解，延長(zhǎng)了藥效，提高了生物利用率[7-8]。本研究首先通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)，確定時(shí)間、加水量、芯材比和溫度與包埋率的關(guān)系，設(shè)計(jì)四因素三水平正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化決明子多糖酵母微囊制備工藝。檢測(cè)決明子多糖酵母微囊對(duì)HepG2細(xì)胞MTT和LDH活性及形態(tài)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

決明子 (亳州市祥云養(yǎng)生堂花茶有限公司)，酵母粉（安琪），MTT（Sigma），LDH 試劑盒（南京建成），木瓜蛋白酶（南寧龐博生物工程有限公司），其他試劑為分析純。

恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)箱（上海智城分析儀器制造有限公司），真空干燥機(jī)（Eppendorf），超聲波提取儀，酶標(biāo)儀（Thermo Fisher Scientific），倒置顯微鏡（AE2000，配佳能數(shù)碼相機(jī)），鼓風(fēng)干燥箱，粉碎機(jī)，電子天平，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，高速冷凍離心機(jī)。

1.2 方法

1.2.1 決明子多糖提取工藝流程

取決明子藥材于烘箱中烘干（50℃，24 h），粉碎，過(guò)80目篩。取20 g藥材粉末以石油醚脫脂6 h，紗布過(guò)濾，揮干。加入蒸餾水（1∶25），于 80℃下浸泡 30min，再于 200 W 的條件下超聲輔助提取30min。離心，取上清液，加入木瓜蛋白酶（取藥材量1/50），60℃下酶解2 h，離心，取上清液，按5∶1的比例加入Sevage試劑，多次萃取離心除去蛋白。取清液按1∶1比例加入 15%雙氧水溶液脫色處理6 h，濃縮，再用無(wú)水乙醇醇沉后（水提液與乙醇按1∶3比例加入）置于4℃冰箱中過(guò)夜，在5000 r/min下離心10min得沉淀；用丙酮20mL及乙醚重復(fù)洗滌2次，自然晾干，再放入烘箱（50℃，24 h），烘干，碾碎，得多糖成品[10]。最后得到多糖成品1.086 6 g，決明子多糖提取率為5.43%。

1.2.2 決明子多糖含量測(cè)定

取無(wú)水葡萄糖5mg，配置成0.1mg/mL的葡糖糖溶液[9]。再分別吸取 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL上述葡萄糖溶液置10mL刻度試管中，分別加蒸餾水1mL和1mL 5%苯酚溶液，混勻后快速加入5mL濃硫酸，使反應(yīng)液充分混合，然后將試管置于40℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中反應(yīng)30min，取出冷卻，加水至10mL，于490 nm測(cè)吸光度[11]。根據(jù)吸光度值(y)和標(biāo)準(zhǔn)葡糖糖溶液濃度(x)得到回歸方程：y=1.091 4x-0.000 9，R2=0.997 3。取0.01 g決明子多糖，配置成50mL決明子多糖溶液，再取1mL決明子多糖溶液重復(fù)上述步驟操作，根據(jù)回歸方程，計(jì)算多糖含量。

1.2.3 決明子多糖酵母微囊的制備

稱(chēng)取50.0 g干酵母并加入蒸餾水，在35℃下攪拌20 h。向復(fù)蘇后的酵母溶液中加入5%的氫氧化鈉溶液，于54℃，150 r/min，振蕩24 h，離心收集的沉淀，冷凍干燥。將處理好的酵母細(xì)胞放入燒杯中，將一定量的決明子多糖粉末加入燒杯中，然后加入蒸餾水混合搖勻，封口后放入恒溫培養(yǎng)振蕩器。在恒溫振蕩器中處理一定時(shí)間后取出燒杯，將混合液在4200 r/min下離心15min，得沉淀，洗去未包入的多糖，真空干燥器（40℃）干燥1 h。根據(jù)文獻(xiàn)[10]計(jì)算酵母微囊中決明子多糖包埋率，公式為：

式中：Y為決明子多糖包埋率/%；mA為加入干酵母質(zhì)量/g；mB為收集決明子酵母微囊總質(zhì)量/g。

1.2.4 MTT和LDH法檢測(cè)細(xì)胞生存率

將細(xì)胞（105個(gè)細(xì)胞/孔）接種到96孔平板中12 h，用各種濃度的決明子多糖和決明子多糖酵母微囊處理，采用MTT測(cè)定法在570 nm處測(cè)量吸光度。用南京建成試劑盒測(cè)量培養(yǎng)基中的LDH水平，記錄在420 nm處的吸光度，用于計(jì)算 Mutiskan Go（Thermo，INC）下的 LDH活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 包埋時(shí)間對(duì)決明子多糖酵母微囊包埋率的影響

