喬 光，文曉鵬*，丁貴杰

木豆GDSL脂肪酶基因的克隆及表達(dá)分析

喬 光1，文曉鵬1*，丁貴杰2

(1.貴州大學(xué)農(nóng)業(yè)生物工程研究院，山地植物資源保護(hù)與種質(zhì)創(chuàng)新省部共建教育部重點實驗室，貴州貴陽 550025;2.貴州大學(xué)貴州省森林資源與環(huán)境研究中心，貴州貴陽 550025)

【目的】為探明GDSL家族脂肪酶的抗逆機(jī)理，【方法】在前期研究基礎(chǔ)上，利用RACE技術(shù)克隆木豆GDSL脂肪酶基因，并通過熒光定量PCR技術(shù)檢測其表達(dá)特性?！窘Y(jié)果】獲得1條木豆GDSL脂肪酶基因，命名為CcGDSL1，該基因含開放閱讀框全長1 107 bp，編碼369個氨基酸;經(jīng)同源性分析，CcGDSL1編碼的氨基酸序列與豆科植物中GDSL脂肪酶具有較高的相似性。該基因在葉、莖和根中均表達(dá)，且葉和莖中表達(dá)量顯著高于根;干旱脅迫能提高CcGDSL1的表達(dá)量，隨干旱的持續(xù)表現(xiàn)出先降后升隨后趨于穩(wěn)定的表達(dá)模式?！窘Y(jié)論】推測CcGDSL1基因參與木豆應(yīng)激干旱脅迫。

木豆;GDSL脂肪酶;克隆;表達(dá)

【研究意義】植物脂肪酶根據(jù)編碼蛋白催化活性區(qū)域氨基酸序列的保守型分為GXSXG脂肪酶和GDSL脂肪酶[1]。GDSL型脂肪酶是一類水解酶，廣泛存在于原核和真核生物中[2]。隨著科學(xué)研究的深入發(fā)現(xiàn)，GDSL型脂肪酶是一個較大的基因家族，具有器官特異性表達(dá)的特點[3]，在生物代謝、發(fā)育及形態(tài)建成等方面都發(fā)揮著重要作用。【前人研究進(jìn)展】近年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，GDSL脂肪酶參與了植物逆境脅迫防御過程。Hong等[4]報道辣椒中CaGLIP1同源物受高鹽、干旱和傷害等多種脅迫因子的誘導(dǎo)。Naranjo等[5]發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)一個擬南芥GDSL酯酶(AtLTL1)能提高酵母和擬南芥的抗鹽能力?？梢娮鳛榇蟮闹参锘蚣易澹珿DSL脂肪酶功能多樣，且因物種不同功能也有所差異。木豆(Cajanus cajan)是豆科木豆屬唯一栽培種，其植株直立、木質(zhì)化，為多年生常綠灌木[6]，主要分布在我國云南、貴州、廣東、福建和湖南等西南和華南省區(qū)[7]。除具有較高的藥用和營養(yǎng)價值[8]外，木豆更重要的價值表現(xiàn)在生態(tài)保護(hù)方面，其耐旱、耐瘠、生長迅速、根系發(fā)達(dá)，成為南方山地造林、水土保持的優(yōu)良先鋒樹種[9]。【本研究切入點】基于木豆抗旱相關(guān)基因富集的抑制消減雜交(SSH)文庫中1條表達(dá)差異顯著的EST(NCBI登錄號為JK087058)，經(jīng)序列分析發(fā)現(xiàn)其編碼的蛋白質(zhì)與擬南芥GDSL脂肪酶(Q9SVU5.1)同源性較高，目前關(guān)于木豆GDSL脂肪酶基因的研究鮮見報道。【擬解決的關(guān)鍵問題】筆者在此基礎(chǔ)上開展木豆GDSL脂肪酶基因的克隆及表達(dá)分析研究，以期豐富GDSL脂肪酶生物學(xué)功能，并為木豆抗旱性研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料及處理

