徐 鵬， 程亭亭， 張 超， 劉曙東， 孫風麗*， 奚亞軍*

(1. 西北農(nóng)林科技大學農(nóng)學院， 陜西 楊凌 712100； 2. 西北農(nóng)林科技大學旱區(qū)作物逆境生物學國家重點實驗室， 陜西 楊凌 712100)

柳枝稷(PanicumvirgatumL)是禾本科(Gramineae)黍?qū)?Panicum)的多年生C4植物，原產(chǎn)于北美大草原[1]。它具有適應(yīng)性廣、產(chǎn)量高、對環(huán)境友好等優(yōu)點，已成為最理想的能源作物之一[2-3]。但播種后柳枝稷出苗較晚，苗期生長緩慢，導致其與同時期生長的雜草在水分、營養(yǎng)、光照等競爭中處于不利地位[4-5]。如果種植當年不能建成較好的植被群體，會提高柳枝稷的生產(chǎn)成本，降低其經(jīng)濟價值[2]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)柳枝稷苗期生長緩慢可能與土壤類型、雜草競爭、種子大小等因素相關(guān)[6]。

共生是植物適應(yīng)環(huán)境的一種重要策略。叢枝菌根真菌(Arbuscularmycorrhizalfungi, AMF)可以與大多數(shù)陸生植物形成互利共生的內(nèi)生性菌根，促進植物根系養(yǎng)分的吸收和利用[7]。盆栽試驗和大田試驗都表明柳枝稷根系也能與真菌共生形成菌根，有助于促進柳枝稷對養(yǎng)分的吸收，提高柳枝稷的生物產(chǎn)量[8-10]。因此菌根共生可能是促進柳枝稷苗期生長的重要手段。

植物苗期的生長需要多方面的協(xié)作與調(diào)控，其中植物激素起著重要的調(diào)控作用。獨腳金內(nèi)酯(strigolactones, SLs)是一類來源于類胡蘿卜素的萜內(nèi)酯，近來被認定為一類新型植物激素，控制植物分枝的發(fā)育[11-12]。同時他還能促進叢枝菌根的分枝[13-14]，誘導寄生植物如獨腳金金(Strigaspp.)和列當(Orobanchespp.)種子的萌發(fā)[15]。獨腳金內(nèi)酯途徑相關(guān)基因的研究取得了一系列進展，至今為止，利用突變體及功能分析法從不同植物中克隆得到SLs合成途徑中的4個基因，包括編碼類胡蘿卜素裂解雙加氧酶7的同源基因(MAX3/RMS5/DAD3/D17)、編碼類胡蘿卜素裂解雙加氧酶8的同源基因(MAX4/RMS1/DAD1/D10)、一個編碼含鐵蛋白的基因(D27/AtD27)、一個編碼細胞色素 P450 蛋白的基因(MAX1)。外源施加人工合成的SLs類似物GR24能夠恢復這些基因的突變體表型[16]。高粱和玉米與菌根真菌共生后能減輕寄生植物獨腳金的侵染[17-18]，可能是由菌根形成后獨腳金內(nèi)酯含量的下降所導致[19]。因此獨腳金內(nèi)酯含量的變化很可能是菌根共生過程中的重要調(diào)控手段。本文研究了叢枝菌根真菌對柳枝稷苗期生長的影響，并通過測定生理指標及獨腳金內(nèi)酯的含量研究叢枝菌根真菌影響柳枝稷苗期生長的機制。

1 材料與方法

1.1 材料與基質(zhì)

供試材料為來自于柳枝稷低地型栽培品種‘Alamo’的2個品系Ma和Mg。所用的接種物為Agrauxine公司(英國)商業(yè)化的菌根真菌混合孢子，由中國科學院上海生命科學研究院植物生理生態(tài)研究所王二濤研究員饋贈。試驗于2016年在西北農(nóng)林科技大學農(nóng)學院的光照培養(yǎng)箱以及人工氣候室進行。將珍珠巖與沙子按1∶2的比例混合，用121℃高溫滅菌1 h，平均分成2份。取全新的4×8育苗缽用酒精消毒后晾干，將混合基質(zhì)裝入育苗缽中備用。瓜列當種子由西北農(nóng)林科技大學水土保持研究所馬永清研究員饋贈。