取0.06 g的決明子多糖和0.02 g處理后的酵母及6mL蒸餾水于燒杯中，振蕩使其均勻，封蓋之后放入搖床中，轉(zhuǎn)速為100 r/min。不同時(shí)間下，決明子多糖酵母微囊包埋率如圖1。

圖1 包埋時(shí)間對(duì)決明子多糖酵母微囊包埋率的影響

由圖1可知，隨時(shí)間的不斷增加，決明子多糖酵母微囊包埋率也在不斷加大，6 h后，包埋率上升趨勢(shì)平緩，所以最佳包埋時(shí)間為6 h。

2.1.2 加水量對(duì)決明子多糖酵母微囊包埋率的影響

取0.06 g的決明子多糖和0.02 g處理后的酵母及蒸餾水于燒杯中，振蕩使其均勻，封蓋之后放入搖床中6 h，轉(zhuǎn)速為100 r/min。不同量蒸餾水下決明子多糖酵母微囊包埋率見(jiàn)圖2。

圖2 加水量對(duì)決明子多糖酵母微囊包埋率的影響

由圖2可知，隨加水量的不斷增加，決明子多糖擴(kuò)散進(jìn)入酵母的量先增加后減小，當(dāng)加水量為6mL時(shí)，決明子多糖的包埋率最大。

2.1.3 芯材比對(duì)決明子多糖酵母微囊包埋率的影響

取不同量的決明子多糖和0.02 g處理后的酵母及6mL蒸餾水于燒杯中，振蕩使其均勻，封蓋之后放入搖床中6 h，轉(zhuǎn)速為100 r/min。不同的芯材比下決明子多糖的包埋率見(jiàn)圖3。

圖3 芯材比對(duì)決明子多糖酵母微囊包埋率的影響

由圖3可知：隨芯材比的逐漸加大，決明子多糖的濃度也不斷變大，從而使決明子多糖進(jìn)入酵母的速率變大即包埋率變大了；當(dāng)芯材比為3∶1時(shí)，決明子多糖進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的濃度已達(dá)到飽和，包埋率不再增加。

2.1.4 溫度對(duì)決明子多糖包埋率的影響

取0.06 g的決明子多糖和0.02 g處理后的酵母及6mL蒸餾水于燒杯中，振蕩使其混合均勻，封蓋之后放入搖床中6 h，轉(zhuǎn)速為100 r/min。不同溫度下決明子多糖包埋率如圖4。

圖4 溫度對(duì)決明子多糖包埋率的影響

由圖可知溫度對(duì)決明子多糖酵母微囊包埋率的影響是先增加后很少，40℃時(shí)包埋率達(dá)到最高。

2.2 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用4因素3水平的正交實(shí)驗(yàn)，四個(gè)因素為時(shí)間、加水量、芯材比以及溫度。結(jié)果如下：

表1 因素與水平表

表2 L9(34)正交試驗(yàn)

表3 方差分析

本試驗(yàn)的最優(yōu)組合為A3B1C3D2，即40℃、6 h、芯材比為3∶1，4mL蒸餾水。正交試驗(yàn)得到的最優(yōu)包埋率為55.0%，3次驗(yàn)證試驗(yàn)，得到的平均包埋率是49.3%。極差和方差分析說(shuō)明溫度是包埋率的主要影響因素，實(shí)驗(yàn)中部分組別多糖包埋率不是很高，可能的原因?yàn)椴捎玫陌癖诓臑榛钚暂^低的干酵母。 Ciamponi報(bào)道酵母活性影響微囊化過(guò)程[11]。另一個(gè)原因可能是決明子多糖純度不高，含雜質(zhì)蛋白或多酚，文獻(xiàn)報(bào)道可使用聚乙烯聚吡咯烷酮（PVPP）純化多糖，提高包埋率[12]。

