陳晨，蒲晶，王寶瑄，張繼，蔡昌福，王煜鵬，劉金文

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，大慶 163319；2.中國商業(yè)聯(lián)合會(huì)飼料質(zhì)量監(jiān)督檢測(cè)中心）

楊樹PtYbeY基因克隆及轉(zhuǎn)化擬南芥的研究

陳晨1，蒲晶1，王寶瑄2，張繼1，蔡昌福1，王煜鵬1，劉金文1

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，大慶 163319；2.中國商業(yè)聯(lián)合會(huì)飼料質(zhì)量監(jiān)督檢測(cè)中心）

為了探究楊樹YbeY基因的功能，以毛果楊為材料，采用同源克隆法克隆PtYbeY基因，應(yīng)用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花蕾浸泡法異源轉(zhuǎn)化擬南芥atybeY突變體植株，表型分析其生物學(xué)功能。序列分析表明，楊樹PtYbeY基因的CDS全長1 761 bp，編碼568個(gè)氨基酸，含有UPF0054 domain和HAD hydrolase-like domain雙結(jié)構(gòu)域。異源轉(zhuǎn)化后擬南芥突變體植株由黃色表型恢復(fù)為野生型綠色的表型。表型分析結(jié)果顯示楊樹PtYbeY基因可以回補(bǔ)擬南芥atybeY基因突變體的表型，暗示著這兩個(gè)同源基因有類似的生物學(xué)功能，這為進(jìn)一步闡明PtYbeY的功能及作用機(jī)制奠定了分子基礎(chǔ)。

楊樹；PtYbeY；基因克隆

楊樹是楊柳科（Salicaceae）楊屬（Populus）植物，為世界廣布種，具有適應(yīng)性最強(qiáng)，速生豐產(chǎn)特點(diǎn)，是森林生態(tài)建設(shè)、城市綠化和木材工業(yè)生產(chǎn)的優(yōu)良樹種[1]。木本植物毛果楊（Populus trichocarpa）全基因組早在2006年發(fā)表[2]，其數(shù)據(jù)庫逐年更新，可利用的基因組數(shù)據(jù)庫和植物遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)的成熟，為木本植物分子生物學(xué)研究奠定基礎(chǔ)，毛果楊也因此成為木本植物基因工程研究中的模式生物。

YbeY是一個(gè)單鏈特異性的金屬離子依賴的內(nèi)切核糖核酸酶，具有高度保守性，屬于UPF0054蛋白家族，幾乎存在于所有已測(cè)序的細(xì)菌中[3-4]。在大腸桿菌中，YbeY首先被鑒定為一個(gè)未知功能的熱激蛋白，其可能參與翻譯過程[5-6]。細(xì)菌中YbeY蛋白的遺傳功能主要是行使rRNAs的加工和成熟，參與70S核糖體的質(zhì)量控制[7-8]。最近也有報(bào)道，草木樨中華根瘤菌（Sinorhizobium meliloti）YbeY的同源蛋白SMc0113有調(diào)控sRNAs和mRNAs的功能[9]。

1 材料與方法

1.1 材料

毛果楊（Populus trichocarpa）由中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院李來庚研究員贈(zèng)與；擬南芥（Arabidopsis thaliana）野生型WT（Col-0），擬南芥T-DNA插入突變體CS830701（atybeY-1）購買自美國俄亥俄州立大學(xué)擬南芥生物資源中心；大腸桿菌（Escherichia.coli）感受態(tài)細(xì)胞TOP10（購買自北京原平皓生物技術(shù)有限公司）；根癌農(nóng)桿菌（Agrobacteriumtumefaciens）感受態(tài)細(xì)胞GV3101株系來自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院，實(shí)驗(yàn)室保存；克隆載體18-T Vecto（r購自Takara公司），pENTRTM/SD/D-vector（購自Invitrogen公司）；表達(dá)載體pGWB5 vecto（r購自Invitrogen公司）；KOD-plus高保真酶（購自TOYOBO公司）；pBIOZOL Plant Total RNA Extraction Reagent Kit（購自杭州博日公司）；Prime－RT reagent Kit With gDNA Eraser kit（購自Takara公司）；Gateway LR clonase II enzyme mix（購自Thermo Fisher Scientific公司）。