1.2 種子處理及試驗設(shè)計

將Ma和Mg種子先用10% NaClO處理2 min，再用雙蒸水清洗5次后，在滅菌的濾紙上發(fā)芽[20]。在30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10天后，選取長勢一致的幼苗移入育苗缽中，每個育苗缽加入200個左右孢子單位的接種物作為實驗組，另一份作為對照組，每種材料種植32株，每個處理設(shè)置3個重復。放入光培養(yǎng)12 h，溫度28℃，光照強 度20 000 lux；暗培養(yǎng)12 h，溫度24℃的循環(huán)培養(yǎng)箱中生長，隔天澆1次超純水。40天后調(diào)查菌根侵染及柳枝稷的生長發(fā)育狀況。

1.3 菌根墨水及WGA染色

參照水稻菌根染色的方法，取柳枝稷根系用墨水染色觀察侵染情況[21]。先用10% KOH在95℃水浴鍋中處理6 min，然后流水沖洗3遍。隨后用墨水染料(100 mL水+5 mL派克標準墨水+5 mL冰醋酸)95℃染色3 min。水沖洗4～5次后靜置2～3天，每天換水使其脫色，最后制片并在顯微鏡下觀察。

取柳枝稷根系，用WGA染色的方法觀察侵染情況[22]。根系在50%酒精中處理過夜；用水沖洗去除酒精，在20% KOH中室溫放置2～3天；用水沖洗去除KOH，在0.1 M HCL中處理1～2小時；用水沖洗去除HCL，用PBS溶液 (每800 mL加入8 g NaCl，0.2 g KCl，1.44 g Na2HPO4，0.24 g KH2PO4)再沖洗2遍；用水沖洗后，加入WGA-Alexafluor 488染液，室溫處理6 h左右，制片后在熒光顯微鏡 (激發(fā)波長488 nm)下觀察。

1.4 生理指標的測定

將幼苗整株取出，用自來水將根系仔細地沖洗干凈，然后用吸水紙將水吸干，分別測定各組的鮮重及干重、根長、株高、葉綠素含量。

根長：測定10株幼苗單株的根長，取其平均值。

鮮重、干重：取10株幼苗測定其鮮重，于105℃下殺青15 min，85℃下烘干至恒重，測定干重。

葉綠素含量：利用葉綠素測定儀(SPAD-502Plus)直接測定葉片中葉綠素含量。

1.5 根系分泌物的提取及瓜列當萌發(fā)處理

將幼苗根系清洗干凈后進行風干處理，研缽研成粉末。取100 mg粉末加入1.5 mL甲醇，超聲30 min后離心取上清作為原液，稀釋10倍備用。參照安雨[23]的方法處理瓜列當種子，分別以GR24和去離子水處理為正、負對照。

1.6 RNA提取，cDNA合成及熒光定量PCR

取處理后的柳枝稷根系液氮速凍，用Trizol法抽提RNA，然后參照天根反轉(zhuǎn)試劑盒去除gDNA以及反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。使用柳枝稷中SLs合成相關(guān)基因的定量引物(表1)在伯樂公司的CFX96型實時熒光定量儀中進行擴增。

表1 SLs合成相關(guān)基因及內(nèi)參基因定量引物序列Table 1 The primers of gene in SLs synthesis pathway and internal reference gene actin

1.7 數(shù)據(jù)分析

利用Excel 2010做圖表，利用LDS法對各指標進行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 叢枝菌根真菌侵染的檢測

叢枝菌根是內(nèi)生菌根的主要類型之一，其菌絲沒有橫膈膜，可在根的內(nèi)皮層細胞內(nèi)形成叢枝狀結(jié)構(gòu)，其中有些還能在細胞內(nèi)或皮層細胞間形成泡囊結(jié)構(gòu)。墨水染色(圖1)和WGA染色(圖2)均能明顯觀察到含有叢枝狀菌絲結(jié)構(gòu)和充滿泡囊的細胞，說明菌根真菌侵染成功。對照中則沒有觀察到菌根真菌侵染的跡象。

