叢麗麗， 康俊梅， 張鐵軍， 龍瑞才， 楊青川*

(1．中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所， 北京 100193； 2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院， 山東 青島 266109)

紫花苜蓿(MedicagosativaL.)是世界上分布最廣泛的多年生豆科牧草，由于較高的產(chǎn)量和優(yōu)良的品質(zhì)使之享有“牧草之王”的美譽(yù)[1]。它的另一優(yōu)勢是一次種植可利用多年，但因利用年限較長，根腐病已成為產(chǎn)量下降和植株衰敗的一個極其重要的原因。該病害是世界性病害，幾乎在所有苜蓿產(chǎn)區(qū)都有發(fā)生，據(jù)估計，每年全世界由該病造成的產(chǎn)量損失在20% 左右，有些嚴(yán)重發(fā)生的地塊甚至達(dá)到40%[2-3]。隨著種植面積的增加和種植年限的延長，病害問題會越來越嚴(yán)重，不僅降低了苜蓿的產(chǎn)量，還降低了品質(zhì)，有些甚至失去了加工和利用價值，同時也會給奶業(yè)帶來隱患，因為根腐病的主要致病菌如鐮刀菌屬(FusariumLink ex Fr.)的三線鐮孢菌(F.tritinctum)以及腐皮鐮孢菌(F.solani)等菌種可以產(chǎn)生毒素[2]。其中，玉米赤霉烯酮(zearalenone, ZEN)和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivaleno, DON)是較為常見、影響較大的兩種毒素[5]。ZEN具有較強(qiáng)的生殖發(fā)育、免疫和細(xì)胞毒性，對腫瘤的產(chǎn)生也有一定影響[6]；DON對人畜具有高度危害性，可致急性中毒癥狀[7]。如果牛羊等家畜采食了含有這些毒素的苜蓿飼料，不僅對家畜本身帶來了影響，而且也會間接對消費者帶來傷害。因此，苜蓿根腐病致病菌的分離鑒定對后續(xù)的防治及抗病品種的培育具有重要意義。

由鐮刀菌引起的苜蓿根腐病迄今已在加拿大、美國、新西蘭、日本、澳大利亞等許多國家有所報道[8-13]。該病對紫花苜蓿生長的各個時期均可造成嚴(yán)重危害。2003年，李敏權(quán)[14]等對甘肅定西苜蓿根腐病的病原研究中發(fā)現(xiàn)了3種鐮刀菌，即尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)、銳頂鐮刀菌(F.acuminatum)和半裸鐮刀菌(F.semitectum)，這是我國首次對該病病原系統(tǒng)的研究報道。

過去我國關(guān)于苜蓿根腐病的研究一直集中在田間癥狀、防治等方面，對病原系統(tǒng)的研究報道不多。另外，鐮刀菌是真菌中最難鑒定和最具經(jīng)濟(jì)價值的屬之一，其形態(tài)復(fù)雜，又易受外界環(huán)境影響發(fā)生變異，通過形態(tài)學(xué)觀察很難準(zhǔn)確鑒定到種。本試驗在形態(tài)學(xué)觀察的基礎(chǔ)上，結(jié)合分子生物學(xué)手段，確保致病菌鑒定的準(zhǔn)確性。本研究擬通過對河北廊坊、內(nèi)蒙古臨河和山西陽高縣栽培苜蓿的田間調(diào)查、致病菌的分離鑒定，確定苜蓿鐮刀菌根腐病的主要病原，為指導(dǎo)根腐病的田間防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料來源與準(zhǔn)備

對河北省廊坊市、內(nèi)蒙古臨河和山西陽高縣栽培2年以上的苜蓿田定點調(diào)查，觀察根腐病的田間癥狀。采集具有典型癥狀的鐮刀菌根腐病病株標(biāo)樣帶回實驗室分離鑒定。為了能分離優(yōu)勢致病菌，采樣后迅速進(jìn)行病原菌的分離和鑒定。

1.2 病原菌的分離純化

病斑處切取約5 mm×5 mm的小塊組織，用75%的酒精處理30 s，0.1%的升汞處理3 min，無菌水沖洗3～5次。PSA培養(yǎng)基上，25°C暗培養(yǎng)4 天，挑取菌絲于PSA培養(yǎng)基上純化3次。再經(jīng)過MGA培養(yǎng)基純化3次后通過在水瓊脂(WA) 平板上單孢梯度稀釋分離法進(jìn)一步純化到種。將單孢分離純化的鐮刀菌接到PSA的試管斜面培養(yǎng)基中4°C保存，每6個月轉(zhuǎn)管一次，用于后續(xù)的菌種鑒定。

