李大偉

(海南醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 內(nèi)分泌科，海南 ?？?571200)

合并2型糖尿病乳腺癌患者腫瘤組織中FOXC2的表達(dá)情況及其臨床意義

李大偉

(海南醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 內(nèi)分泌科，海南 ?？?571200)

目的：探討FOXC2在合并2型糖尿病乳腺癌患者腫瘤組織中的表達(dá)情況，并分析其臨床意義。方法：選取2013年1月至2015年12月77例合并2型糖尿病乳腺癌患者為實(shí)驗(yàn)組，另取80例非2型糖尿病乳腺癌患者作為對(duì)照組。手術(shù)切取患者腫瘤組織，對(duì)一部分標(biāo)本提取組織RNA，利用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription PCR,RT- PCR)技術(shù)檢測(cè)兩組患者癌組織中FOXC2 mRNA表達(dá)水平；對(duì)另一部分標(biāo)本石蠟切片行ER、PR、Her- 2、FOXC2免疫組化檢測(cè)，對(duì)比免疫組化FOXC2表達(dá)結(jié)果與RT- PCR結(jié)果的一致性。比較兩組乳腺癌分子分型構(gòu)成比的差異，并做FOXC2表達(dá)與三陰乳腺癌(基底細(xì)胞樣型)的相關(guān)性分析。通過Kaplan Meier- plotter法分析FOXC2與乳腺癌患者預(yù)后的相關(guān)性。結(jié)果：RT- PCR結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組癌組織FOXC2 mRNA表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。免疫組化的結(jié)果顯示，F(xiàn)OXC2的表達(dá)水平與RT- PCR結(jié)果一致。實(shí)驗(yàn)組luminal A型占比為22.1%(17/77),luminal B型為18.2%(14/77),Her- 2過表達(dá)型為24.7%(19/77),基底細(xì)胞樣型為35.1%(27/77)；對(duì)照組luminal A型占比為37.5%(30/80),luminal B型為30.0%(24/80),Her- 2過表達(dá)型為16.3%(13/80),基底細(xì)胞樣型為16.3%(13/80)。兩組患者luminal A型、luminal B型及基底細(xì)胞樣型占比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。兩組患者FOXC2 mRNA表達(dá)水平與患者基底細(xì)胞樣型表型呈顯著正相關(guān)性(P<0.05)。Kaplan Meier- plotter結(jié)果顯示,高表達(dá)FOXC2乳腺癌患者預(yù)后差。結(jié)論：FOXC2是2型糖尿病致惡性腫瘤的潛在關(guān)鍵因子。

乳腺癌； 2型糖尿病； FOXC2； 乳腺癌分子分型； 預(yù)后

隨著人類生活方式的改變，2型糖尿病發(fā)病率出現(xiàn)逐年上升的趨勢(shì)，世界衛(wèi)生組織預(yù)計(jì)2030年全球2型糖尿病患者將達(dá)到5.52億，嚴(yán)重威脅人類健康安全[1]。近年來許多研究顯示，2型糖尿病人群中某些腫瘤發(fā)生率明顯提高，其中就包括乳腺癌，其相對(duì)危險(xiǎn)度是非糖尿病患者的1.27倍(相對(duì)危險(xiǎn)度RR=1.27)[2]，但其機(jī)制尚未完全闡明。FOXC2是人類forkhead家族的轉(zhuǎn)錄因子之一，作為控制能量代謝的關(guān)鍵基因，其可誘導(dǎo)棕色脂肪分化，提高胰島素敏感性，在對(duì)抗糖尿病的發(fā)生發(fā)展起著重要作用[3- 4]；但新近的研究[5- 8]顯示,FOXC2在多種惡性腫瘤中表達(dá)異常，且促進(jìn)胃癌和結(jié)直腸癌細(xì)胞EMT的過程，影響宮頸癌和乳腺癌組織的血管的生成。以此為依據(jù)，本研究擬探究FOXC2在合并2型糖尿病乳腺癌患者中的表達(dá)情況及其與乳腺癌惡性程度和患者預(yù)后的關(guān)系，揭示其可能的臨床意義，以期指導(dǎo)臨床工作。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集本院2013年1月至2015年12月77例合并2型糖尿病乳腺癌患者腫瘤組織標(biāo)本為實(shí)驗(yàn)組，以同期80例非2型糖尿病乳腺癌患者腫瘤組織標(biāo)本作為對(duì)照組。手術(shù)切取的腫瘤組織一部分置于凍存管中，液氮下保存，用于RT- PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)FOXC2 mRNA表達(dá)；另一部分送至病理科做石蠟切片用于免疫組化檢測(cè)。患者基本情況見表1，兩組患者年齡、男女比例及病程差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 兩組患者一般情況的比較

