張富麗，羅 蘋*，敬 媛，尹 全，常麗娟，鄧 強，牛 蓓，宋 君，王 東

吐溫-20對Bt抗蟲棉外源蛋白提取效率的影響

張富麗1，2，羅 蘋1，2*，敬 媛3，尹 全1，2，常麗娟1，2，鄧 強1，2，牛 蓓4，宋 君1，2，王 東1，2

(1.四川省農(nóng)業(yè)科學院分析測試中心，四川成都 610066;2.四川省農(nóng)業(yè)科學院質(zhì)量標準研究所，四川成都 610066;3.甘孜州農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全中心，四川康定 626000;4.成都大學醫(yī)學院，四川成都 610106)

【目的】探究吐溫-20對轉(zhuǎn)基因棉中Bt蛋白提取效率的影響程度，為轉(zhuǎn)基因植物外源蛋白提取方法標準化，進而精準轉(zhuǎn)Bt基因棉品種審定準入項目檢測數(shù)據(jù)提供理論依據(jù)?！痉椒ā颗渲?種不同吐溫-20含量的提取液，提取抗蟲棉GK19及非轉(zhuǎn)基因棉泗棉3號苗期葉片、蕾期葉片和小蕾、鈴期葉片和小鈴中可溶性總蛋白，測定提取液中Bt蛋白和可溶性總蛋白含量，比較不同吐溫-20含量提取液蛋白提取效率的差異?！窘Y(jié)果】結(jié)果表明，吐溫-20對抗蟲棉中外源Bt蛋白提取效率有顯著影響，蛋白提取緩沖液中吐溫-20含量為0.55%是最適的?！窘Y(jié)論】在蛋白提取緩沖液中加入適量吐溫-20可明顯提高抗蟲棉外源Bt蛋白的提取效率，而不影響標準曲線R平方值(R2)。過量添加吐溫-20，超過一定的限度，檢測變異系數(shù)加大，檢測值可信度降低，檢測結(jié)果無意義，因此準確控制蛋白提取緩沖液成分含量十分必要。