2.3 決明子多糖酵母微囊對(duì)HepG2細(xì)胞生存率的影響

為探討決明子多糖酵母微囊對(duì)HepG2細(xì)胞生存率的影響，HepG2細(xì)胞用不同濃度的決明子多糖酵母微囊處理24 h，如圖5a所示，決明子多糖及決明子多糖酵母都能抑制HepG2生存率（CP 50：76.8%，CP 100：64.1%，CPYM50：56.3%，CPYM100：46.9%），但決明子多糖酵母比決明子多糖的抑制效果好（CP50：76.8%，CP100：64.1%，CPYM50：56.3% ，CPYM100：46.9%)。LDH降低經(jīng)常被用于評(píng)估細(xì)胞損傷程度。決明子多糖酵母比決明子多糖更能增加LDH水平（133.4%，140.1%，167.9%，176.9%）（圖5b）。

圖5 決明子多糖酵母微囊對(duì)HepG2細(xì)胞生存率的影響

2.4 決明子多糖酵母微囊對(duì)HepG2細(xì)胞形態(tài)的影響

顯微觀察顯示決明子多糖和決明子多糖酵母微囊被處理24 h后，都能引起HepG2細(xì)胞皺縮、脫離（圖6）。表明決明子多糖和決明子多糖酵母均可抑制HepG2細(xì)胞的生長(zhǎng)。這些結(jié)果一致于MTT和LDH實(shí)驗(yàn)。很多多糖具有抗腫瘤活性[13]，但多糖易吸濕、對(duì)酸堿、金屬離子不穩(wěn)定，多糖的微囊化處理是克服這些缺點(diǎn)的重要方法。Paramera等報(bào)道酵母微囊化處理的姜黃素比環(huán)糊精或改性淀粉包合的更能保護(hù)有害的光化學(xué)反應(yīng)和熱降解[14]。微囊化姜黃素與游離姜黃素相比，能增強(qiáng)體外抗HepG2細(xì)胞活性[15]。我們的結(jié)果也顯示酵母微囊化的決明子多糖比沒(méi)有包被的更能抑制HepG2細(xì)胞的活性。

圖6 決明子多糖酵母微囊對(duì)HepG2細(xì)胞形態(tài)的影響

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，決明子多糖酵母微囊正交優(yōu)化的最佳工藝為即40℃、6 h、芯材比為3∶1，4mL水，包埋率平均為49.3%。在決明子多糖酵母微囊（100mg/mL）條件下，HepG2細(xì)胞MTT生存率是46.9%，LDH活性是176.9%，HepG2會(huì)細(xì)胞皺縮、分離。本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化制備的決明子多糖酵母微囊對(duì)HepG2細(xì)胞有一定的抑制作用。

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Optimization of Preparation Conditions of Cassia Polysaccharide Yeast Microcapsules and its Inhibitory Effect Research on HepG2 Cells

HONG Zibinɡ，SUN Jieqionɡ，LIU Mei，WANG Ke，LI Sen，YAO Xiɑnɡyɑnɡ
（School of Food and Biology Engineering，Bengbu University，Bengbu Anhui 233030，China）

The effects of embedding time，water addition，core ratio and embedding temperature on the microencapsulation of cassia polysaccharide were investigated by orthogonal experiment.The analysis shows that:When the embedding time is 6 hours and the amount of water is 6mL，the ratio of core to material is 3∶1（g/g）.Meanwhile，when the embedding temperature is 40℃，the embedding rate of cassia polysaccharide microcapsules is 49.3%.Besides，the research shows that the survival rate of HepG2 cells for cassia polysaccharide yeast microcapsules is 46.9%.At the same time，the LDH activity is 176.9%which could cause the shrinkage and separation of the HepG2 cells.

Cassia Polysaccharide；Yeast Microcapsule；Orthogonal Experiment；HepG2 Cell；Inhibiting Effect

R283

A

1009-8666（2017）08-0015-06

［責(zé)任編輯、校對(duì)：李書(shū)華］

10.16069/j.cnki.51-1610/g4.2017.08.004

2017-06-11

大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項(xiàng)目“決明子多糖膠囊制備及體外降脂分析”（201511305027）；安徽省教育廳高校自然科學(xué)重點(diǎn)項(xiàng)目“蒲公英萜醇調(diào)控STAT3通路和自噬功能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡的機(jī)制研究”（KJ2014A149）

洪自兵（1996—），男，安徽蕪湖人。蚌埠學(xué)院食品與生物工程學(xué)院制藥工程專(zhuān)業(yè)2014級(jí)本科生。

*通信作者：姚向陽(yáng)（1972—），男，安徽合肥人。蚌埠學(xué)院食品與生物工程學(xué)院副教授，博士，研究方向：食品藥品中活性物質(zhì)分子藥理、毒理研究。