1.3 病原菌形態(tài)學(xué)觀察

參考王拱辰的《常見鐮刀菌鑒定指南》以及Booth《鐮刀菌屬》的方法進(jìn)行菌種鑒定[15-16]。25°C培養(yǎng)4 d后，依據(jù)PSA培養(yǎng)基上的培養(yǎng)性狀，包括菌落形態(tài)和色澤及菌落生長速度；由于部分鐮刀菌株在PSA培養(yǎng)基和MGA培養(yǎng)基很難長孢子，所以本試驗通過VBC[17]和SNA[18]限定營養(yǎng)缺乏培養(yǎng)基上對大、小分生孢子的有無，分生孢子的形態(tài)及產(chǎn)生方式，厚垣孢子的有無以及著生方式等特征進(jìn)行形態(tài)鑒定。

1.4 分子生物學(xué)鑒定

為了鑒定的準(zhǔn)確性，在形態(tài)學(xué)特征鑒定的基礎(chǔ)上對分離菌株的核糖體基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)域 (rDNA-ITS)和翻譯延長因子1α基因(TEF-1α)序列進(jìn)行擴(kuò)增。取PSA培養(yǎng)基培養(yǎng)10 d的氣生菌絲，根據(jù)Simon G. Edwards[19]的方法提取基因組DNA。RDNA-ITS區(qū)域采用通用引物ITSl (5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’) 和ITS4 (5’-TCCTCCGCTTATTGATAT- GC- 3’)PCR擴(kuò)增。TEF-1α序列采用通用引物ef1(5’-ATGGGTAAGGAGGACAAGAC-3’)和ef2(5’-GGAAG TACCAGTGATCATGTT-3’)進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化，連接到pEASY-T1載體中并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，陽性克隆送交上海英俊生物技術(shù)公司測序。DNAMAN軟件對測序結(jié)果進(jìn)行剪切分析，剪切后在線比對分析。

1.5 進(jìn)化樹的構(gòu)建

獲得的RDNA-ITS序列和TEF-1α的序列分別與GenBank數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)和鑒定鐮刀菌的數(shù)據(jù)庫FUSARIUM-ID[20](http://isolate.fusariumdb.org/) 中的鐮刀菌的rDNA-RDNA-ITS和TEF-1α序列進(jìn)行比較， 利用MEGA 5軟件進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.6 致病性鑒定

參照Wang等[21]的接種方法，6個錐形瓶中分別放置200粒大小均勻的燕麥種子，加水浸泡過夜，除去多余水分，高壓滅菌2次。每個瓶中分別加入4個直徑1 cm的接種菌株的瓊脂塊。直到燕麥種子完全接種鐮刀菌后備用(約3周)。選擇飽滿健康的‘中苜2號’種子，75%的酒精消毒10 min，滅菌水洗5次后置于培養(yǎng)皿中催芽1天，播于直徑15 cm (高度13 cm)的盆中，營養(yǎng)土∶蛭石∶石英砂體積比為3∶1∶1，每盆15株，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(25℃光照/20℃黑暗，相對濕度80%)。待出苗10天后,每盆定苗10株，3個重復(fù)，每個重復(fù)30株。待植株培養(yǎng)40天后，將提前準(zhǔn)備好的燕麥接種于植株地下1 cm 根頸處，每株接種2粒,不接菌的為對照。接種85 d后觀察病害情況。根據(jù)病斑占根系面積的百分比進(jìn)行病害分級。分級標(biāo)準(zhǔn)為：0級，無癥狀；1級，根部輕度變色，根部壞死面積在1%～30%；2級，根部嚴(yán)重變黑褐色，壞死面積在30%～60%；3級，主根基本壞死，側(cè)根較少，壞死面積60%～100%。統(tǒng)計發(fā)病率(Disease incidence，DI)和病害嚴(yán)重指數(shù)(Disease severity index，DSI)。

DI(%)=(病株數(shù)/總株數(shù))×100

DSI(%)= ∑(各級病株數(shù)×該級代表值)/(調(diào)查總株數(shù)×最重級別代表值)× 100

接種85 d后，切取5 mm×3 mm感病根組織，70%乙醇消毒1 min，無菌水漂洗3次后接種于PSA平板上進(jìn)行分離和純化，并采用上述形態(tài)學(xué)觀察和分子鑒定的方法與最初的接種物進(jìn)行比較和鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原的分離純化