吐溫-20，抗蟲棉，外源蛋白，提取效率

【研究意義】轉(zhuǎn)基因作物帶來的巨大經(jīng)濟效益以及對糧食安全、可持續(xù)發(fā)展及環(huán)境與氣候變化的貢獻促使轉(zhuǎn)基因作物不斷地發(fā)展壯大。其中，棉花是主要的轉(zhuǎn)基因作物之一。據(jù)統(tǒng)計，截止2015年，轉(zhuǎn)基因棉花種植總面積已累計達3億公頃，采用率已上升至96%[1]。轉(zhuǎn)基因抗蟲棉是我國最早實現(xiàn)商業(yè)化種植的轉(zhuǎn)基因作物，目前已全面覆蓋長江流域和黃河流域棉區(qū)，已廣泛實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。但品種多、亂、雜已經(jīng)成為目前轉(zhuǎn)基因棉產(chǎn)業(yè)發(fā)展的一個突出問題，嚴重影響其健康發(fā)展。為了改變該現(xiàn)狀，促進產(chǎn)業(yè)良性健康發(fā)展，相關(guān)職能部門已著手加強行業(yè)監(jiān)管力度，規(guī)范和提高安全評價的準入制度。抗蟲蛋白表達量就是轉(zhuǎn)基因棉品種申請安全證書的準入門檻審定指標之一。【前人研究進展】酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)是一種利用免疫學原理檢測抗原或抗體的技術(shù)，因其靈敏度高、快速穩(wěn)定、操作簡便以及定量分析等優(yōu)點而備受青睞，已逐漸成為轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測研究中不可或缺的方法。對于Bt (Cry1Ac/Cry1Ab)毒蛋白的抗體制備及ELISA檢測方法，國內(nèi)外已有大量報道，且近年來亦取得新的進展。2007年，Anna等[2]在ELISA方法的基礎(chǔ)上建立了微球免疫的方法用于轉(zhuǎn)基因玉米MON810和Bt11中Bt蛋白的檢測，靈敏度分別達到0.018%和0.054%。Shah等人[3]和Wang等人[4]建立了雙抗體夾心ELISA法檢測轉(zhuǎn)基因棉花中Cry1Ac蛋白的含量，方法的靈敏度和準確度稍有差異。2011年，Zhu等人[5]在量子基礎(chǔ)上建立了的熒光聯(lián)免疫吸附檢測方法(QD-FLISA)，檢測下限可達2.956 pg/mL。經(jīng)過數(shù)十載發(fā)展和優(yōu)化，ELISA現(xiàn)已廣泛地用于蛋白質(zhì)檢測，且多轉(zhuǎn)化為試劑盒進行商業(yè)化生產(chǎn)。但是，國內(nèi)現(xiàn)有Bt蛋白檢測試劑盒仍存在特異性不高、缺乏與國外試劑盒嚴格對比等問題[6]。歐美國家的試劑盒雖然價格偏高，但其穩(wěn)定性好，接受度高。美國EnviroLogix公司開發(fā)的Cry1Ab/ Cry1Ac檢測試劑盒就是其中一款較成熟的Bt蛋白檢測試劑盒，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因棉抗蟲蛋白表達量的研究和檢測工作中。Bt抗蟲蛋白表達量作為轉(zhuǎn)Bt基因棉品種申請安全證書準入門檻的重要檢測項目，對該品種能否成功通過品種審定具有重要意義。研究表明，高溫、低溫、鹽脅迫、漬澇、干旱、肥力條件等環(huán)境因素對轉(zhuǎn)基因抗蟲棉Bt蛋白表達量有顯著影響外，樣品存放和處理方法對Bt蛋白含量檢測結(jié)果也存在明顯影響?！颈狙芯壳腥朦c】蛋白檢測過程中，樣本制備質(zhì)量同樣不容忽視，其中起至關(guān)重要作用的就是蛋白提取緩沖液。在日常檢測中發(fā)現(xiàn)，提取緩沖液中吐溫-20含量不同，蛋白提取上清呈色深淺不同。因此，提取緩沖液中吐溫20含量對抗蟲轉(zhuǎn)基因棉Bt外源蛋白提取效率的影響是本研究的關(guān)注重點?！緮M解決的關(guān)鍵問題】Bt抗蟲蛋白表達量作為轉(zhuǎn)Bt基因棉品種申請安全證書準入門檻的重要審定項目，其檢測值對該品種能否成功獲得安全生產(chǎn)證書具有重要意義。研究表明，高溫[7-8]、低溫[9]、鹽脅迫[10-11]、漬澇[12]、干旱[12]、肥力條件[13]等環(huán)境因素對轉(zhuǎn)基因抗蟲棉Bt蛋白表達量有顯著影響。此外，常麗娟等人[14]研究表明，樣品凍存時間、研磨粗細等因素對單位鮮物質(zhì)質(zhì)量Bt蛋白含量也存在明顯影響?？梢?，成熟穩(wěn)定的檢測方法和樣品制備方法對蛋白表達量檢測結(jié)果亦起著關(guān)鍵性作用。研究中我們還發(fā)現(xiàn)，蛋白檢測過程中，樣本制備質(zhì)量同樣不容忽視，除了選擇良好的樣本制備方法，控制好樣本制備的條件外，起至關(guān)重要作用的就是蛋白提取緩沖液。緩沖液中吐溫20含量對抗蟲轉(zhuǎn)基因棉Bt外源蛋白提取效率的影響是本研究的關(guān)注重點。吐溫-20，又名聚氧乙烯失水山梨醇單月桂酸酯，英文名為吐溫-20，是一種非離子型表面活性劑，具有乳化、擴散、增溶、穩(wěn)定等作用，用途廣泛，在分子生物學研究中常將其用作水溶性乳化劑、去污劑或封閉劑。在蛋白提取緩沖液中加入，可減少蛋白質(zhì)間原有互作力產(chǎn)生的破壞，起到穩(wěn)定蛋白的作用。EnviroLogix公司Cry1Ab/Cry1Ac檢測試劑盒中配備了PBS粉包(Sigma)，同時推薦使用該粉包制備成含0.55%吐溫-20的蛋白提取緩沖液(0.55%T·0.01 mol/L PBS)。不同吐溫-20含量的蛋白提取溶液得到的提取上清顏色深淺與蛋白含量是否有直接關(guān)系，吐溫-20含量是否影響B(tài)t蛋白最終定量檢測結(jié)果是本文研究的關(guān)鍵問題。作者擬配制不同吐溫-20含量的提取緩沖液，提取苗期葉片、蕾期葉片和小蕾、鈴期葉片和小鈴中Bt蛋白和可溶性總蛋白，研究吐溫-20對轉(zhuǎn)基因棉中Bt蛋白提取效率的影響程度，以期轉(zhuǎn)基因植物外源蛋白提取方法進一步標準化，進而完善精確定量外源蛋白檢測方法，精準轉(zhuǎn)Bt基因棉品種審定準入項目檢測數(shù)據(jù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

