王冕+李威

摘 要：酶修飾電極是最常用更是最早開(kāi)發(fā)出來(lái)的生物傳感器，而酶電極法也深受有機(jī)分析、生化分析和藥物分析工作者青睞，而酶固定化作為酶電極的核心技術(shù)也一直以來(lái)受到科研人員的關(guān)注。據(jù)此，主要對(duì)酶電極中酶固定化技術(shù)這一領(lǐng)域近年來(lái)的研究成果進(jìn)行綜述。

關(guān)鍵詞：酶修飾電極；固定化酶；研究進(jìn)展

中圖分類(lèi)號(hào)：TB文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.19311/j.cnki.1672-3198.2017.20.102

1 緒論

酶電極是將游離的活性酶固定在基體電極的表面，通過(guò)相應(yīng)的酶促反應(yīng)來(lái)對(duì)待測(cè)物的濃度進(jìn)行測(cè)量，而且按照基體電極所得的不同信號(hào)可將酶電極區(qū)分為電流型和電位型兩種類(lèi)別。世界上第一個(gè)酶電極的誕生需要追溯到1956年Clark提出把酶與電極結(jié)合在一起的猜想，并在1962年證實(shí)了葡萄糖氧化酶與氧電極結(jié)合在一起并對(duì)葡萄糖進(jìn)行檢測(cè)的可行性。酶電極法因?yàn)槠鋼碛兄磻?yīng)速度快、選擇性好和制作簡(jiǎn)便經(jīng)濟(jì)的特點(diǎn)深受有機(jī)分析、生化分析和藥物分析工作者的青睞。

酶是一種具有生物催化功能的高分子物質(zhì)，化學(xué)本質(zhì)是大多為蛋白質(zhì)，其本身可被微生物所降解，而且酶還擁有較好的選擇性和催化活性，是一種綠色而又高效的催化劑。不過(guò)游離狀態(tài)下的酶對(duì)外界環(huán)境十分敏感，酶的性質(zhì)不穩(wěn)定，在一些極端環(huán)境下容易失活，并且蛋白質(zhì)分子較小，容易在催化反應(yīng)之后混入一些雜質(zhì)，這讓反應(yīng)之后對(duì)產(chǎn)物的提純?cè)斐闪艘欢ǖ穆闊?，所以為了克服以上游離狀態(tài)下的酶所出現(xiàn)的問(wèn)題，就出現(xiàn)了酶固定化技術(shù)。

酶固定化是指使用材料把游離狀態(tài)下活性酶限制在一定范圍內(nèi)，但依舊保證酶具有催化能力，而且使酶更容易被回收和可以反復(fù)利用的一種新技術(shù)。與游離狀態(tài)下的酶和天然酶相比，固定化酶除了在穩(wěn)定性、活力與選擇性上得到了提升之外，固定化還能使酶促反應(yīng)過(guò)程得到更加嚴(yán)格的控制同時(shí)使酶更容易與底物分開(kāi)。

本文介紹了酶電極和固定化酶的一些基本信息，重點(diǎn)對(duì)制作酶電極的關(guān)鍵技術(shù)酶的固定進(jìn)行了討論。對(duì)包括吸附固定、包埋固定、共價(jià)鍵合固定和交聯(lián)固定的傳統(tǒng)酶固定方法和一些新型酶固定方法例如納米技術(shù)處理、靜電紡絲和磁處理進(jìn)行了介紹并進(jìn)一步對(duì)各種固定方法的優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行了探討。