供試木豆品種為桂木1號，播種前先將種子用0.1%升汞消毒5 min，接著用45℃溫水浸泡約1 min，無菌水沖洗4次后放置于墊有1張濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，轉(zhuǎn)入30℃恒溫培養(yǎng)箱中催芽培養(yǎng)1 d。將催芽處理后的種子播種于裝有培養(yǎng)基質(zhì)的塑料盆(15 cm×12 cm)中，每盆播15粒種子，在土壤相對含水量70%～80%、溫度20～25℃條件下培養(yǎng)。播種90 d后挑選長勢基本一致的幼苗進(jìn)行干旱脅迫處理，通過稱重法控制土壤相對含水量約為田間持水量的50%，對照處理控制在70%～80 %，每處理10次重復(fù)(10盆)。分別于脅迫處理后第3、5、10、15、20、25、30天收集植株葉片、莖段和根，液氮速凍后置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 RNA提取

采用RNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司，北京)提取各樣品總RNA，使用RNase-free DNase I(天根生化科技有限公司，北京)去除殘留基因組DNA。所有操作均參照說明書，提取的RNA于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 全長序列克隆

對已獲得的木豆GDSL脂肪酶基因片段進(jìn)行序列比對分析發(fā)現(xiàn)，該片段已具有3'末端的全序列，因此僅需克隆其5'末端序列。利用RACE試劑盒(Clontech，美國)，等量混合對照處理不同時期葉片RNA，以此為模板，利用引物GSP-1(表1)和SUPERSCRIPT IIRT酶(RACE試劑盒提供)進(jìn)行5' RACE cDNA第1鏈的合成。以5'RACE cDNA為模板，以GSP-2(表1)和橋連鉚釘引物AAP(RACE試劑盒提供)為引物進(jìn)行第1輪PCR反應(yīng);以第1輪PCR反應(yīng)產(chǎn)物為模板，以GSP-3(表1)和橋連通用擴(kuò)增引物AUAP(試劑盒提供)為引物，進(jìn)行第2輪巢式PCR反應(yīng)，2輪PCR反應(yīng)條件均參考說明書設(shè)置。將第2輪PCR產(chǎn)物回收，克隆到PMD-18T載體(寶生物工程有限公司，大連)上，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞(天根生化科技有限公司，北京)，挑選陽性克隆送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.4 序列生物信息學(xué)分析

基因核酸序列的檢索及同源性分析由NCBI的BLAST服務(wù)器在線完成(http://blast.ncbi.nlm. nih.gov/);基因序列讀碼框搜索利用在線ORF Finder進(jìn)行(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi);氨基酸進(jìn)化樹運用Clustal進(jìn)行多重序列比對，由MEGA 6.0軟件生成;氨基酸理化性質(zhì)預(yù)測參照Protparam程序(http://web.expasy.org/protparam/);蛋白質(zhì)親水/疏水性分析使用ProtScale在線分析工具(http://expasy.org/tools/protscale.html);磷酸化位點分析和跨膜區(qū)分析分別利用丹麥科技大學(xué)(DTU)的CBS服務(wù)器上的NetPhos 2.0 Server程序(http://www.cbs.dtu.dk/services/Net-Phos/)和TMHMM Server v.2.0程序(http://www. cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)完成;亞細(xì)胞定位通過WoLF PSORT工具完成(http://wolfpsort.seq. cbrc.jp/);蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測使用GOR方法完成(http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa-automat. pl?page=/NPSA/npsa-hnn.html);蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測使用SWISS-MIDEL工具(http://swissmodel. expasy.org)，觀察使用Raswin軟件。

1.5 基因表達(dá)分析

等量混合各處理不同時期根、莖和葉的RNA，以此為模板進(jìn)行組織特異性表達(dá)分析;以各處理不同時期葉片RNA為模板，進(jìn)行持續(xù)干旱脅迫下基因表達(dá)分析。參照Quantscript RT Kit(天根生化科技有限公司，北京)操作說明合成cDNA。以RTPF和RTPR(表1)為引物，利用RealMasterMix(SYBR Green)試劑盒(天根生化科技有限公司，北京)在ABI 7500PCR儀上進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，3次重復(fù)，反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性60 s;94℃變性15 s，58℃退火20 s，68℃延伸40 s，40個循環(huán)。以ACTF和ACTR(表1)為引物擴(kuò)增ACTIN基因作為內(nèi)參，利用2-ΔΔCt計算基因相對表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 木豆GDSL脂肪酶基因全長