組 別n年齡/歲(男/女)/例病程/年實(shí)驗(yàn)組7753．8±8．31．2(42/35)2．91±0．37對(duì)照組8052．7±7．81．3(45/35)3．02±0．51t或χ2值0．9410．0461．261P值>0．05>0．05>0．05

1.2 糖尿病的診斷標(biāo)準(zhǔn)

患者術(shù)前存在既往糖尿病史(二級(jí)以上醫(yī)院明確診斷為2型糖尿病);患者既往無糖尿病史，但具有糖尿病典型癥狀，入院時(shí)空腹血糖≥7.0 mmol·L-1或餐后2 h血糖≥11.1 mmol·L-1；患者既往無糖尿病史，無糖尿病典型癥狀，連續(xù)2次以上空腹血糖≥7.0 mmol·L-1或餐后2 h血糖≥11.1 mmol·L-1。

1.3 主要試劑及抗體

主要試劑：逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Maxima?First Strand cDNA Synthesis Kit, Fermentas)、定量PCR試劑盒(iQ SYBR Green Supermix, BioRad)、RNAiso Plus(TaKaRa公司，Code No:9108)、免疫組化試劑盒[Rabbit specific HRP/DAB(ABC)Detection IHC Kit(ab64261)]?？贵w：FOXC2抗體(Abcam,ab55004)、Anti- Estrogen Receptor alpha抗體[EPR4097]- ChIP Grade(ab108398)、Anti- Progesterone Receptor抗體[Alpha PR6]- ChIP Grade(ab2765)、Anti- Ki67抗體(ab15580)、Anti- ErbB 2抗體[3B5](ab16901)。

1.4 檢測(cè)方法

1.4.1 腫瘤組織中mRNA水平的檢測(cè) 將收集的組織液氮下研磨至粉末，加入RNAiso Plus 1 ml，嚴(yán)格按照說明書上操作流程提取組織mRNA，取5 μg RNA使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，得到cDNA后利用熒光定量PCR儀檢測(cè)mRNA水平。反應(yīng)條件：預(yù)變性94 ℃ 4 min；擴(kuò)增條件94 ℃ 30 s，60 ℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)。FOXC2上游引物為5′- GATGCATTATCTTTGTCTCCTGATC- 3′,下游引物為5′- GCTGCCCAGTTCTCAGCTCACAGGC- 3′,擴(kuò)增引物大小為319 bp。以β- actin為內(nèi)參基因，其上游引物序列為5′- TGGCACCCAGCACAATGAA- 3′,下游引物序列為5′- CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA- 3′,目的片段大小為186 bp。

1.4.2 免疫組化的檢測(cè)與結(jié)果分析 將收集的組織制成4 μm石蠟切片，SP免疫組化技術(shù)法檢測(cè)組織中FOXC2、雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)及人表皮生長(zhǎng)因子受體2(HER- 2)的表達(dá)情況，操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。一抗使用質(zhì)量濃度為3 μg·ml-1，均用PBS稀釋，4 ℃孵育過夜，二抗孵育后，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木素復(fù)染，沖洗后脫水、樹膠封片再行鏡檢。