分離具有代表性鐮刀菌菌株6個，分別命名為C1，C2，C3，C4，C5和L1。其中河北廊坊分離的菌株為C1，內(nèi)蒙古臨河分離的菌株為C2和C3，山西高陽縣的為C4，C5 和L1。

2.2 病原的形態(tài)學(xué)鑒定

C1，C2，C3，C4，C5和L1菌株根據(jù)在 PSA，MGA，VBC和SNA培養(yǎng)基上的形態(tài)特征，初步鑒定如下：

C1：PSA培養(yǎng)基上，氣生菌絲叢卷毛狀(圖1-A)，培養(yǎng)基底部為青黑紅色，表面粉紅至白色，隨著生長天數(shù)的增加，變成棕色或紅棕色；氣生菌絲有隔，且具有側(cè)生分枝(圖1-E)。 在MGA培養(yǎng)基上呈白色絮狀菌落(圖1-B)，不易產(chǎn)生小型分生孢子和大型分生孢子；SNA培養(yǎng)基上菌落不規(guī)則(圖1-C)，產(chǎn)生大量的小型分生孢子(圖1-F)，多呈長橢圓型，2.5～7.1 μm×1.7～3.5 μm；在VBC促孢培養(yǎng)基上，中心白色周圍黃色的特殊菌落(圖1-D)，能產(chǎn)生大孢子(圖1-G)，鐮狀至彎曲、紡錘形，1端銳尖，多為3隔，17.0～30.6 μm×3.0～5.0 μm。

C2：PSA培養(yǎng)基上氣生菌絲叢卷毛狀，培養(yǎng)基底部為深黑紅色，表面中心為黃棕色，向外為粉紅色至白色(圖2-A)；在MGA培養(yǎng)基上呈白色絮狀菌落(圖2-B)；菌絲少有隔，分支較多(圖2-E)；SNA培養(yǎng)基表面呈粉紅色(圖2-C)，可產(chǎn)生大量的小型分生孢子(圖2-F)，小孢子長橢圓形或倒卵形，2.5～6.8 μm×1.7～3.2 μm，培養(yǎng)14天后可觀察到串生的厚垣孢子，球形或橢圓形(圖2-H)；在VBC培養(yǎng)基上呈桃紅色(圖2-D)，該培養(yǎng)基上大孢子稍彎曲或梨形，多為1隔(圖2-G)，17.4～29.8 μm×3.5～5.0 μm。

C3：PSA培養(yǎng)基基部灰藍(lán)色至無色，周圍為白色，氣生菌絲絨毛狀(圖3-A)，表面有明顯的環(huán)狀紋，氣生菌絲少隔，單軸分支(圖3-E)；MGA培養(yǎng)基為白色菌落，棉絮狀(圖3-B)；在VBC培養(yǎng)基上呈白色菌落(圖3-D)，產(chǎn)生的大型分生孢子兩端較鈍圓，鐮狀或棒狀，1～3隔，16.4 ～30.7 μm × 3.2～4.8 μm(圖3-G)；SNA培養(yǎng)基上菌落為白色，氣生菌絲稀疏(圖3-C)，小型分生孢子長橢圓形或腎形，2.5～8.2 μm × 1.8～2.9 μm(圖 3-F)。

圖3 菌株C3的形態(tài)特征Fig.3 The morphological characteristics of strain C3

C4：PSA培養(yǎng)基菌落為白色，氣生菌絲較稀疏(圖4-A)，菌絲有隔，單軸分支(圖4-E)； MGA培養(yǎng)基上生長較慢，呈白色菌落(圖4-B)；VBC培養(yǎng)基上呈不規(guī)則的白色菌落(圖4-D)，大型分生孢子短而粗，腎形或棒狀(圖4-G)，兩端較鈍圓，1隔，17.4～34.7 μm×3.2～5.8 μm；SNA培養(yǎng)基上表現(xiàn)為白色絮狀菌落(圖4-C)，小型分生孢子長橢圓形、卵形，3.1～8.0 μm×1.6～3.8 μm(圖 4-F)。