試驗所用的轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉為GK 19(鄂抗蟲棉1號)，非轉(zhuǎn)基因棉品種為泗棉3號。GK 19轉(zhuǎn)基因棉系將GFMcryIABt基因轉(zhuǎn)入泗棉3號后經(jīng)系統(tǒng)選育而成的抗蟲品種。將轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉及非轉(zhuǎn)基因棉親本種植于位于成都市彭州市濛陽鎮(zhèn)的農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因植物環(huán)境安全監(jiān)督檢驗測試中心(成都)環(huán)境評價基地。試驗地土壤肥力水平中等、均勻。4月播種，寬窄行種植(窄行+寬行:0.3 m+0. 7 m)，株距0.5 m。3次重復(fù)，采用隨機區(qū)組設(shè)計，每個小區(qū)30 m2(5 m×6 m)，每個品種種植3個小區(qū)，每個小區(qū)種植約100株。常規(guī)田間水肥管理。

分別于棉花苗期(4～6片真葉)、蕾期(盛蕾期)、鈴期(結(jié)鈴盛期)，每個小區(qū)隨機抽取20株植株進行取樣。苗期，取頂部倒數(shù)第3片完全展開葉。蕾期，取頂部倒數(shù)第3片完全展開葉和同株1個小蕾(直徑0.5～0.7 cm)。鈴期，取頂部倒數(shù)第3片完全展開葉和同株1個小鈴(直徑1 cm)。將各小區(qū)采集的同一時期葉片、蕾、鈴等各組織器官樣品作為一個樣本，分別置于保鮮袋內(nèi)密封，放冷藏保溫箱中，迅速帶回實驗室，液氮速凍，即放入-70℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 蛋白提取緩沖液配制

配制不同吐溫-20含量的蛋白提取緩沖液，并分別編號。

A液:0.01mol/L PBS(pH 7.4)，其中含0.138 mol/L NaCl，0.0027 mol/L KCl;B液:0.05%T· 0.01 M PBS，將Cry1Ab/Cry1Ac檢測試劑盒(EnviroLogix Inc.USA)中的緩沖鹽粉末包(Sigma，Cat#P-3563)完全溶于1 L超純水中，含0.05%吐溫-20;C液:0.25%T·0.01 M PBS，將200μl吐溫-20加入至100 mL B液中，含0.25%吐溫-20;D液:0.55 %T·0.01 mol/L PBS，將500μl吐溫-20加入至100 mL B液中，該吐溫濃度為EnviroLogix公司Cry1Ab/Cry1Ac檢測試劑盒推薦Bt蛋白提取液濃度，含0.55%吐溫-20;E液:1.05%T·0.01 M PBS，將1000μl吐溫-20加入至100 mL B液中，含1.05%吐溫-20。F液:2.05%T·0.01 M PBS，將2000μl吐溫-20加入至100 mL B液中，含2.05%吐溫-20。G液:純水H2O。緩沖液配制完畢，4℃保存，1周內(nèi)使用。