1.2 植物材料生長條件

擬南芥培養(yǎng)條件：生長的環(huán)境溫度20～23℃，濕度70%左右，光強(qiáng)為60～120 μmol·m-2·s-1。光周期為，長日照16 h-light/8 h-Dark，短日照8～10 h-light/ 14～16 h-Dark。

毛果楊種植條件：生長溫度為24～28℃，光照強(qiáng)度150 μmol m-2s-1，光周期為16-light/8 h-Dark，相對(duì)濕度60%。

1.3 引物設(shè)計(jì)

基于引物設(shè)計(jì)的基本原則、所用表達(dá)載體的類型和遺傳功能分析的需要，我們?cè)O(shè)計(jì)克隆楊樹PtY－beY基因全長CDS引物：Pt7500-F：CACCATGCTCCCTCGCCTCTCTCCTCTC；Pt7500-R：GAATGCATACTCGTAAATAGCAGAG。其中，上游引物添加CACC四個(gè)堿基為構(gòu)建PtYbeY基因的TOPO載體所需，下游引物去掉CDS的終止密碼子TGA為構(gòu)建PtYbeY基因的pGWB5表達(dá)載體所需。引物由Invitrogen公司合成。

1.4 楊樹PtYbeY基因擴(kuò)增、克隆和鑒定

統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)表明：樂視網(wǎng)股價(jià)的日收益率平均值為0.000912，中位數(shù)為0.0012，標(biāo)準(zhǔn)差為0.042215，說明存在一定程度的離散，偏度系數(shù)Skewness小于0，說明收益率時(shí)間序列具有一定程度的左偏，而峰度系數(shù)Kurtosis大于3，說明時(shí)間序列具有明顯的尖峰特征；Jarque-Bera統(tǒng)計(jì)量相伴概率接近于0，統(tǒng)計(jì)結(jié)果拒絕原假設(shè)，從而表明收益率時(shí)間序列不服從正態(tài)分布。時(shí)間序列圖表明：收益率時(shí)間序列存在較大波動(dòng)，并且具有一定的集聚性和爆發(fā)性，可能存在ARCH/GARCH現(xiàn)象。[2]

用pBIOZOL Plant Total RNA Extraction Reagent Kit提取毛果楊幼葉總RNA，用PrimeScripRT reagent Kit With gDNA Eraser kit進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用Pt7500-F和Pt7500-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為：94℃3 min，94℃15 s，60℃30 s，68℃2 min，68℃7 min；35個(gè)循環(huán)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，膠回收后與TOPO載體連接，轉(zhuǎn)化到Top 10感受態(tài)中，抗性篩選，提取質(zhì)粒，PCR鑒定正確后送Invitrogen公司測(cè)序，測(cè)序正確的質(zhì)粒命名為TOPO-PtYbeY。

1.5 楊樹PtYbeY基因表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定

用1.4獲得的TOPO-PtYbeY載體和CaMV35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的pGWB5植物表達(dá)載體，以Gateway LR clonase II enzyme進(jìn)行LR反應(yīng)后，轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌感受態(tài)中，抗性篩選，提取質(zhì)粒，PCR鑒定正確的質(zhì)粒命名為pGWB5-PtYbeY。LR反應(yīng)總體系2.5 μL，25℃過夜連接。

1.6 楊樹PtYbeY基因異源轉(zhuǎn)化擬南芥

構(gòu)建好的pGWB5-PtYbeY植物表達(dá)載體，采用凍融法轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞GV3101，抗性篩選，PCR鑒定正確后，含有pGWB5-PtYbeY植物表達(dá)載體的農(nóng)桿菌擴(kuò)繁，采用常規(guī)的浸花法異源遺傳轉(zhuǎn)化擬南芥YbeY基因下調(diào)的atybeY-1突變體[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 楊樹PtYbeY的生物信息學(xué)分析