圖4 菌株C4的形態(tài)特征Fig.4 The morphological characteristics of strain C4

C5：PSA培養(yǎng)基上菌落呈白色，菌落基部培養(yǎng)基呈無色或乳黃色，氣生菌絲稀疏(圖5-A)；菌絲多隔(圖5-E)；MGA培養(yǎng)基上呈白色絮狀菌落(圖5-B)；在VBC培養(yǎng)基上呈白色稀疏菌落(圖5-D)，大型分生孢子鐮狀(圖5-G)，1隔，14.4～25.7×3.4～5.5 μm；SNA培養(yǎng)基上呈白色菌落(圖5-C)，產(chǎn)生的小型分生孢子橢圓形、卵形，大小差異較大，2.0～7.2 μm×1.6～3.8 μm(圖5-F)。

圖5 菌株C5的形態(tài)特征Fig.5 The morphological characteristics of strain C5

L1：PSA培養(yǎng)基上氣生菌絲白色，絨毛狀，邊緣整齊(圖6-A)，菌落培養(yǎng)后期中央基部白色變?yōu)樽匣疑籑GA培養(yǎng)基上白色菌落(圖6-B)；SNA培養(yǎng)基上菌落為白色(圖6-C)，產(chǎn)生的小型分生孢子無隔、棒狀、少數(shù)梨形，2.0～7.5×1.0～2.5 μm(圖6-F)；菌絲有隔和分支(圖6-E)；VBC培養(yǎng)基上菌落為白色(圖 6-D)，大型分生孢子微彎，鐮刀形，2～5個隔膜(圖6-G)，20～36.3×3.8～5.0 μm，以單瓶?；驈?fù)瓶梗假頭狀產(chǎn)孢(圖6-H)。

2.4 鐮刀菌的分子生物學(xué)鑒定

2.4.1分離鐮刀菌菌株rDNA-ITS和TEF-1α片段的克隆 6個菌株的rDNA-ITS序列大約為560 bp (圖 7-A)，TEF-1α序列大小約為 700 bp (圖7-B)。將擴(kuò)增產(chǎn)物純化后連接到T載體，經(jīng)抗性篩選和菌液PCR鑒定(圖7-C，D)，將陽性單克隆送交上海英俊生物公司測序。

圖6 菌株L1的形態(tài)特征Fig.6 The morphological characteristics of strain L1

圖7 菌株rDNA-ITS片段和 TEF-1α片段的PCR擴(kuò)增圖譜及菌液PCR鑒定圖譜 Fig. 7 Agarose gel electrophoretic analysis of rDNA-ITS and TEF-1α fragments

2.4.2rDNA-ITS和TEF-1α序列比對及分析 測序結(jié)果顯示，菌株間的rDNA-ITS和TEF-1α序列均有不同程度的變異。將序列提交到GenBank，登錄號見表1。所獲得的序列在NCBI和鐮刀菌Fusarium-ID數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，結(jié)果如表1所示，每個株系的rDNA-ITS區(qū)序列和TEF-1α序列的同源性均在99% ～100%之間，而且每個株系兩種序列的比對結(jié)果均為同一鐮刀菌種，進(jìn)一步證明了分離純化的純度高和鑒定結(jié)果的可靠。

表1 rDNA-ITS 和 TEF-1α 序列比對及鑒定結(jié)果Table 1 Blast and identification results of rDNA-ITS and TEF-1α

2.5 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

2.5.1基于rDNA-ITS區(qū)序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹 在基于rDNA-ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹中(圖8)，C1與C2菌株與NCBI和Fusarium-ID數(shù)據(jù)庫中的三線鐮刀菌(FJ233196，F(xiàn)D-01845，F(xiàn)D-01726)相聚于同一群，自舉值大于90%；C3，C4和C5與已上傳的腐皮鐮刀菌(AB470903，EU263916)聚為一類，其中C3與C5親緣關(guān)系較近；L1與層出鐮刀菌(FJ040179)聚一類，而與其他菌種距離較遠(yuǎn)。

圖8 基于rDNA-ITS區(qū)序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.8 Phylogenetic tree constructed with the program Neighbor-Joining(NJ)based on rDNA-ITS sequences

