賈定洪，王 波，李小林，譚 偉，彭衛(wèi)紅*

基于毛木耳CDS的福壽螺多功能纖維素酶基因密碼子優(yōu)化分析

賈定洪1，2，王 波1，李小林1，譚 偉1，彭衛(wèi)紅1*

(1.四川省農(nóng)業(yè)科學院土壤肥料研究所，四川成都 610066;2.四川大學生命科學學院生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點實驗室，四川成都 610064)

【目的】克隆福壽螺多功能纖維素酶基因(multi-functional cellulase gene，M fc)，進行密碼子優(yōu)化改造，便于后續(xù)毛木耳Mfc基因轉(zhuǎn)導研究。【方法】采用CodonW軟件分析福壽螺多功能纖維素酶基因Mfc及毛木耳轉(zhuǎn)錄本CDS密碼子使用次數(shù)和同義密碼子相對使用度差異，以毛木耳CDS密碼子特征對福壽螺M fc基因進行密碼子優(yōu)化?！窘Y(jié)果】改造后的Mfcsg序列GC含量從原始Mfc序列的54.04%增加到58.16%，與毛木耳遺傳背景一致?！窘Y(jié)論】實驗優(yōu)化后獲得的Mfcsg基因序列GC含量與毛木耳遺傳背景一致，沒有發(fā)夾結(jié)構(gòu)、重復(fù)序列及反向重復(fù)序列，能夠作為毛木耳外源基因轉(zhuǎn)化應(yīng)用。

福壽螺;毛木耳;密碼子優(yōu)化

【研究意義】能源資源是國家的重要財富，也是一種對國家而言必備的生產(chǎn)要素，在社會經(jīng)濟的發(fā)展中起到極為重要的作用，具有極為深遠的戰(zhàn)略地位[1]。目前能源供應(yīng)中化石能源在世界能源消費結(jié)構(gòu)中所占比例長期保持在85%以上[2]，是世界經(jīng)濟的發(fā)展重要驅(qū)動力量。但由于化石能源存在不可再生性及污染環(huán)境的缺點，因而替代能源的發(fā)掘就變得十分迫切[3]。相對于化石能源，生物能源是一種可再生及環(huán)境友好型替代資源[4]。纖維素降解酶類能夠?qū)㈦y以利用的纖維基質(zhì)分解為可再生的生物燃料，是一種價值巨大的生物資源[3]?！厩叭搜芯窟M展】纖維素酶(cellulase)是將纖維素降解成纖維二糖和葡萄糖等小分子物質(zhì)的一類酶的總稱。纖維素降解生成葡萄糖需要至少3種纖維素酶協(xié)同作用才能完成，分別是內(nèi)切葡聚糖酶(endo-1，4-β-D-glucanase)、外切葡聚糖酶(exo-1，4-β-D-glucanase)和β-葡萄糖苷酶(β-D-glucosidase)[5]。而據(jù)報道從福壽螺(Ampullaria crossean)胃組織分離的多功能纖維素酶基因(multi-functional cellulase gene，MFC)能夠編碼內(nèi)切葡聚糖酶(endo-1，4-β-D-glucanase)、外切葡聚糖酶(exo-1，4-β-D-glucanase)和β-葡萄糖苷酶(β-D-glucosidase)這3種纖維素酶[5]，應(yīng)用前景看好。目前已在灰蓋鬼傘[6]和草菇等食用菌進行了轉(zhuǎn)化研究。但多功能纖維素酶基因(MFC)來源于福壽螺組織，在其它物種細胞中不一定能夠穩(wěn)定高效表達。因為每個氨基酸在同義密碼子使用上都存在明顯的物種偏好性[7]，并且密碼子優(yōu)化與否直接決定著mRNA的穩(wěn)定性，進而影響核糖體易位和蛋白翻譯[8]。因此，異源基因的密碼子優(yōu)化改造對于外源基因的遺傳轉(zhuǎn)化表達十分必要?！颈狙芯壳腥朦c】為了使福壽螺組織克隆得到的多功能纖維素酶基因(MFC)能夠在毛木耳中進行有效穩(wěn)定表達，課題擬開展福壽螺MFC基因與毛木耳轉(zhuǎn)錄本CDS密碼子偏好性比較分析，并依據(jù)毛木耳密碼子偏好性特征優(yōu)化MFC序列?！緮M解決的關(guān)鍵問題】為福壽螺多功能纖維素酶基因(MFC)在毛木耳細胞轉(zhuǎn)化表達提供支撐，并為毛木耳等相關(guān)食用菌種類的功能基因發(fā)掘及改造等研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料:福壽螺，購自成都市青石橋市場。毛木耳菌株“黃耳10號”保存于四川省農(nóng)業(yè)科學院土壤肥料研究所。感受態(tài)細胞DH5α購自上海邁其生物科技有限公司。