1.3 試樣的制備

將同一小區(qū)葉片樣本疊放整齊，對半剪取，加入液氮快速研磨成粉末。小蕾、小鈴樣本液氮處理后，拍碎混勻取半，加入液氮研磨成粉末。剩余的一半樣品留存?zhèn)溆?。稱取粉末0.1 g于1.5 mL離心管中，分別加入1000 mL各蛋白提取液，混勻。4～7℃低溫搖床震蕩溫浴12 h。4℃，8000 r/min離心20 min后分別取上清，備測。每個樣品3次重復(fù)。

1.4 吐溫-20對標準曲線的影響

分別用0.01 mol/L PBS、0.55%T·0.01 mol/ L PBS及滅菌純水將Bt標準蛋白(EnviroLogix Inc. USA)稀釋成1.00、0.80、0.64、0.46、0.28、0.10 ng/ mL 6個濃度梯度，用于制備2條標準曲線。按EnviroLogix Cry1Ab/Cry1Ac檢測試劑盒操作說明書，分別建立標準曲線。用洗板機BioTek Elx50 (BioTek Instrument，US)洗板，酶標儀BioTekμQuant MQx200(Biotek Instrument，US)讀取吸光值，Excel 2007制作標曲。

1.5 Bt蛋白含量的測定

采用EnviroLogix Cry1Ab/Cry1Ac檢測試劑盒對樣品中Bt蛋白含量進行測定。將標準蛋白稀釋成1.00、0.80、0.64、0.46、0.28、0.10 ng/mL 6個濃度梯度，并稀釋待測樣品的Bt蛋白濃度至標準曲線范圍內(nèi)。取50μl標準液和待測樣品按試劑盒操作指南進行檢測。每個待測樣品設(shè)兩個平行孔。洗板機BioTek Elx50(BioTek Instrument，US)洗板，酶標儀BioTekμQuant MQx200(Biotek Instrument，US)讀取450和630 nm波長下的吸光值。分別減去空白對照孔的讀數(shù)值后，450 nm波長下的余值減去630 nm波長的余值，得到最終測定值。建立標準曲線并計算樣品中單位鮮物質(zhì)質(zhì)量Bt蛋白的含量。

1.6 可溶性總蛋白含量的測定

按照Pierce?BCA蛋白定量分析試劑盒(Pierce Biotechnology，USA)使用說明書對提取上清中總蛋白含量進行測定。按標準方案(檢測范圍=20～2000μg/mL)稀釋牛血清白蛋白(BSA)標準品，制備25、125、250、500、750、1000、1500、2000μg/mL 8各濃度梯度，水作空白對照，用于制作標準曲線。用水稀釋待測樣品的可溶性總蛋白質(zhì)量濃度至標準曲線范圍內(nèi)。取各稀釋濃度的蛋白質(zhì)標準品和待測蛋白質(zhì)樣品各25μl，加入到微孔板中，然后加入BCA工作液200μl，充分混勻，37℃孵育30 min，將微孔板轉(zhuǎn)移到室溫下，酶標儀BioTekμQuant MQx200 (Biotek Instrument，US)讀取562 nm波長下吸光值。將各個標準品和待測蛋白質(zhì)樣品的吸光值減去空白標準品的吸光值，建立標準曲線并計算樣品中單位鮮物質(zhì)質(zhì)量可溶性總蛋白的含量。

1.7 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2007和SPSS 13.0軟件進行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 吐溫-20對標準曲線的影響

利用0.01 mol/L PBS、0.55%T·0.01 mol/L PBS緩沖液及無菌純水稀釋標準品為1.0、0.82、0. 64、0.46、0.28、0.1 ng/mL 6個濃度梯度，用于制備標準曲線，PBS緩沖液和純水配制標品溶液制成的3條標準曲線各點分布均呈典型直線性，相關(guān)系數(shù)R2分別為0.9955、0.9975、0.9975，均大于0.98(圖1)。由此可見，在緩沖液中加入適量吐溫-20對標準曲線相關(guān)系數(shù)無影響。