IHC染色切片采用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行觀察，每張切片選取10個(gè)高倍視野，每個(gè)視野觀察100個(gè)腫瘤細(xì)胞，計(jì)算其中平均陽性的細(xì)胞比例。ER及PR以細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)，無陽性細(xì)胞或陽性細(xì)胞<10%的為陰性(-)，≥10%的為陽性(+)。Her- 2以細(xì)胞膜呈清晰棕色為陽性細(xì)胞，無陽性細(xì)胞或陽性細(xì)胞<10%的為陰性(-)，≥10%的為陽性(+)。Ki67以細(xì)胞核為棕黃色為陽性細(xì)胞，選陽性細(xì)胞密集的區(qū)域觀察500個(gè)細(xì)胞，計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)，≥14%為陽性，<14%的為陰性。FOXC2以細(xì)胞漿或細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色為陽性細(xì)胞，無陽性細(xì)胞或陽性細(xì)胞<10%的為陰性(-)，10%至50%的為陽性(+)，>50%為強(qiáng)陽性(++)。根據(jù)2011年ST Gallen共識(shí)乳腺癌亞型的定義和治療策略，將乳腺癌分為4個(gè)亞型，即腔上皮型乳腺癌A型(luminal A型)[ER(+)或PR(+)且HER- 2(-)]、腔上皮型乳腺癌B型(luminal B型)[ER(+)或PR(+)且HER- 2(-)]、HER- 2過表達(dá)型[ER(-)，PR(-)且HER- 2(+)]及基底細(xì)胞樣(basal like)型[ER(-)，PR(-)、HER- 2(-)]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，計(jì)量資料采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。行t檢驗(yàn)比較兩組患者RT- PCR檢查結(jié)果差異是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，采用χ2檢驗(yàn)檢測(cè)兩組患者乳腺癌分子分型構(gòu)成比的差異，采取Spearman相關(guān)性分析檢測(cè)患者FOXC2 mRNA水平的表達(dá)與基底細(xì)胞樣型的關(guān)系。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組患者mRNA表達(dá)水平比較

RT- PCR結(jié)果顯示，77例實(shí)驗(yàn)組FOXC2 mRNA表達(dá)水平為0.220 5±0.064，顯著高于對(duì)照組的0.112 8±0.041(t=12.60，P<0.001)。

2.2 兩組患者免疫組化結(jié)果比較

實(shí)驗(yàn)組FOXC2強(qiáng)陽性為28.6%,高于對(duì)照組的18.75%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；實(shí)驗(yàn)組FOXC2陽性為42.8%,高于對(duì)照組的38.75%，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；實(shí)驗(yàn)組FOXC2陰性患者為26.0%，低于對(duì)照組的42.5%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 兩組患者腫瘤組織FOXC2免疫組化陽性率的比較 例

乳腺癌分子分型情況中，實(shí)驗(yàn)組luminal A型為22.1%,低于對(duì)照組的37.5%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；實(shí)驗(yàn)組luminal B型為18.2%，低于對(duì)照組的30.0%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；實(shí)驗(yàn)組Her- 2過表達(dá)型為24.7%，高于對(duì)照組的16.3%，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；實(shí)驗(yàn)組基底細(xì)胞樣型為35.1%，高于對(duì)照組的16.3%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

2.3 兩組患者FOXC2表達(dá)水平與基底細(xì)胞樣型的相關(guān)性分析

Spearman相關(guān)性分析結(jié)果示,實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組患者FOXC2的mRNA表達(dá)水平與患者基底細(xì)胞樣型呈正相關(guān)(r=0.672,P<0.05)。

2.4 Kaplan Meier- plotter分析乳腺癌患者FOXC2的表達(dá)與患者預(yù)后的相關(guān)性

根據(jù)Kaplan Meier- plotter乳腺癌數(shù)據(jù)庫中的FOXC2表達(dá)水平及患者隨訪資料，837例患者FOXC2的表達(dá)水平分為高表達(dá)與低表達(dá)組。繪制生存分析曲線發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXC2高表達(dá)組較低表達(dá)組預(yù)后差，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。