圖1 柳枝稷菌根侵染墨水染色(A. Ma接菌；B. Mg接菌；C. Ma對照；D. Mg對照)Fig.1 Staining of AMF in switchgrass roots with ink ( A. Ma-AMF; B. Mg-AMF; C. Ma-CK; D. Mg-CK)

圖2 柳枝稷菌根侵染W(wǎng)GA染色(A-B. Ma接菌；C-D. Ma對照；E-F. Mg接菌；G-H. Mg對照)Fig.2 Staining of AMF in switchgrass roots with WGA( A and B. Ma-AMF; C and D. Ma-CK; E and F. Mg-AMF; G and H. Mg-CK)

2.2 叢枝菌根真菌侵染對柳枝稷苗期表型的影響

由表2可知，Ma和Mg 2個品系接種菌根真菌后，除了根長沒有變化外，株高、干重、鮮重、葉綠素含量和主莖葉片數(shù)等均極顯著高于對照(P<0.01)，這說明菌根真菌與苗期柳枝稷共生后，通過促進柳枝稷根部養(yǎng)分吸收，加快柳枝稷地上葉片的生長，最終增加柳枝稷的生物量。菌根共生對柳枝稷苗期的生長具有促進作用。

表2 菌根真菌侵染對柳枝稷苗期生長指標的影響Table 2 Effects of Arbuscular Mycorrhizal Fungi on the growth of switchgrass at seedling stage

注：同列不同小寫字母表示不同處理間差異顯著(P<0．05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0．01)

Note: Different lowercase letters in the same column indicate significant differences at the 0.05 level among different treatments; different capital letters indicate significant differences at the 0.01 level

2.3 叢枝菌根真菌侵染對根系獨腳金內(nèi)酯含量的影響

寄主植物根系分泌的獨腳金內(nèi)酯能夠促進獨腳金、列當?shù)燃纳参锏拿劝l(fā)[15]，因此我們利用柳枝稷根系粉末的甲醇提取液處理寄生植物瓜列當?shù)姆N子，其發(fā)芽率作為判斷根系獨腳金內(nèi)酯含量的間接指標。作為陽性對照的GR24處理，瓜列當種子萌發(fā)率達到了37.7%，而陰性對照H2O處理，瓜列當種子萌發(fā)率只有2.8%。比較Ma和Mg 2個品系的處理發(fā)現(xiàn)，Ma和Mg未接菌處理的根系提取物處理，瓜列當?shù)拿劝l(fā)率分別達到了22.6%和57.3%，而接菌處理的根系提取物處理后其萌發(fā)率分別只有9.6%和19.8%(圖3)。由此可以初步推測，接種菌根真菌后，根系中獨腳金內(nèi)酯含量會顯著下降，從而導致瓜列當?shù)拿劝l(fā)率只有未接菌的1/3。為進一步驗證獨腳金內(nèi)酯的變化，我們選擇了Mg接菌和未接菌的根系材料提取RNA，反轉(zhuǎn)cDNA后利用實時熒光定量的方式檢測SLs合成相關(guān)標記基因的表達情況，利用柳枝稷的Actin基因作為內(nèi)參基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在Mg未接菌材料中，SLs合成相關(guān)標記基因D10和D27的表達量顯著高于接菌的Mg(圖4)。綜合以上結(jié)果，接種叢枝菌根真菌后柳枝稷根系中獨腳金內(nèi)酯含量會明顯減少。