高等植物YbeY蛋白的進(jìn)化分析表明了YbeY在植物進(jìn)化中具有高度的保守性[10]。以模式植物擬南芥的AtYbeY蛋白序列同源搜索植物基因組數(shù)據(jù)庫（Pytozome）信息平臺(tái)的毛果楊基因組，發(fā)現(xiàn)毛果楊（P.trichocarpa）中有兩個(gè)YbeY的同源基因，Locus name分別是Potri.018G057500和Potri.018G055300。Potri.018G055300氨基酸序列全長301aa，含有單一的UPF0054 domain結(jié)構(gòu)域。Potri.018G057500氨基酸序列全稱587aa，含有UPF0054 domain和HADhydrolase-like domain雙結(jié)構(gòu)域（圖1）。我們以毛果楊cDNA為模板，采用同源克隆方法，經(jīng)PCR擴(kuò)增后獲得Potri.018G057500基因的全長的cDNA克隆片段，我們命名該基因?yàn)镻tYbeY。

圖1 楊樹PtYbeY蛋白序列結(jié)構(gòu)Fig.1The structure of PtYbeY protein from Populus

2.2 楊樹PtYbeY基因的克隆和TOPO-PtYbeY載體的構(gòu)建

以毛果楊幼葉為材料提取總RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后得到的cDNA為模板，用Pt7500-F和Pt7500-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖電泳檢測(cè)可見一條特異性的大約1 758 bp的條帶，與預(yù)測(cè)的目的基因大小相符（圖1 A）。目的片段膠回收后連接TOPO克隆載體，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞Top 10中，抗性篩選后，提取質(zhì)粒，質(zhì)粒的電泳檢測(cè)符合預(yù)構(gòu)建的目的質(zhì)粒的大?。▓D1 B），經(jīng)質(zhì)粒PCR檢測(cè)后測(cè)序，克隆測(cè)序的片段與已公布的基因組中的基因序列一致性為100%。結(jié)果表明，成功克隆到楊樹PtYbeY基因，并構(gòu)建到TOPO克隆載體中，質(zhì)粒命名為TOPO-PtYbeY。

圖2 楊樹PtYbeY基因的TOPO載體構(gòu)建Fig. 2Construction of TOPO vector for PtYbeY gene

2.3 楊樹PtYbeY基因的pGWB5植物表達(dá)載體的構(gòu)建

構(gòu)建好的TOPO-PtYbeY質(zhì)粒，經(jīng)LR反應(yīng)與pGWB5植物表達(dá)載體重組后，轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌中，抗性篩選，單克隆擴(kuò)繁提取質(zhì)粒，電泳檢測(cè)，大小符合預(yù)期結(jié)果（圖3 A）。該質(zhì)粒命名為pGWB5-PtYbeY。pGWB5-PtYbeY質(zhì)粒PCR電泳結(jié)果表明楊樹PtY－beY基因已整合到表達(dá)載體中（圖3 B）。鑒定正確的含有pGWB5-PtYbeY質(zhì)粒的農(nóng)桿菌-80℃保存，用于下一步的遺傳轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。

圖3 楊樹PtYbeY基因的pGWB5表達(dá)載體構(gòu)建Fig. 3Construction of recombinant pGWB5 plasmid for PtYbeY

2.4 楊樹PtYbeY基因異源轉(zhuǎn)化擬南芥

為了研究楊樹PtYbeY基因的遺傳功能，以楊樹PtYbeY基因同源的擬南芥AtYbeY基因下調(diào)的T-DNA突變體atybeY-1為背景植株，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法進(jìn)行異源轉(zhuǎn)化，研究楊樹PtYbeY基因的遺傳功能。楊樹PtYbeY異源回補(bǔ)突變體植株，命名為PtYbeY-OE，經(jīng)基因組DNA的PCR和轉(zhuǎn)錄水平的RT PCR鑒定陽性植株，收集種子種植到T3代，獲得純合體植株。表型分析結(jié)果表明，楊樹PtYbeY基因異源回補(bǔ)atybeY-1突變體，能使突變體的黃色表型恢復(fù)綠色的野生型表型，異源回補(bǔ)的atybeY-1突變體植株的發(fā)育到正常水平（圖4）。

