郭 勇，楊 茜，張 杰 ，郭 唯，李 婧

(1.河北省石家莊市第一醫(yī)院醫(yī)務(wù)處，河北 石家莊 050011；2. 河北省石家莊市第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河北 石家莊 050011；3.河北省石家莊市第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北 石家莊 050011；4.河北省深州市醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北 深州 053800)

·論著·

白藜蘆醇對大鼠腦缺血性損傷中TNF-α和IL-6水平的影響

郭 勇1，楊 茜2*，張 杰3，郭 唯4，李 婧2

(1.河北省石家莊市第一醫(yī)院醫(yī)務(wù)處，河北 石家莊 050011；2. 河北省石家莊市第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河北 石家莊 050011；3.河北省石家莊市第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北 石家莊 050011；4.河北省深州市醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北 深州 053800)

目的探討白藜蘆醇對大鼠腦缺血損傷中腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)和白細(xì)胞介素6(inter leukin 6,IL-6)水平的影響。方法36只大鼠制作成腦組織缺血模型，分為A組、B組、C組，每組12只，A組為對照組未治療，B組和C組給予白藜蘆醇25 mg/kg和白藜蘆醇50 mg/kg，應(yīng)用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測腦組織勻漿中TNF-α和IL-6水平，檢測白藜蘆醇對細(xì)胞增殖的抑制作用。結(jié)果B組和C組大鼠腦組織中TNF-α和IL-6水平明顯低于A組，C組大鼠腦組織中TNF-α和IL-6水平又低于B組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論白藜蘆醇通過抑制腦部TNF-α、IL-6表達(dá)水平，減輕腦部炎癥程度，改善腦缺血，值得臨床應(yīng)用。

腦缺血；白藜蘆醇；細(xì)胞因子類；大鼠

缺血性腦損傷過程中存在氧化應(yīng)激引起的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷[1]。腦缺血時(shí)，細(xì)胞興奮毒性增強(qiáng)和能量衰竭，可觸發(fā)腦實(shí)質(zhì)內(nèi)的炎癥反應(yīng)，腫瘤壞死因子α(tumornecrosisfactoralpha,TNF-α)和白細(xì)胞介素6(interleukin6,IL-6)等細(xì)胞因子參與機(jī)體的炎癥反應(yīng)，在腦缺血損傷狀態(tài)下TNF-α和IL-6的表達(dá)增加，加重了組織細(xì)胞損傷。為了重建或恢復(fù)細(xì)胞功能，應(yīng)在腦缺血后盡快啟動(dòng)干預(yù)措施[2]。而白藜蘆醇具有抗氧化、抗炎等重要作用，研究表明白藜蘆醇對正常細(xì)胞無毒性[3]，在腦缺血時(shí)可通過多種機(jī)制發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。本研究以大鼠為研究對象，探討白藜蘆醇在腦缺血損傷中對TNF-α和IL-6的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑 成年雄性SD大鼠48只，體貭量250～300g，由河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)。白藜蘆醇購自美國Sigma公司，TNF-α和IL-6 一抗、二抗及相關(guān)試劑盒均購自信帆生物工程有限公司。

1.2 模型制備 參照文獻(xiàn)，采用線栓法阻斷大鼠頸外動(dòng)脈(externalcarotidartery,ECA)及其分支，阻斷翼腭動(dòng)脈(pterygopalatineartery,PPA)，以切斷顱外來源的側(cè)支循環(huán)血流。從ECA插入尼龍線，經(jīng)頸內(nèi)動(dòng)脈(internalcarotidartery,ICA)到大腦前動(dòng)脈(anteriorcerebralartery，ACA)，機(jī)械性阻斷大腦中動(dòng)脈(middlecerebralartery,MCA)發(fā)出處的血供，制作大鼠右側(cè)大腦半球腦缺血模型。48只大鼠用10%水合氯醛(35mg/kg)腹腔注射麻醉。仰臥位固定，頸正中線切口，沿胸鎖乳突肌內(nèi)緣分離肌肉和筋膜，分離左側(cè)頸頸總動(dòng)脈(commoncarotidartery,CCA)、ECA和ICA，在CCA遠(yuǎn)心端和近心端及ECA處掛線備用。用微動(dòng)脈夾暫時(shí)夾閉ICA，然后近心端結(jié)扎CCA、ECA。在距CCA分叉部4mm處剪一小口，將拴線插入到ICA，這時(shí)用繞在CCA遠(yuǎn)心端的細(xì)線輕輕系牢拴線。用眼科鑷輕推拴線，從血管分叉處開始算距離，當(dāng)插入深度在18mm時(shí)，緊緊系牢CCA遠(yuǎn)心端的細(xì)線(血管外的栓線不要留得過長，更不要縫在皮外，否則大鼠醒來后會(huì)自己拔出)?？p合傷口，單籠飼養(yǎng)觀察。以出現(xiàn)左上肢屈曲，行走時(shí)向左側(cè)偏斜或左側(cè)肢體癱瘓為成模標(biāo)準(zhǔn)，共篩選出符合條件的大鼠36只。排除標(biāo)準(zhǔn)：①無明顯神經(jīng)功能缺損表現(xiàn)或癥狀很輕的大鼠；②蛛網(wǎng)膜下腔出血的大鼠；③手術(shù)時(shí)出血較多，癥狀很重甚至死亡的大鼠。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥方法 按隨機(jī)化原則分為A、B、C組，A組(未治療)、B組(白藜蘆醇25mg/kg)、C組(白藜蘆醇50mg/kg)，每組12只。各組處理方法：B、C組在造模后分別給予白藜蘆醇25mg/kg、50mg/kg置于0.85%的NaCl溶液，A組大鼠給予同體積0.85%的NaCl溶液，各組大鼠均按10mL/kg給藥，連用5d。觀察3組大鼠精神狀態(tài)、肢體偏癱情況，實(shí)驗(yàn)完畢在麻醉狀態(tài)下處死大鼠，取腦組織50～80mg置于勻漿器中。