試劑:本試驗RNA提取、1stcDNA合成試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司，RT-PCR試劑購自生工生物工程(上海)有限公司合成，高保真Taq酶購自MBIFermentas，pEASY-T1載體購自全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 MFC基因克隆 將福壽螺胃組織獲得后提取RNA，按照1stcDNA合成試劑盒說明書合成cDNA，使用引物對(mfcF1:5′-TCGACGACGCTTCAGTCAAGC-3′，mfcR1:5′-GTTGCCCTCTGAGTGTCGCTC-3′)通過高保真Taq酶PCR擴增MFC基因序列，純化擴增片段并兩端加“A”后將擴增片段連接到pEASY-T1載體，轉(zhuǎn)化質(zhì)粒到DH5α感受態(tài)細胞后挑單克隆送生工生物工程(上海)有限公司測序。

1.2.2 MFC基因序列分析 將測試獲得的MFC基因序列與GenBank登錄的近源序列EGXA (FJ183727.1，Ampullaria crossean)、MFC(EU5 99577.1，Ampullaria crossean)、EGX1(DQ848667.1，Pomacea canaliculata)、xylanase(AY941794.1，Ampullaria crossean、EGX3(DQ848668.1，Pomacea canaliculata cellulase)、EGX1(DQ848670.1，Pomacea

canaliculata)、EGX3(DQ848669.1，Pomacea canaliculata)進行序列比對，采用MEGA4軟件對GenBank中近緣基因序列與實驗測定MFC序列進行比對，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 密碼子偏好性分析 根據(jù)Paul和Elizabeth (1991)篩選原則[9](一條以ATG為起始密碼子，以TAA、TAG或TGA為終止密碼子且長度大于300 bp的完整CDS序列)，選取德陽什邡毛木耳栽培基地采集的黃耳10號子實體樣品測序獲得的CDS (comp22688-c0-seq，環(huán)三磷酸核苷水解酶蛋白)為毛木耳測試樣本，以克隆獲得的MFC基因為福壽螺測試樣本，運用CodonW軟件計算福壽螺及毛木耳密碼子使用次數(shù)和同義密碼子相對使用度。

1.2.4 MFC基因毛木耳適應(yīng)性密碼子優(yōu)化 利用同義密碼子置換的方法，達到破壞mRNA的核糖體結(jié)合位點及翻譯起始位點的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，得到具有最佳RNA二級結(jié)構(gòu)及自由能的序列[10]，并分析MFC基因改造前后的序列差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 MFC基因測序及分析

以CTAB法提取的MFC基因組DNA為模板，擴增、克隆測序得到1088 bp的MFC基因序列。該序列GenBank受理號為KF636134.1，基因序列見圖1。

2.2 MFC基因與近源基因系統(tǒng)發(fā)育分析

將福壽螺MFC基因序列與近緣基因EGXA (FJ183727.1，Ampullaria crossean)、MFC(EU599 577.1，Ampullaria crossean)、EGX1(DQ848667.1，Pomacea canaliculata)、xylanase(AY941794.1，Ampullaria crossean、EGX3(DQ848668.1，Pomacea canaliculata)、EGX1(DQ848670.1，Pomacea canaliculata)、EGX3(DQ848669.1，Pomacea canaliculata)進行序列比對。采用MEGA4軟件進行比對，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)。