圖4 楊樹PtYbeY異源回補(bǔ)突變體表型Fig. 4Phenotype of the PtYbeY complementary mutant

3 討論

以物種的一些分子特性構(gòu)建的進(jìn)化樹可以分析相關(guān)基因之間的起源關(guān)系，了解物種之間的生物系統(tǒng)發(fā)生，從而預(yù)測(cè)其基因的功能?；诩?xì)菌YbeY的UPF0054結(jié)構(gòu)域搜索，進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)從低等植物到高等植物中廣泛存在細(xì)菌YbeY的同源基因，在進(jìn)化中具有高度的保守性，暗示著其功能的重要性[10]。生物中YbeY蛋白的功能最初在細(xì)菌中被報(bào)道[5]，大腸桿菌YbeY遺傳學(xué)功能是作為核糖核酸內(nèi)切酶加工，參與16S rRNA的5'和3'末端與23S和5S rRNA的5'末端的成熟[7]。另外，YbeY在大腸桿菌的后期70S核糖體質(zhì)量控制中也起到重要的作用，它和RNase R共同作用去除缺陷的70S核糖體中功能缺失的30S亞單位[8]。

高等植物的YbeY蛋白與細(xì)菌YbeY蛋白的結(jié)構(gòu)域特征的差異，說明生物YbeY蛋白從原核生物（細(xì)菌）進(jìn)化到真核生物（植物）過程中存在進(jìn)化特征[11]。高等植物中，已有研究表明模式生物擬南芥YbeY蛋白的遺傳學(xué)功能是參與葉綠體rRNA加工和成熟，干擾葉綠體核糖體的組裝，從而影響了葉綠體核糖體翻譯活性，進(jìn)而影響了葉綠體的結(jié)構(gòu)及植株的光合作用[10]。研究的序列分析證實(shí)楊樹PtYbeY蛋白存在與擬南芥AtYbeY蛋白同樣的兩個(gè)UPF0054 domain和HAD hydrolase-like domain結(jié)構(gòu)域。蛋白結(jié)構(gòu)域（domain）是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、功能和進(jìn)化的基本單位，不同物種的蛋白存在相類似的結(jié)構(gòu)域暗示著其可能存在相同的生物學(xué)功能。楊樹PtYbeY異源轉(zhuǎn)化擬南芥atybeY-1突變體，表型分析顯示楊樹PtYbeY基因可以回補(bǔ)AtYbeY基因下調(diào)的擬南芥突變體的表型，從遺傳學(xué)角度說明兩個(gè)基因有相似的遺傳學(xué)功能。研究進(jìn)一步證實(shí)植物YbeY蛋白在從低等植物向高等植物進(jìn)化過程中具有高度的保守性和功能的重要性，為下一步研究楊樹PtYbeY基因遺傳學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。

［1］丁莉萍，王宏芝，魏建華.楊樹轉(zhuǎn)基因研究進(jìn)展及展望［J］.林業(yè)科學(xué)研究，2016，29（1）：124-132.

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Cloning of PtYbeY from Populus trichocarpa and Transformation into Arabidopsis thaliana

Chen Chen1，Pu Jing1，Wang Baoxuan2，Zhang Ji1，Cai Changfu1，Wang Yupeng1，Liu Jinwen1
（1.College of Life Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agriculture University，Daqing 163319；2.Feed Quality Control Center of China Chamber of Commerce）

In order to explore the function of YbeY in populus，PtYbeY from populous was cloned by RT-PCR method，which was based on published poplar genome data.The gene was introduced into Arabidopsis by the floral dip method and homozygous transgenic plants expressing YbeY gene were identified.Sequence analysis showed that the CDS full-length of poplar PtYbeY gene was 1 761 bp and encoded 568 amino acids，which was contained UPF0054 domain and HAD hydrolase-like domain.The phenotype of transgenic plant by means of heterologous transformation was green of wild type plant compared to yellow of mutant plant.The phenotype analysis showed that PtYbeY could complemented the genetic function of in atybeY mutant of Arabidopsis.The results of the study was indicated that the two homologous genes had the similar biological function，which contributed for further illustrating its function and molecular mechanism．

Populus；PtYbeY；gene clone

TS264.2

A

1002-2090（2017）04-0090-04

10.3969/j.issn.1002-2090.2017.04.020

2015-11-15

黑龍江省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201610223032）。

陳晨（1994-），女，黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院生物科學(xué)專業(yè)2013級(jí)本科生。

劉金文，男，講師，E-mail：liujinwen@byau.edu.cn。