1.4IL-6和TNF-α檢測 將所取的脊髓組織制成勻漿，低溫(4 ℃)條件以下4 000r/min離心10min，取上清液，分裝，置于-86 ℃冰箱保存至檢測；TNF-α和IL-6測定采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附測定法，操作嚴(yán)格按照說明書。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料比較分別采用單因素方差分析和SNK-q檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

B組和C組大鼠腦組織中TNF-α和IL-6水平均明顯低于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；C組大鼠腦組織中TNF-α和IL-6水平又均低于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

組別TNF-αIL-6A組110.56±20.32176.42±21.55B組86.68±13.15*121.37±20.84*C組59.45±9.26*#85.07±12.25*#F58.754161.340P0.0000.000

*P<0.05與A組比較 #P<0.05與B組比較(SNK-q檢驗(yàn))

3 討 論

腦卒中是指急性起病，由于腦局部血液循環(huán)障礙所導(dǎo)致的神經(jīng)功能缺損綜合征，按照腦的病理改變可分為缺血性卒中和出血性卒中。缺血性腦損傷是危害人類健康和生命安全的常見的難治性疾病，因?yàn)槠涓甙l(fā)病率、高致殘率及高致死率，給患者及其家庭帶來極大的負(fù)擔(dān)，嚴(yán)重降低了存活患者的生活質(zhì)量。因此，積極治療和預(yù)防腦血管病，對降低缺血性腦損傷的發(fā)病率和病死率有重要意義，缺血性腦損傷的治療與預(yù)防水平急需提高。目前對缺血性腦損傷的早期治療主要是通過2個(gè)途徑實(shí)現(xiàn)的，即溶栓治療和腦保護(hù)治療，但溶栓治療有嚴(yán)格的時(shí)間窗及適應(yīng)證，故仍有很大一部分患者需要采用包括神經(jīng)保護(hù)劑在內(nèi)的其他方法進(jìn)行治療。

TNF-α在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，由神經(jīng)元、星形細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生，它在神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫調(diào)節(jié)系統(tǒng)中發(fā)揮很重要的作用。神經(jīng)功能缺損與TNF-α有關(guān)，腦組織的病變越嚴(yán)重，相應(yīng)的炎癥反應(yīng)也就越嚴(yán)重，同時(shí)TNF-α也隨之升高，提示TNF-α與疾病的嚴(yán)重程度可能有關(guān)。IL-6主要由血管內(nèi)皮細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞等產(chǎn)生，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的腦缺血損傷時(shí)其迅速表達(dá)，缺血缺氧后24 h可迅速升高。腦缺血缺氧損傷的病理機(jī)制是炎癥反應(yīng)和血腦屏障通透性增高，腦缺血損傷后小膠質(zhì)細(xì)胞被激活并分泌大量促炎因子，其中TNF-α和IL-6等細(xì)胞因子作為重要的炎癥介質(zhì)參與機(jī)體的炎癥反應(yīng)，在病理狀態(tài)下TNF-α和IL-6的表達(dá)增加加重了組織細(xì)胞損傷，二者表達(dá)水平的高低與疾病的嚴(yán)重程度以及預(yù)后密切相關(guān)，同時(shí)與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[4-5]，可以作為藥物治療的靶點(diǎn)。