2.2 提取液中不同吐溫-20濃度對上清顏色深淺的影響

分別用1.2中A、B、C、D、E、F、G 7種不同吐溫-20含量的蛋白提取液過夜低溫提取GK19轉(zhuǎn)Bt基因棉花及非轉(zhuǎn)基因常規(guī)棉泗棉3號苗期葉片、蕾期葉片、蕾期小蕾、鈴期葉片、鈴期小鈴幾個時期組織中蛋白，4℃，8000 r/min離心20 min，取上清。如圖2所示，不論是轉(zhuǎn)基因棉花GK19或是非轉(zhuǎn)基因棉泗棉3號各時期組織提取上清的顏色都有變化，且變化趨勢一致，蛋白提取緩沖液中吐溫的含量越高，上清顏色越深。用純水作為浸提介質(zhì)，上清顏色最淺。

圖1 標準曲線的比較Fig.1 The comparison of two calibration curves

2.3 提取液中吐溫-20不同含量對Bt蛋白檢測的影響

分別用1.2中7種不同吐溫-20含量的蛋白提取緩沖液(編號:A、B、C、D、E、F、G)提取轉(zhuǎn)Bt基因棉花GK19及非轉(zhuǎn)基因常規(guī)棉泗棉3號苗期葉片、蕾期葉片、蕾期小蕾、鈴期葉片、鈴期小鈴時期組織，取上清。該上清為蛋白粗提液，稀釋100倍后作為待測樣品。設(shè)3次重復(fù)。采用EnviroLogix Cry1Ab/ Cry1Ac檢測試劑盒樣品中Bt蛋白含量，每個重復(fù)樣本做2個平行。計算并統(tǒng)計檢測平均值(Mean)及相對標準方差(RSD，又稱變異系數(shù))。如表1所示，蛋白提取液中吐溫的含量對非轉(zhuǎn)基因棉的檢測均值影響較小，平均值分布于33.72～71.01，RSD值集中在2～6，不大于8.59。同樣吐溫含量的蛋白提取緩沖液提取轉(zhuǎn)基因棉樣本的Bt蛋白含量檢測值與非轉(zhuǎn)基因棉樣本情況明顯不同。用純水作為浸提液(試劑G)，提取轉(zhuǎn)基因棉各時期組織的上清的檢測值與非轉(zhuǎn)基因棉相當，無明顯差異，判定為無Bt蛋白檢出。而其他幾種蛋白提取緩沖液中吐溫濃度越高，Bt蛋白濃度值越大;且結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因棉各時期的幾個組織的檢測結(jié)果呈現(xiàn)一個共同趨勢，即在幾個吐溫濃度梯度的提取緩沖液中，當吐溫含量≤0.55%時，RSD值均較小，不大于4.83;當吐溫含量≥1.05%時，其RSD值相對低濃度吐溫提取液的值明顯增大，其值分布在8.54～16.07，其變異系數(shù)均較大。該結(jié)果表明，提取液中吐溫濃度越大，Bt蛋白檢測值越大，但當吐溫濃度超過一定限度，其RSD值也相應(yīng)的增加，其值的可信度降低。因此，提取液中添加吐溫可提高Bt蛋白提取效率，但量度宜適中。從本實驗結(jié)果可確定Bt蛋白的提取必須采用PBS緩沖液，且適度添加吐溫可以提高蛋白提取效率，轉(zhuǎn)基因棉組織中Bt蛋白提取緩沖液最適吐溫添加濃度為0.55%，苗期葉片、蕾期葉片、蕾期蕾、鈴期葉片、鈴期鈴中Bt蛋白含量分別為233. 36、261.65、294.58、287.41、246.32 ng·g-1FW。

圖2 用不同吐溫-20含量提取液提取上清顏色比較Fig.2 The color depth comparison of supernatant liquid extracted by buffer with different content of Tween-20

表1 不同時期葉片組織中Bt蛋白含量Table 1 The Bt-protein content in tissues or leaves in different stage of cotton