2.5.2基于TEF-1α區(qū)序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹 基于轉(zhuǎn)錄延伸因子TEF-1α序列構(gòu)建的進(jìn)化樹中(圖9)，聚類結(jié)果與以rDNA-ITS序列構(gòu)建的進(jìn)化樹結(jié)果相似。C1和C2與NCBI(JX3978650.1，JX397855.1)和Fusarium-ID(FD-01726- EF-1α)數(shù)據(jù)庫的三線鐮刀菌聚為一類；菌株C3，C4和C5與數(shù)據(jù)庫中已上傳的腐皮鐮刀菌(FD-01371-EF-1α，F(xiàn)D-01054-EF-1α，HQ731048.1)聚為一類；L1單獨與層出鐮刀菌(KC584816.1)聚為一類。

圖9 根據(jù)TEF-1α序列應(yīng)用鄰接法(NJ)構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.9 Phylogenetic tree constructed with the program Neighbor-Joining(NJ)based on TEF-1α sequences

2.6 不同病原分離物的致病性分析

通過回接試驗，發(fā)病植株癥狀表現(xiàn)與田間的癥狀基本一致，經(jīng)過形態(tài)觀察與分子鑒定確定從發(fā)病植株分離得到的鐮刀菌與用于接種的鐮刀菌相同，表明這6株鐮刀菌是苜蓿根腐病的致病菌。6個菌株的致病性有差異(表2)，其中L1 菌株和C4菌株的致病性較強(qiáng)，發(fā)病率均大于80%，病害嚴(yán)重指數(shù)均約為60%。C2 株系致病性最弱(DI 54.44%，DSI 29.63%)。 C1、C3和C5 菌株的發(fā)病率和致病性均無顯著差異，發(fā)病率分別為66.66%，62.22%和65.55%；病害嚴(yán)重指數(shù)分別為42.59%，40.37%和38.89%。

表2 不同病原分離物的致病性Table 2 Variation in virulence among isolates of Fusarium spp.

3 討論

鐮刀菌是真菌中最難鑒定和最具經(jīng)濟(jì)價值的屬之一，其形態(tài)復(fù)雜，又易受外界環(huán)境影響發(fā)生變異，通過形態(tài)學(xué)觀察很難準(zhǔn)確鑒定到種。本研究在形態(tài)學(xué)鑒定的基礎(chǔ)上， 采用了rDNA-ITS和TEF-1α兩個基因進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。其中rDNA-ITS是介于18S rDNA、5.8S rDNA 和28S rDNA 之間的區(qū)域，該區(qū)域進(jìn)化速度較編碼區(qū)快，被普遍用來進(jìn)行真菌種間或種內(nèi)的遺傳相似性的分子系統(tǒng)研究[22-24]。而TEF-1α在鐮刀菌中為單一拷貝，在種內(nèi)表現(xiàn)較高的保守性，TEF-1a已經(jīng)成為鐮刀菌鑒定的有效工具。目前，已經(jīng)通過該序列鑒定出禾谷鐮刀菌(F.graminearum)[22]、層出鐮刀菌[25]、串珠鐮刀菌(F.moniliforme)[22]、尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)[26]等多個鐮刀菌種。因此，利用rDNA-ITS和TEF-1α序列對鐮刀菌種的鑒定，是對形態(tài)學(xué)鑒定的驗證和補(bǔ)充，避免因種間的高度相近帶來的鑒定錯誤。

通過了致病性鑒定試驗，明確了各菌株的致病性，特別是層出鐮刀菌株表現(xiàn)了高的致病能力。在之前的研究報道中，層出鐮刀菌多認(rèn)為是弱致病菌，近幾年，層出鐮刀菌的致病性報道的越來越多，如引起番茄(Solanumlycopersicum)、豇豆 (Vignaunguiculata) 和藍(lán)莓 (SemenTrigonellae) 等植物的根部病害或葉部病害[27-29]。由此可見，不同層出鐮刀菌的株系或寄主都有可能影響其治病能力。

4 結(jié)論

根據(jù)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)共同鑒定結(jié)果，C1和C2為三線鐮刀菌的不同變異種，C3、C4和C5為腐皮鐮刀菌的不同變異種，L1為層出鐮刀菌;河北廊坊苜蓿根腐病優(yōu)勢致病菌為三線鐮刀菌;內(nèi)蒙古臨河采樣區(qū)該病害優(yōu)勢致病菌為三線鐮刀菌和腐皮鐮刀菌、山西陽高縣采樣區(qū)的優(yōu)勢致病菌為腐皮鐮刀菌和層出鐮刀菌。其中，層出鐮刀菌是首次報道可引起我國苜蓿根腐病的病原菌。