2 傳統(tǒng)酶固定化方法

2.1 吸附固定

吸附固定主要是通過(guò)范德華力、親核作用和氫鍵等作用力，把酶固定到合適的載體上或是直接固定于電極表面。這種方法操作簡(jiǎn)單，在溫和條件下即可完成固定過(guò)程，最重要的是跟其他酶固定化方法相比，這種方法沒(méi)有涉及化學(xué)修飾，在很大程度上保持酶的活力，但也是因?yàn)檫@種方式只是單純地使酶吸附在載體之上，使通過(guò)這種方法得到的固定化酶因?yàn)榕c載體相互作用較弱而極易從載體中脫落。李賽等在鈦絲基體上沉積了一層納米級(jí)的二氧化鈦（TiO2）的多孔膜，再把尿素酶直接吸附在二氧化鈦膜上，基于二氧化鈦膜對(duì)PH的響應(yīng)，制造出了一種廉價(jià)、易微型化的PH敏感的尿素酶修飾電極。李文娟等使用靜電吸附的固定方法將辣根過(guò)氧化物酶固定于以氨基苯磺酸電聚合膜為基底，使用層層靜電組裝技術(shù)固定納米金和多層天青Ⅰ所制備的復(fù)合薄膜上，從而制得過(guò)氧化氫酶修飾電極。該酶修飾電極1.5mmol/L的米氏常數(shù)說(shuō)明在電極上所固定的酶具有較高的生物活性。

2.2 交聯(lián)固定

交聯(lián)固定通過(guò)讓酶分子與雙（多）功能交聯(lián)試劑反應(yīng)讓酶分子內(nèi)部或酶分子間發(fā)生交聯(lián)，以形成不溶于水的三維交聯(lián)體最后附著在固體表面而達(dá)到使酶固定的方法。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是所形成的生物組分的固定比較牢固，不易脫落，使用壽命較長(zhǎng)，不過(guò)缺點(diǎn)是反應(yīng)比較難以控制，反應(yīng)中交聯(lián)劑的量和溶液的pH值等各個(gè)步驟都需要小心地控制。畢春元等用戊二醛把吡喃糖氧化酶固定于醋酸纖維素載體的膜上，制備出電流型電化學(xué)酶修飾電極。測(cè)試結(jié)果表明，該酶電極對(duì)木糖和葡萄糖都有著杰出的響應(yīng)特征。黃曉東等以殼聚糖作為固酶基質(zhì)，以在玻碳電極上電聚合的甲苯銨藍(lán)為電子的傳遞介體，以戊二醛為交聯(lián)劑將葡萄糖氧化酶在真空狀況下固定在被甲苯胺藍(lán)修飾的玻碳電極表面，制成葡萄糖氧化酶修飾電極。這種酶修飾電極的選擇性很好，即便在尿酸、抗壞血酸以及磷酸等一些成分浮渣的溶液中，也可以獲得較為準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)。

2.3 包埋固定

包埋固定其實(shí)就是指將酶包埋在聚合物或是凝膠的微囊結(jié)構(gòu)或者格子結(jié)構(gòu)中，這種方法不僅讓底物可以滲透到格子里與酶接觸與其發(fā)生酶促反應(yīng)，同時(shí)還可以有效地減少酶蛋白的流失。因?yàn)樵诎襁^(guò)程中酶蛋白一般沒(méi)有發(fā)生氨基酸殘基的結(jié)合反應(yīng)，所以其本身的高級(jí)結(jié)構(gòu)可以說(shuō)沒(méi)有發(fā)生任何變化，酶本身的特征也得以比較完好的保留下來(lái)，不過(guò)包埋的過(guò)程中總是伴隨著化學(xué)聚合反應(yīng)，這容易使酶的活性喪失，所以以包埋法固定酶需要注意反應(yīng)條件，在反應(yīng)的過(guò)程中應(yīng)盡量避免發(fā)生化學(xué)聚合。韓恩等使用被聚二烯丙基二甲基氯化鈉（ PDDA）功能化的碳納米管采取包埋的方法將酪氨酸酶固載在玻碳電極的表面，以莠去津農(nóng)藥對(duì)酪氨酸酶的抑制作用為作用原理，構(gòu)建了一種可以快速對(duì)莠去津農(nóng)藥進(jìn)行檢測(cè)的酶修飾電極。而謝德明等人利用殼聚糖以包埋固定的方式固定 TCNQ和乙酰膽堿酯酶到泡沫鎳載體的表面，制備出 TCNQ/乙酰膽堿酯酶修飾電極，通過(guò)后期測(cè)試表明，當(dāng)殼聚糖溶液和 TCNQ丙酮溶液混合比例為1.5∶1和殼聚糖溶液與乙酰膽堿酯酶溶液的混合比例為1∶1時(shí)，乙酰膽堿酯酶修飾電極的性能最好。