經(jīng)過第1輪5'RACE PCR擴(kuò)增反應(yīng)后，無特異條帶出現(xiàn)。隨后進(jìn)行第2輪巢式PCR擴(kuò)增，獲得約960 bp目的片段，將此目的條帶純化后與pMD18T載體連接、轉(zhuǎn)化后對陽性克隆測序。將測序獲得的5'序列與文庫中已獲得的含3'序列通過中間重疊區(qū)拼接，獲得該基因cDNA全長序列，共1448 bp，其中開放閱讀框(ORF)長度為1107 bp，編碼369個氨基酸(圖1)，命名為CcGDSL1。

表1 PCR和RACE的引物序列Table 1 Primer sequence of PCR and RACE

2.2 木豆CcGDSL1基因序列的同源性及進(jìn)化樹

2.2.1 同源性 通過對氨基酸序列同源性比對后發(fā)現(xiàn)，木豆CcGDSL1與大豆GmGDSL(XP-003542450.1，90%)和野生大豆GsGDSL (KHN05905.1，88%)同源性較高，其次是鷹嘴豆CaGDSL(XP-004495029.2，77%)、首蓿MtGDSL (XP-013468381.1，75%)和菜豆PvGDSL(XP-007162645.1，74%)，而與葡萄VvGDSL(XP-010648948.1，72%)、煙草NtGDSL(XP-009587010. 1，67%)和擬南芥AtGDSL(AEE85543.1，63%)同源性較低(圖2)。

圖1 木豆CcGDSL1基因核苷酸序列及推測的氨基酸序列Fig.1 Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of C.cajan CcGDSL1

圖2 木豆CcGDSL1與其他植物中GDSL脂肪酶氨基酸序列的同源比對Fig.2 Homologous alignment in amino acid sequence between C.cajan CcGDSL1and GDSL lipase of other plants

2.2.2 進(jìn)化樹 由系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖3)可得，參與比對的GDSL脂肪酶可以分為3個亞組，其中木豆CcGDSL1與大豆、野生大豆、鷹嘴豆、首蓿和菜豆等豆科植物的GDSL脂肪酶聚為一類，擬南芥與葡萄的GDSL脂肪酶聚為一類，而煙草的GDSL脂肪酶獨自分為一類，說明豆科植物GDSL脂肪酶同源性高，進(jìn)化關(guān)系較近，而與擬南芥、葡萄和煙草等植物進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖3 木豆CcGDSL1與其他植物中GDSL脂肪酶的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree of C.cajan CcGDSL1 and GDSL lipase of other plants

2.3 木豆CcGDSL1基因的生物信息學(xué)序列

圖4 木豆CcGDSL1的三維結(jié)構(gòu)Fig.4 Three dimensional structure of C.cajan CcGDSL1

理化性質(zhì)預(yù)測結(jié)果表明，木豆CcGDSL1分子量為40.44 kDa，理論等電點(PI)為8.88，含量較豐富的是纈氨酸(V)8.1%、甘氨酸(G)8.9%、亮氨酸(L)9.8%，帶負(fù)電荷的氨基酸殘基總數(shù)為22個，帶正電荷的氨基酸殘基總數(shù)為28個，其消光系數(shù)為23880，蛋白質(zhì)不穩(wěn)定指數(shù)為35.16，該蛋白質(zhì)屬于穩(wěn)定蛋白質(zhì)，脂肪族指數(shù)86.37;根據(jù)ProtScale Sever在線分析，木豆CcGDSL1為疏水蛋白;根據(jù)磷酸化位點分析和跨膜區(qū)分析，該脂肪酶屬跨膜蛋白，含8個色氨酸(Ser)、6個蘇氨酸(Thr)和6個酪氨酸(Tyr)，可能成為蛋白激酶磷酸化位點;亞細(xì)胞定位預(yù)測得分為液泡6.0分，葉綠體3.0分，細(xì)胞外3.0分，細(xì)胞核1.0分，表明該蛋白最大可能定位于液泡;使用GOR方法進(jìn)行蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，表明木豆CcGDSL1由37.13%的α-螺旋、14.36%的延伸鏈和48.51%的無規(guī)則卷曲構(gòu)成;用SWISSMODEL數(shù)據(jù)庫預(yù)測該蛋白三維結(jié)構(gòu)，包括12個α-螺旋，11個β-折疊和38個β-轉(zhuǎn)角(圖4)。