2.4 提取液中吐溫-20不同含量對可溶性總蛋白檢測的影響

用7種不同吐溫-20含量蛋白提取液(見1.2)提取轉(zhuǎn)Bt基因及非轉(zhuǎn)基因棉幾個時期組織的上清，稀釋10倍后作為待測樣品，用Pierce?BCA蛋白定量分析試劑盒檢測可溶性總蛋白含量。無論是轉(zhuǎn)基因棉還是非轉(zhuǎn)基因棉，用純水從組織中提取上清蛋白檢測值較低(表2)，且RSD值偏大;而PBS提取液的RSD值明顯較小，在PBS提取緩沖液中加入吐溫后，當吐溫含量≤0.55%時，其上清的蛋白檢測值RSD值不超過6.40。加入吐溫后，可溶性總蛋白含量值比未加吐溫的蛋白提取液增加，且隨著吐溫含量的增加，檢測值增大。當吐溫含量≥1.05%時，可溶性總蛋白含量值顯著增大，其相應(yīng)的RSD值也明顯增大，也即其變異系數(shù)較大，最高可達22. 14。提取液中吐溫濃度越大，可溶性總蛋白檢測值越大，但當吐溫濃度超過一定限度，其RSD值也相應(yīng)的增加，其值的可信度降低，進一步說明了蛋白提取緩沖液吐溫-20須適度添加。

3 討 論

吐溫-20本身比較粘稠，在蛋白提取緩沖液配制操作過程中，添加吐溫-20的時，一定慢慢地吸取，待液面靜止不動之后，將移液器靠瓶口沿取出。將吐溫-20移到到PBS后，反復(fù)抽打，并用PBS抽洗數(shù)次，盡量排凈，以保證吐溫-20準確量取，PBS緩沖液中吐溫-20含量精準。

表2 不同時期葉片組織中總蛋白含量Table 2 The total soluble protein content in tissues or leaves in different stage of cotton

本研究結(jié)果表明，在Bt蛋白定量檢測過程中，在蛋白提取緩沖液中加入適量吐溫-20可明顯提高抗蟲棉外源Bt蛋白的提取效率，而不影響標準曲線R平方值。R平方值，又稱為決定系數(shù)，是標準曲線趨勢線擬合程度的指標。它的數(shù)值大小可以反映趨勢線的估計值與對應(yīng)的實際數(shù)據(jù)之間的擬合程度，其值越接近1，標準曲線可靠性越高。換句話說，適量吐溫-20不影響標準曲線的可靠性。另外，加入吐溫量越大，提取上清顏色越深，相應(yīng)地可溶性總蛋白檢測值越大，抗蟲轉(zhuǎn)基因棉中外源Bt蛋白檢測值亦隨著上清顏色加深而增大，而非轉(zhuǎn)基因外源Bt蛋白檢測值不會隨顏色深淺發(fā)生變化。蛋白提取緩沖液中吐溫含量、提取上清顏色深淺以及可溶性總蛋白含量三者之間是呈正向關(guān)聯(lián)的?？瓜x轉(zhuǎn)基因棉中Bt蛋白是外源Bt基因表達的產(chǎn)物，轉(zhuǎn)基因棉組織可溶性總蛋白中包括外源Bt蛋白，因此總蛋白提取效率越高，相應(yīng)的外源Bt蛋白提取效率越高;非轉(zhuǎn)基因棉中無外源Bt基因，不會有Bt基因表達蛋白，因此幾種蛋白提取緩沖液提取非轉(zhuǎn)基因棉組織上清中Bt蛋白檢測值極低，差異亦較小。因此，上清顏色深淺與抗蟲Bt蛋白含量不呈正向相關(guān)性有力證明了本檢測方法對Bt蛋白特異性。與此同時，該結(jié)果還表明，蛋白提取緩沖液中不能無限添加吐溫-20，超過一定的限度，檢測變異系數(shù)加大，檢測值可信度降低，檢測結(jié)果無意義。EnviroLogix公司Cry1Ab/Cry1Ac檢測試劑盒中推薦使用的蛋白提取緩沖液(0.55%T·0.01M PBS)吐溫-20含量為0. 55%是合適的，這與張俊環(huán)等人[15]蛋白提取緩沖液中添加0.5%吐溫-20最理想的研究結(jié)果一致。