2.4 共價(jià)鍵和固定

共價(jià)鍵和固定法是以共價(jià)固定的方式把酶固定到契合的載體上，共價(jià)鍵和固定法主要有兩種類(lèi)型：一種是讓酶上的有關(guān)基團(tuán)與載體上經(jīng)過(guò)活化的有關(guān)基團(tuán)進(jìn)行偶聯(lián)；另一種則是讓酶先與雙功能發(fā)生偶聯(lián)，再將發(fā)生偶聯(lián)的雙功能試劑連接到載體上，在這之中最常用的雙功能試劑為戊二醛。與其他固定化酶和天然的未經(jīng)過(guò)固定化的酶相比，經(jīng)共價(jià)鍵和的固定化酶的性能如選擇性、穩(wěn)定性和活力都有著顯著的提升。牛真真等人制備了以硫堇、納米金和對(duì)氨基苯丙酸（4-ABA）共價(jià)鍵和葡萄糖氧化酶的新型酶修飾電極。這種葡萄糖氧化酶修飾電極是通過(guò)把醛基化的葡萄糖氧化酶跟硫堇和半胱氨酸以共價(jià)鍵和的形式層層組裝于玻碳電極的表面，將氧化酶與硫堇所構(gòu)造出的酶自組裝多層膜當(dāng)作葡萄糖的生物傳感界面使用。這種方法簡(jiǎn)單易行，雙層的膜電極的共價(jià)鍵高度穩(wěn)定，納米金粒子的加入，使電極表面酶的固載量增加，也改善了電極界面電子傳遞的能力，使這種酶修飾電極具有較低的檢出限，而且該酶修飾電極的線性范圍也有所提升。任群翔等同樣利用共價(jià)鍵和的方法將葡萄糖氧化酶固定于基體電極表面，不過(guò)他們?cè)诠潭ㄟ^(guò)程中加入了石墨烯，這讓電極比表面積增加，從而提高了氧化酶在基體電極表面的固載量。endprint

以上幾種傳統(tǒng)的酶固定化方法各有其優(yōu)缺點(diǎn)，在現(xiàn)實(shí)的應(yīng)用中，可按照實(shí)際情況和具體要求采納此中任意一種固定化方法，有時(shí)也可以同時(shí)將兩種或者數(shù)種固定化方法進(jìn)行聯(lián)用。馬立輝等人為了實(shí)現(xiàn)精確而又快速地對(duì)發(fā)酵酒中尿素的含量進(jìn)行檢測(cè)，以明膠與殼聚糖為包埋材料，透析膜為載體，把戊二醛作為交聯(lián)劑，用包埋、吸附和交聯(lián)三種固定化方法聯(lián)用，制作了固定化的脲酶膜，最后修飾到銨離子選擇電極上，所得的酶修飾電極具備對(duì)發(fā)酵酒中的尿素進(jìn)行準(zhǔn)確而又快速測(cè)定的能力。此酶修飾電極的每片脲酶膜都可以進(jìn)行多次測(cè)量，并且是可更換的，這使測(cè)量的成本降低。而且這種酶修飾可在酸性的環(huán)境下對(duì)發(fā)酵酒中尿素含量的進(jìn)行快速檢測(cè)，這為控制發(fā)酵酒的營(yíng)養(yǎng)、質(zhì)量以及食用安全提供了有力的技術(shù)支撐。