通過比較發(fā)現(xiàn)實驗獲得MFC基因與其他近源基因存在差異，差異最小的是福壽螺來源的EGXA (FJ183727.1)和MFC(EU599577.1)，遺傳距離分別為0.006和0.007;差異最大的是同樣來源的EGX1(DQ848670.1)及EGX3(DQ848669.1)，遺傳距離分別為0.799和0.816。

2.3 福壽螺MFC序列與毛木耳轉(zhuǎn)錄本序列密碼子偏好性分析

運用CodonW軟件計算MFC基因序列及毛木耳轉(zhuǎn)錄組測序獲得CDS序列的密碼子使用次數(shù)和同義密碼子相對使用度。

圖1 福壽螺多功能纖維素酶基因(MFC)序列Fig.1 Sequences of MFC gene from Ampullaria crossean

圖2 福壽螺MFC基因與其它近源序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree based on MFC and closely related genes of other species

運用CodonW軟件分析了MFC基因的密碼子(共計396個)使用次數(shù)和同義密碼子相對使用度(表1～2)。其中RSCU＞1的密碼子共計21個，為福壽螺MFC基因的偏好性密碼子，其中CUG、GUG、AGC、AGA這4個密碼子RSCU≥2，偏好性較強。而毛木耳CDS(comp22688-c0-seq，環(huán)三磷酸核苷水解酶蛋白)共4996密碼子，RSCU＞1的密碼子共計26個，其中RSCU≥2密碼子有5個，分別為CUC、AUC、GUC、CGC、GGC，偏好性較強。

總體上，福壽螺與毛木耳偏好密碼子不同的氨基酸有10個(不包含起始密碼子及終止密碼子)，相同偏好密碼子的氨基酸有11個，不同偏好性密碼子約占半數(shù)。其中RSCU≥2密碼子中，福壽螺MFC基因有4個，毛木耳CDS有5個。其中4個氨基酸的密碼子偏好性最強，分別是亮氨酸(Leu)、纈氨酸(Val)、絲氨酸(Ser)、精氨酸(Arg)，并且偏好的密碼子都各不相同，毛木耳還多一個偏好性較強的異亮氨酸(Ile)。

2.4 MFC基因密碼子偏好性改造

利用多次同義密碼子置換，排除含有毛木耳CDS中利用率低于10%的密碼子以及存在反向重復(fù)堿基的候選序列，優(yōu)化得到具有最佳RNA二級結(jié)構(gòu)及自由能的序列(圖3)。

表1 MFC基因密碼子偏好性分析Table 1 Codon usage of MFC gene in Ampullaria crossean

優(yōu)化后的序列GC含量從原始MFC序列的54. 04%增加到58.16%，與毛木耳遺傳背景一致。用DNAstar7.1.0軟件檢測后發(fā)現(xiàn)優(yōu)化后的MFC序列最小自由能為-309.35 Kcal/mol，沒有發(fā)夾結(jié)構(gòu)、重復(fù)序列及反向重復(fù)序列(圖4)，序列優(yōu)化效果良好。