圖5 木豆CcGDSL1基因在不同組織(A)和葉中不同干旱處理時間(B)的表達(dá)量Fig.5 Expression quantity of C.cajan CcGDSL1 in different tissues(A)and leaf under different drought treatment days(B)

2.4 木豆CcGDSL1基因的時空表達(dá)

利用熒光定量PCR檢測木豆CcGDSL1基因的組織表達(dá)差異發(fā)現(xiàn)，該基因在木豆幼苗葉、莖和根中均表達(dá)，其中葉和莖中表達(dá)量差異較小，顯著高于根中表達(dá)量(圖5A)，說明木豆CcGDSL1基因表達(dá)具有組織特異性。以干旱和對照2個處理葉片cDNA為模板，進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，檢測木豆CcGDSL1基因持續(xù)干旱條件下表達(dá)情況，隨著處理時間的增加，干旱和對照處理木豆CcGDSL1基因表達(dá)量均呈先降后升的趨勢，在處理5～15 d時，表達(dá)量降到最低，隨后表達(dá)量上升，在25～30 d時表達(dá)量趨于穩(wěn)定，并且在整個處理時間內(nèi)，干旱脅迫下其表達(dá)量均高于對照處理(圖5B)。

3 討 論

GDSL脂肪酶是廣泛存在于植物界的一個多基因家族，具有水解酶活性，能水解多種脂類物質(zhì)[10]。近年來，人們從擬南芥、水稻、玉米、葡萄和楊樹等多種植物中發(fā)現(xiàn)的GDSL脂肪酶成員超過1100個，其中在擬南芥中共發(fā)現(xiàn)108個家族成員，葡萄中發(fā)現(xiàn)96個家族成員[11-12]。本研究在前期構(gòu)建的木豆干旱脅迫SSH文庫基礎(chǔ)上，克隆獲得了1個木豆CcGDSL1基因的全長序列，豐富了植物GDSL脂肪酶家族成員。植物GDSL脂肪酶蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)包括5個保守區(qū)域(I～V)，在酶催化過程中起重要作用的氨基酸殘基Ser(S)、Gly(G)、Asn(N)和His (H)分別位于I、II、III和V4個保守域中[13]。由氨基酸序列同源性分析發(fā)現(xiàn)，木豆CcGDSL1脂肪酶氨基酸序列與其他植物存在差異，但在這4個保守域中未發(fā)生變異。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，GDSL酯酶在豆科植物進(jìn)化中具有較高保守性。

Oh等[14]對1個含有GDSL結(jié)構(gòu)域的分泌蛋白(GLIP1)進(jìn)行亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)，GLIP1定位于胞外基質(zhì)。奈婕菲等[15]構(gòu)建了GFP融合表達(dá)載體，將1個楊樹GDSL蛋白定位于細(xì)胞壁。Ling等[12]利用亞細(xì)胞定位分析工具將99個擬南芥GDSL脂肪酶蛋白定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。還有研究報道將含有GDSL結(jié)構(gòu)域的蛋白定位于細(xì)胞內(nèi)膜和囊泡等[16]，本研究利用WoLF PSORT預(yù)測工具將CcGDSL1蛋白定位于液泡，這些蛋白在細(xì)胞亞結(jié)構(gòu)的不同定位，顯示著不同GDSL具有的多種生物學(xué)功能[2]。

植物GDSL脂肪酶家族成員組織表達(dá)模式存在冗余性和特異性[15]，Lee等[17]研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥與抗病相關(guān)的GDSL脂肪酶基因(AtGLP1)在幼苗、葉、根、莖和花中均有表達(dá)，而與之高度同源的AtGLP2卻僅在幼苗、莖和根中表達(dá)。奈婕菲等[15]發(fā)現(xiàn)，楊樹GDSL基因在不同莖節(jié)上轉(zhuǎn)錄表達(dá)豐度不同。本研究發(fā)現(xiàn)，木豆CcGDSL1基因在葉和莖中表達(dá)量接近，顯著高于根中表達(dá)量。