在Bt抗蟲蛋白表達量檢測工作中，一定嚴格按照標準及規(guī)范要求進行操作，除了做好田間水肥管理，使棉花植株保持良好生長狀態(tài)，在生長發(fā)育的關(guān)鍵時期避免缺水干旱、及時排除田間積水、采取防止?jié)n澇危害措施外，還要控制好室內(nèi)檢測條件，控制好試劑配制質(zhì)量，這是準確檢測和評估Bt抗蟲蛋白表達量的保障。尤其對于大批量檢測樣本，保證試劑質(zhì)量，操持實驗條件、處理時間以及處理方法一致的前提下，才可以保障檢測結(jié)果的可信性，數(shù)據(jù)之間才能進行有效比對。

4 結(jié) 論

吐溫-20對抗蟲棉中外源Bt蛋白提取效率有顯著影響，在蛋白提取緩沖液中加入適量吐溫-20可明顯提高抗蟲棉外源Bt蛋白的提取效率，而不影響標準曲線R平方值(R2)。但過量添加吐溫-20，超過一定的限度，檢測變異系數(shù)加大，檢測值可信度降低，檢測結(jié)果無意義，蛋白提取緩沖液中吐溫-20含量為0.55%是最適的。因此準確控制蛋白提取緩沖液成分含量十分必要。

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(責任編輯 李 潔)

Effects of Tween-20 on Extraction Efficiencies of Bt Protein Genetically M odified Cotton

ZHANG Fu-li1，2，LUO Ping1，2*，JING Yuan3，YIN Quan1，2，CHANG Li-juan1，2，DENG Qiang1，2，NIU Bei4，SONG Jun1，2，WANG Dong1，2
(1.Analysis and Determination Center，Sichuan Academy of Agricultural Sciences，Sichuan Chengdu 610066，China;2.Institute of Quality Standard and Testing Technology Research，Sichuan Academy of Agricultural Sciences，Sichuan Chengdu 610066，China;3.Agriculture Products Quality Security Center of Ganzi，Sichuan Kangding 626000，China;4.Medical College，Chengdu University，Sichuan Chengdu 610106，China)

【Objective】The effortwas focused on to reveal the effect of the content of Tween-20 in the buffer solution on the extracting efficiency of Bt protein，as to provide a theoretical basis and references on formulating the standardized methods of protein extraction，and improving the accuracy of the testing data for variety certification admission of transgenic cotton.【Method】Seven extraction solutionswith different amountof Tween-20 were prepared and respectively used for extraction of the total soluble protein in the leaves of cotton seedling，budding stage and cotton boll stage，small buds and small bolls，then the extraction efficiencies of all extraction buffer were compared after the content of foreign Bt protein and total soluble protein were detected.【Result】Tween-20 could dramatically affect the extraction efficiency of foreign Bt protein，and themost proper concentration of Tween-20 in extraction solution was0.55%.【Conclusion】The extraction efficiency of Bt protein could be improved dramatically when proper amount of Tween-20 was added to the extraction solutions and the R2value of stand curve remained unaffected.Excessive use of Tween-20 would result in higher variation coefficient and lower reliability thus accuracy control operation is very necessary in the preparation for the protein extraction buffer.

Tween-20;Insect-resistant cotton;Foreign protein;Extraction efficiency

S562

A

1001-4829(2017)8-1777-07

10.16213/j.cnki.scjas.2017.8.014

2016-12-16

四川省財政基因工程項目-論文基金(2014LWJJ-011，2016LWJJ-010);四川省財政創(chuàng)新能力提升工程公益深化項目(2016GYSH-032)

張富麗(1978-)，女，副研究員，長期從事轉(zhuǎn)基因植物環(huán)境安全評價相關(guān)研究，*為通訊作者。