3 討 論

本實驗分析結(jié)果顯示福壽螺與毛木耳在氨基酸密碼子偏好性上存在明顯差異，如果不經(jīng)密碼子優(yōu)化直接轉(zhuǎn)入毛木耳，可能導致轉(zhuǎn)化后該基因形成mRNA在宿主細胞內(nèi)不能穩(wěn)定存在[8]。在翻譯上，如果福壽螺的基因密碼子在毛木耳細胞內(nèi)剛好是稀有密碼子，這類問題會導致該基因不能得到較好翻譯，從而影響該基因高效表達[11]。如本試驗中分析發(fā)現(xiàn)毛木耳就存在UUA、CUA、AUA、GUA等稀有密碼子，如果不排除存在這些含有毛木耳稀有密碼子的序列，那么轉(zhuǎn)導進入的毛木耳細胞的外源基因表達就會受到影響，不能實現(xiàn)實驗預(yù)期目的。排除了稀有密碼子、重復(fù)序列等不良影響因素設(shè)計的序列將是外源基因轉(zhuǎn)導進入宿主細胞表達的最佳材料。本實驗優(yōu)化的MFC基因片段與PPK2連接構(gòu)建農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化載體，通過AGL-1工程菌轉(zhuǎn)導進入毛木耳細胞，并得到了良好表達(結(jié)果另文發(fā)表)，這也是對密碼子優(yōu)化型基因高效表達的實驗驗證。

表2 毛木耳CDS密碼子偏好性分析Table 2 Codon usage of CDS in Auricularia polytricha

實驗將福壽螺基因MFC與毛木耳轉(zhuǎn)錄本CDS密碼子偏好性進行了比較分析，并依據(jù)毛木耳密碼子偏好性特征優(yōu)化獲得了改造型MFC序列，并在毛木耳細胞中得到了較好表達。實驗結(jié)果為毛木耳外源基因改造和表達提供了參考，表明外源基因的密碼子優(yōu)化改造是實現(xiàn)異源基因在宿主細胞高效表達的重要手段。

圖3 優(yōu)化型多功能纖維素酶基因(MFC)序列Fig.3 Codon-optimized sequence of MFC gene

圖4 優(yōu)化型多功能纖維素酶基因(MFC)序列重復(fù)序列檢測圖Fig.4 Determine of repeats in the codon-optimized sequences of MFC gene

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(責任編輯 陳 虹)

Codon Optim ization of M ulti-functional Cellulase Gene in Ampullaria crossean Based on Characteristic Codon Usage of CDS in Auricularia polytricha

JIA Ding-hong1，2，WANG Bo1，LIXiao-lin1，TANWei1，PENGWei-hong1*
(1.Soil and Fertilizer Institute，Sichuan Academy of Agricultural Sciences，Sichuan Chengdu 610066，China;2.Key Laboratory of Bio-resource and Bio-environment，College of Life Sciences，Sichuan University，Sichuan Chengdu 610064，China)

【Objective】For subsequent transgenic study onmulti-functional cellulase gene(Mfc)in Auricularia polytricha，its cloning and codon optimization were performed.【Method】The biosoftware of CodonW was used to analyze the differences of codon usage between M fc gene in Ampullaria crossean and CDS in A.polytricha，and codons of Mfc gene in A.crossean were optimized based on characteristic codon usage of CDS in A.polytricha.【Result】The GC contentof optimized Mfcsg sequence increased from 54.04%to58.16%，which was in accordance with A.polytricha genetically.【Conclusion】The GC content of optimized Mfcsg sequence was in accordance with A.polytricha genetically.No hairpins，direct repeats and inverted repeats were detected in the optimized Mfcsg sequence，which indicated that this sequence was able to be used as heterologous gene for the transgenic study of A.polytricha.

Ampullaria crossean;Auricularia polytricha;Codon optimization

S567.3+9

A

1001-4829(2017)8-1726-06

10.16213/j.cnki.scjas.2017.8.006

2016-03-22

四川省財政創(chuàng)新能力提升工程項目(2014QNJJ-012);突破性食用菌新品種選育、育種材料與方法創(chuàng)新項目“毛木耳抗病新品種選育研究”;國家食用菌產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-24);四川食用菌創(chuàng)新團隊

賈定洪(1977-)，男，博士，副研究員，主要從事食用菌分子生物學和遺傳育種研究，jdhdragon@qq.com，*為通訊作者。