3 討論

柳枝稷作為新型能源作物而倍受關(guān)注，但因其苗期生長緩慢，植株建植時間長，降低了柳枝稷的利用價值，加大了柳枝稷推廣的難度。共生是植物適應(yīng)環(huán)境的一種重要策略，叢枝菌根真菌能與大多數(shù)陸地上的維管植物形成專性共生體系，促進根部營養(yǎng)吸收以及植物生長發(fā)育并增強植物的環(huán)境適應(yīng)能力。因此本試驗利用來自于柳枝稷‘Alamo’的Ma和Mg 2個品系為試驗材料，接種叢枝菌根真菌的混合孢子，研究菌根共生對柳枝稷苗期生長的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌根真菌能成功侵染柳枝稷根系。接菌后的柳枝稷株高增加，葉片數(shù)增多，生物量顯著增長，說明菌根真菌與植株共生后能加快柳枝稷苗期的生長發(fā)育。因此，在種植柳枝稷時可通過施撒菌根真菌孢子的方法促進柳枝稷苗期的生長，加快其建植速度。

圖3 柳枝稷根系甲醇浸提液處理瓜列當?shù)陌l(fā)芽率Fig.3 Germination rate of Orobanche aegyptiacainduced with extracts from switchgrass roots

圖4 柳枝稷中SLs合成基因表達量檢測Fig.4 Expression of genes involved in SLs synthesis in switchgrass

菌根真菌促進柳枝稷苗期生長的過程中，獨腳金內(nèi)酯很可能發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。植物與菌根真菌的共生起始于信號交換，寄主植物根系可能通過分泌一種“分枝因子”(branching factors，BFs)來誘導叢枝真菌菌絲大量分枝，從而增加菌絲與寄主植物根系接觸的機會[24]。而真菌自身也會釋放一種可擴散的“Myc因子”(myc factor，MF)誘導寄主植物根系相關(guān)基因的表達，從而為菌根真菌的侵染提供有利條件[25]。目前BFs已被證實是SLs[13]，而MFs的成分目前仍不清楚。寄主植物根系分泌的SLs可以通過誘導一系列的分子和細胞生物學事件，促進叢枝菌絲形成大量分枝。Ma和Mg接種菌根真菌后，其葉綠素含量、生物量、株高與對照相比都有了顯著升高，說明當植物與真菌的共生關(guān)系形成后，植物的營養(yǎng)狀況會因為共生真菌的作用而得到改善。在這種情況下，我們用根系的甲醇提取液處理寄生植物瓜列當，測定其發(fā)芽率，發(fā)現(xiàn)瓜列當在菌根共生的柳枝稷的提取液處理后，發(fā)芽率顯著低于未接菌柳枝稷的處理，而SLs的重要作用就是促進寄生植物的萌發(fā)。進一步檢測Mg根系中SLs合成標記基因的表達水平，發(fā)現(xiàn)未接菌的Mg根系中D10和D27的表達量顯著高于接菌的Mg。這就說明柳枝稷在共生后會減少獨角金內(nèi)酯的合成，促進植物分枝的形成，對植物的生長有促進作用。相反，未接菌根真菌的柳枝稷由于得不到充分的無機營養(yǎng)，會加速獨腳金內(nèi)酯的分泌，從而誘導土壤中的菌根真菌孢子萌發(fā)和促進分枝，以期盡快形成促進營養(yǎng)吸收的菌根結(jié)構(gòu)。

4 結(jié)論

以來自于低地型品種Alamo的2個品系Ma和Mg的柳枝稷為材料，研究叢枝菌根真菌對柳枝稷苗期生長發(fā)育的影響，研究發(fā)現(xiàn)叢枝菌根真菌能夠成功侵入苗期柳枝稷的根內(nèi)，形成有功能的共生菌根，并且能顯著增加柳枝稷苗期的株高、葉綠素含量、葉片數(shù)和生物量。提取根系分泌物處理寄生植物瓜列當?shù)姆N子，發(fā)現(xiàn)接菌后柳枝稷的根系分泌物會顯著降低瓜列當?shù)陌l(fā)芽率，同時觀察到Mg接菌后植物體內(nèi)獨腳金內(nèi)酯合成關(guān)鍵基因D10和D27表達量顯著下調(diào)，提示柳枝稷形成菌根后會抑制根系獨腳金內(nèi)酯的合成和分泌，從而解除獨腳金內(nèi)酯對柳枝稷分蘗的抑制作用，促進柳枝稷苗期的生長。