3 新型酶固定化方法

3.1 納米處理

納米技術(shù)處理是指利用酶與納米材料相結(jié)合，制備成納米固定化酶，因?yàn)榧{米材料特殊的理化性質(zhì)，使用納米技術(shù)處理的固定化酶在酶的活性上有著很大提升，酶本身的理化性質(zhì)得到了優(yōu)化，在酶促反應(yīng)中的速度得到提高，其穩(wěn)定性也得到了改善，進(jìn)而將酶利用率與生產(chǎn)效率提高。施賽花為了使酪氨酸酶的活性獲得提高，將碳納米管引入到酪氨酸酶膜所修飾的電極上，這一舉動(dòng)還加快了電極反應(yīng)的速度，電極響應(yīng)的強(qiáng)度也得到加強(qiáng)，這讓該酪氨酸酶膜修飾電極的靈敏度比普通的酪氨酸酶膜修飾電極增大了5倍。這為在水環(huán)境中對(duì)痕量酚進(jìn)行測(cè)定提供了一種靈敏、穩(wěn)定又簡(jiǎn)單高效的測(cè)定方法。劉洋等將 Au/ TiO2納米復(fù)合材料修飾于針型 Pt電極上，再將葡萄糖以戊二醛作為交聯(lián)劑固定在此修飾電極之上，最后在酶電極上用5%Nafion乙醇溶液涂膜形成高分子保護(hù)膜，所制備的酶修飾電極具有可植入使用的特點(diǎn)。作為一種可植入器件的雛形，該酶修飾電極有望在將來(lái)發(fā)展成為有現(xiàn)實(shí)應(yīng)用前景的臨床檢測(cè)裝備。

3.2 磁處理

磁處理就是在固定的過(guò)程中使用具有磁響應(yīng)性的材料進(jìn)行固定利，這種固定方法所得到的固定化酶也具有磁相應(yīng)性，只需要在外環(huán)境中給與磁場(chǎng)便可以簡(jiǎn)便地對(duì)酶進(jìn)行回收。而磁性載體可以將磁性氧化物四氧化三鐵、聚苯乙烯還有含醛基的聚合物等載體在一起溶解混合后，再將溶劑除去以此得到磁性載體，或者直接使用內(nèi)部含有磁性物質(zhì)的具有磁響應(yīng)性的超細(xì)粉末磁性高分子微球做磁性載體。中國(guó)專(zhuān)利 CN101329296 A（2008）把碳納米管超聲分散到含二價(jià)和三價(jià)鐵離子的殼聚糖酸水溶液里，制備出由殼聚糖、碳納米管和四氧化三鐵構(gòu)成具有磁響應(yīng)性的三組分納米復(fù)合材料，然后以戊二醛作為交聯(lián)劑，依靠葡萄糖氧化酶的伯氨基與其交聯(lián)，將其固定到所制備的磁性納米復(fù)合材料表面。

4 展望

最近的幾十年來(lái)，酶的固定化方法因?yàn)橐恍┬碌募夹g(shù)和材料的加入所以得到很好的發(fā)展和完善，而且與一些傳統(tǒng)方法固定所得到的固定化酶相比，使用新型固定化技術(shù)所制作出來(lái)的固定化酶有著更強(qiáng)的催化活力而且酶的性質(zhì)更加穩(wěn)定。但是在酶電極中酶固定法研究的現(xiàn)階段，仍然有許多問(wèn)題需要我們?nèi)ソ鉀Q，比如說(shuō)大多是酶固定方法所需的條件都需要在實(shí)驗(yàn)室里才能達(dá)到，還不能做到大規(guī)模制備。酶固定化作為酶電極的核心技術(shù)，在此后的研究中仍然會(huì)是這個(gè)方面的研究重點(diǎn)和熱點(diǎn)。研究和探索新的酶固定化技術(shù)，延長(zhǎng)固定化酶的半衰期、提高活力回收率、優(yōu)化酶固定化時(shí)所需條件和降低固定化酶的制備成本將會(huì)成為固定化酶領(lǐng)域今后主要的研究方向。

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