植物GDSL脂肪酶廣泛參與植物正常生長發(fā)育、器官形態(tài)建成和次生代謝等生理活動。近年來，越來越多文獻(xiàn)報道其參與逆境脅迫生理過程。Kram等[18]研究發(fā)現(xiàn)，藍(lán)花楹花蜜中的GDSL脂肪酶JNP1可以直接破壞微生物的細(xì)胞膜而抑制微生物活性，從而參與植物的抗逆反應(yīng)。Kwon等[19]研究證明，擬南芥GLIP1蛋白能夠響應(yīng)乙烯信號而激發(fā)系統(tǒng)抗性。本研究發(fā)現(xiàn)，木豆CcGDSL1基因在干旱脅迫下表達(dá)量升高，說明其有可能參與到木豆抗旱的生理過程。同時，干旱與對照處理隨著木豆幼苗的生長CcGDSL1基因均表現(xiàn)出先下降后上升的趨勢，說明該基因也參與到木豆生長發(fā)育過程，其原因可能是脂肪酶是脂代謝中的關(guān)鍵酶，能催化長鏈脂肪酸甘油酯水解為甘油和長鏈脂肪酸，而脂肪酸是生物體中重要的組成成分，可作為重要的信號分子參與細(xì)胞的生長發(fā)育[20]。由此可見，木豆CcGDSL1基因具有復(fù)雜功能，要想全面闡明該基因的功能還有待于進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

克隆獲得了木豆CcGDSL1基因序列，其ORF全長1107 bp，編碼369個氨基酸。生物信息學(xué)分析結(jié)果表明CcGDSL1脂肪酶為穩(wěn)定的疏水蛋白，有20個磷酸化位點，定位于液泡，屬跨膜蛋白，與豆科植物GDSL脂肪酶同源性較高、進(jìn)化關(guān)系較近。該基因具有組織表達(dá)特異性，在葉和莖的表達(dá)量顯著高于根中表達(dá)量，且干旱脅迫能誘導(dǎo)其大量表達(dá)，說明木豆CcGDSL1參與抗旱生理過程，其生理功能豐富。

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(責(zé)任編輯 劉忠麗)

Cloning and Expression Analysis of GDSL Lipase Gene in Cajanus cajan

QIAO Guang1，WEN Xiao-peng1*，DING Gui-jie2
(1.Key Laboratory of Plant Resource Conservation and Germplasm Innovation in Mountainous Region Ministry of Education，Institute of Agro-bioengineering，Guizhou University，Guizhou Guiyang 550025，China;2.Research Center for Forestry Resources and Environment，Guizhou University，Guizhou Guiyang 550025，China)

【Objective】The aim of the present paper is to discuss the adverse stress resistancemechanism of GDSL lipases.【Method】The GDSL lipase of C.cajan is cloned by RACE technology based on the preliminary study and then the expression characteristics are detected by fluorogenic quantitative PCR.【Result】An obtained GDSL lipase of C.cajan is named as CcGDSL1 and its total length of open reading frame is 1107 bp with 369 amino acids.The homology analysis shows that the amino acid sequence of CcGDSL1 has a high similarity with GDSL lipases of other legume plants.CcGDSL1 can express in leaf，stem and rootbut the expression quantity in leaf and stem is higher than in root significantly.Drought stress can increase the expression quantity of CcGDSL1 and the expression quantity of CcGDSL1 presents an expression pattern of first declining，then rising and finally stable with sustained drought.【Conclusion】CcGDSL1 may participate in stress reaction of C.cajan under drought stress.

Cajanus cajan;GDSL lipase;Cloning;Expression

S643.9

A

1001-4829(2017)8-1720-06

10.16213/j.cnki.scjas.2017.8.005

2016-12-17

國家自然科學(xué)基金項目“利用GeneFishing解析VA菌根增強(qiáng)木豆抗旱能力的分子機(jī)理”(30860224);貴州省科學(xué)技術(shù)基金項目“在轉(zhuǎn)錄水平解析木豆抗旱的分子機(jī)理”(20092076)

喬 光(1981-)，男，山西晉中人，博士，從事森林培育研究，E-mail:13518504594@163.com，*為通訊作者:文曉鵬，E-mail:xpwensc@hotmail.com。