白藜蘆醇是存在于葡萄科、蓼科等植物中的抗毒素，首次從毛葉藜蘆的根部提取得到，其中以虎杖、葡萄、花生中含量最高[6]，具有廣泛的生物學(xué)活性，如具有抗炎、抑制血小板聚集、免疫調(diào)節(jié)以及抗氧化、抗凋亡等作用，已被證實(shí)在多種組織或器官的缺血損傷過程中發(fā)揮對抗作用[7]，同時(shí)具有保護(hù)心腦血管、抗腫瘤、抗感染等多種藥理作用[8-10]。此外，白藜蘆醇還具有抗肝纖維化、治療休克、抗衰老、減肥、美容等多種功效，白藜蘆醇目前已經(jīng)被美國、日本、加拿大等國列為保健品。研究表明，白藜蘆醇可顯著性降低缺血腦組織中TNF-α和IL-6水平，縮小梗死體積[11]。

腦缺血時(shí)可觸發(fā)腦實(shí)質(zhì)內(nèi)的炎癥反應(yīng)并進(jìn)一步加重組織損傷。腦缺血后數(shù)小時(shí)，血管內(nèi)皮細(xì)胞即表達(dá)多種黏附分子，并介導(dǎo)與白細(xì)胞的相互作用，白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞黏附并從血液中遷移至腦實(shí)質(zhì)[12]。腦缺血后的細(xì)胞分泌大量促炎因子，這些促炎因子的蓄積會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞損傷[13]。腦缺血后數(shù)分鐘，部分轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)一過性上調(diào)；腦缺血后1～2 h，熱休克蛋白表達(dá)增加；腦缺血后12～24 h，趨化因子和細(xì)胞因子，如IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α等表達(dá)上調(diào)[12]。研究顯示白藜蘆醇可抑制腦缺血后的炎癥反應(yīng)。白藜蘆醇在治療心腦血管疾病方面具有明顯的抗心率失常、抗血栓形成、抗缺血-再灌注損傷后的內(nèi)皮細(xì)胞損傷、抗動(dòng)脈粥樣硬化治療作用，還有對抗阿爾茨海默病、亨廷頓病等老年病的治療作用，故在患者發(fā)生上述疾病時(shí)，白藜蘆醇可以作為安全的首選藥[14-16]。本研究主要探討白藜蘆醇對腦缺血性損傷的干預(yù)和減輕作用。

神經(jīng)細(xì)胞在完全缺血、缺氧后十幾秒即出現(xiàn)電位變化，20～30 s后大腦皮質(zhì)的生物電活動(dòng)消失，腦動(dòng)脈血流中斷持續(xù)5 min，神經(jīng)細(xì)胞就會(huì)發(fā)生不可逆性損害，出現(xiàn)腦梗死，嚴(yán)重缺血的腦組織能量很快耗竭，能量依賴性神經(jīng)細(xì)胞膜的泵功能衰竭，腦缺血引起膜去極化和突觸前興奮性遞質(zhì)的大量釋放，細(xì)胞外液中的Ca2+通過電壓門控通道和N-甲基-D-天冬氨酸受體門控通道進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞內(nèi)還由于三磷酸腺苷供應(yīng)不足和乳酸中毒，使細(xì)胞內(nèi)的結(jié)合Ca2+大量釋放，細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)失調(diào)在神經(jīng)細(xì)胞缺血損害中起重要作用，受Ca2+調(diào)節(jié)的多種酶類被激活，導(dǎo)致膜磷脂分解和細(xì)胞骨架破壞，大量自由基生成，細(xì)胞產(chǎn)生不可逆性損傷，在這個(gè)過程中還包括轉(zhuǎn)錄因子的合成及炎性介質(zhì)的產(chǎn)生等參與，白藜蘆醇對腦缺血后的神經(jīng)保護(hù)作用與其本身的抗炎功效及調(diào)節(jié)多種神經(jīng)遞質(zhì)的作用有關(guān)[17]。本研究在造模后5 d，根據(jù)生物化學(xué)指標(biāo)及未治療組大鼠病程發(fā)展過程中生命體征的變化，進(jìn)一步驗(yàn)證了模型的真實(shí)性與可靠性，白藜蘆醇治療組TNF-α和IL-6表達(dá)水平明顯下降，隨著白藜蘆醇濃度加大，TNF-α和IL-6的表達(dá)水平下降，白藜蘆醇50 mg/kg組大鼠腦組織中TNF-α和IL-6水平低于白藜蘆醇25 mg/kg組，而未治療組大鼠腦組織中TNF-α和IL-6水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于治療組。表明白藜蘆醇能通過抑制TNF-α和IL-6的表達(dá)水平，減輕腦缺血后的炎癥反應(yīng)，且這種作用具有一定的濃度依賴性。

腦缺血后，多條信號級聯(lián)反應(yīng)被激活，一部分對缺血腦組織發(fā)揮保護(hù)作用，而另一部分則產(chǎn)生有害作用，這些信號級聯(lián)反應(yīng)互相重疊且相互影響。腦缺血后數(shù)分鐘即可引發(fā)炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激。白藜蘆醇可靶向缺血性腦損傷的多條信號通路和環(huán)節(jié)，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[18]。本研究通過建立大鼠腦缺血模型，證實(shí)白藜蘆醇具有減輕腦缺血組織神經(jīng)功能損傷的積極作用。對于腦組織缺血性損傷的研究，人們一直不斷探索其發(fā)病原因及發(fā)病機(jī)制，現(xiàn)有的發(fā)病機(jī)制和藥物治療只針對腦組織缺血性損傷的某一階段發(fā)揮特定的作用，無法在缺血性損傷的每個(gè)階段發(fā)揮作用，故探討一種阻斷腦組織缺血性損傷發(fā)展的多靶點(diǎn)藥物有更重要的臨床意義。在腦缺血損傷的早期，腦組織改變不明顯，肉眼可見的變化要在數(shù)小時(shí)后才能辨認(rèn)。缺血中心區(qū)發(fā)生腫脹、軟化，灰白質(zhì)分界不清，大面積腦梗死時(shí)，腦組織高度腫脹，可向?qū)?cè)移位，導(dǎo)致腦疝形成。鏡下可見神經(jīng)元出現(xiàn)急性缺血性改變，如皺縮、深染及炎細(xì)胞浸潤等，膠質(zhì)細(xì)胞破壞，神經(jīng)軸突和隧橋崩解，小血管壞死，周圍有紅細(xì)胞滲出及組織間液的積聚。在發(fā)病的4～5 d腦水腫達(dá)高峰；7～14 d腦梗死區(qū)液化成蜂窩狀囊腔；3～4周后小的梗死灶可被肉芽組織區(qū)取代，形成膠質(zhì)瘢痕，大的梗死灶中央液化成囊腔，周圍由增生的膠質(zhì)纖維包裹，變成中風(fēng)囊。而白藜蘆醇是一種非常有希望的神經(jīng)保護(hù)藥，可用于缺血性卒中的預(yù)防和治療，加上白藜蘆醇本身來源于各種植物及食物，有必要將其作為神經(jīng)保護(hù)藥在臨床試驗(yàn)中加以驗(yàn)證。

綜上所述，白藜蘆醇通過抑制腦部TNF-α、IL-6表達(dá)水平，可減輕腦部炎癥程度、改善腦缺血，值得臨床推廣應(yīng)用。

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(本文編輯：許卓文)

Effect of the resveratrol on TNF-α and IL-6 levels in rats with ischemic injury

GUO Yong1， YANG Qian2*， ZHANG Jie3， GUO Wei4， LI Jing2

(1.DepartmentofMedical,theFirstHospitalofShijiazhuang，HebeiProvinceShijiazhuang050011,China； 2.DepartmentofNeurology，theFirstHospitalofShijiazhuang，HebeiProvince，Shijiazhuang050011,China； 3.DepartmentofClinicalLaboratory，theFirstHospitalofShijiazhuang，HebeiProvince,Shijiazhuang050011,China； 4.DepartmentofClinicalLaboratory，theShenzhouHospital,HebeiProvince,Shenzhou053800,China)

ObjectiveToexploretheeffectoftheResveratrolontumornecrosisfactoralpha(TNF-α)andinterleukin6(IL-6)levelsinratswithischemicinjury.MethodsThirty-sixratsweredividedintogroupA,groupBandgroupC,with12ratsineachgroup.ThegroupAwasthecontrolgroupwithouttreatment,andthegroupBandthegroupCweregivenresveratrol25mg/kgandresveratrol50mg/kg.Thedouble-antibodysandwichenzymelinkedimmunosorbentassaymethodwasusedtodetermineTNF-αandIL-6levelsinthebraintissuehomogenate，andtodetectthecellproliferationinhibitionofresveratrol.ResultsTheTNF-αandIL-6levelsingroupBandgroupCweresignificantlylowerthanthoseingroupA,theTNF-αandIL-6levelsingroupCwerelowerthanthoseingroupB,thedifferencesweresignificant(P<0.05).ConclusionResveratrolinhibitsbraininflammationandimprovescerebralischemiabyinhibitingthelevelsofTNF-αandIL-6inthebrain,whichisworthyofclinicalapplication.

brainischemia；resveratrol；cytokines;rats

2017-03-30；

2017-04-25

河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點(diǎn)課題(20170978)

郭勇(1976-)，男，河北石家莊人，河北省石家莊市第一醫(yī)院副主任醫(yī)師，從事臨床外科及醫(yī)務(wù)管理工作。

*通訊作者。E-mail:549147601@qq.com

R743.31

A

1007-3205(2017)09-0997-04

10.3969/j.issn.1007-3205.2017.09.002