表3 兩組患者腫瘤組織乳腺癌分子分型的比較 例

圖1 乳腺癌患者腫瘤組織FOXC2的表達(dá)的生存曲線

3 討 論

2型糖尿病的發(fā)生與多種腫瘤的發(fā)生存在密切關(guān)系[9]，其機(jī)制尚未完全闡明，可能的機(jī)制包括：(1)2型糖尿病發(fā)生的胰島素抵抗直接或間接地導(dǎo)致高胰島素血癥，進(jìn)而增加血中胰島素樣因子-1(insulin- like growth factor- 1，IGF- 1)的水平，其能促進(jìn)細(xì)胞的增殖和分化，并抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡[10]；(2)持續(xù)高血糖狀態(tài)為生長(zhǎng)迅速的腫瘤細(xì)胞提供了充足的能量來源，且長(zhǎng)期高血糖可導(dǎo)致細(xì)胞線粒體呼吸酶受損，細(xì)胞呼吸功能障礙，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS累積增加，可能對(duì)DNA造成損傷[11- 13]；(3)長(zhǎng)期高血糖狀態(tài)可能導(dǎo)致免疫功能障礙，免疫監(jiān)視功能受損，對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展起到積極作用[14- 15]。FOXC2是調(diào)節(jié)代謝的關(guān)鍵基因，該基因的低表達(dá)可導(dǎo)致體質(zhì)量指數(shù)、三酰甘油水平升高，胰島素敏感性及基礎(chǔ)代謝率降低，導(dǎo)致代謝綜合征的發(fā)生[16- 17]。Yang等[18]的研究表明，胰島素抵抗的患者脂肪組織及骨骼肌FOXC2表達(dá)水平顯著降低，棕色脂肪組織數(shù)量減少；Riddestrale等[19]發(fā)現(xiàn)，內(nèi)臟脂肪細(xì)胞的FOXC2 mRNA表達(dá)水平與胰島素抵抗指數(shù)呈負(fù)相關(guān)，證實(shí)了FOXC2在代謝方面的重要作用。近年關(guān)于FOXC2與腫瘤的相關(guān)研究逐漸增多，其在多種惡性腫瘤高表達(dá)，如TGF、WNT、Snai1/FOXC2經(jīng)典腫瘤信號(hào)通路，且FOXC2本身也能促進(jìn)多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。Mortazavi等[20]研究發(fā)現(xiàn)，在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系中FOXC2的表達(dá)與其EMT過程呈正相關(guān)，F(xiàn)OXC2可下調(diào)E- cadherin的表達(dá)而降低細(xì)胞間黏附作用，增強(qiáng)細(xì)胞的轉(zhuǎn)移傾向；Paranjape等[21]的研究顯示,前列腺癌細(xì)胞中FOXC2促進(jìn)其細(xì)胞干性的維持；Nishida等[22]的研究指出,食管癌患者癌組織中FOXC2的表達(dá)與基質(zhì)金屬蛋白酶- 2(MMP2)及基質(zhì)金屬蛋白酶- 9(MMP9)的表達(dá)呈正相關(guān)，提示FOXC2可能對(duì)食管癌侵襲轉(zhuǎn)移起促進(jìn)作用。

本研究合并2型糖尿病乳腺癌患者腫瘤組織中FOXC2的mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯高于非糖尿病乳腺癌患者，推測(cè)可能的原因是實(shí)驗(yàn)組患者受到致病因素的影響，正常組織如脂肪組織、骨骼肌中FOXC2的表達(dá)量下降，使機(jī)體發(fā)生胰島素抵抗，代償性地導(dǎo)致腫瘤組織FOXC2的表達(dá)增加，導(dǎo)致兩組患者腫瘤組織FOXC2的表達(dá)出現(xiàn)差異。腫瘤組織FOXC2的表達(dá)量增加，不僅促進(jìn)了機(jī)體整體的糖代謝，也加快了腫瘤組織的代謝進(jìn)程，且FOXC2與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移、腫瘤干性的維持密切相關(guān)，加深細(xì)胞惡性程度，使得患者預(yù)后不良。本研究結(jié)果也證實(shí)了上述推測(cè)，實(shí)驗(yàn)組患者乳腺癌分子分型更傾向于惡性程度高的基底細(xì)胞樣型，且腫瘤組織FOXC2表達(dá)高的患者預(yù)后不良。

關(guān)于2型糖尿病導(dǎo)致惡性腫瘤的機(jī)制尚不完全明確，本研究為揭示其確切機(jī)制提供了線索，F(xiàn)OXC2可能在其中發(fā)揮重要的中間作用。今后研究須進(jìn)一步明確FOXC2在乳腺癌中扮演何種角色，探究其與其他分子間的相互作用，確定其可能的靶標(biāo)分子，為乳腺癌臨床診斷及治療提供新的依據(jù)。

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2016- 10- 21

2017- 05- 15

李大偉(1980-)，男，海南?？谌?，主治醫(yī)師，在讀碩士研究生。E- mail:dawei0898@163.com

李大偉.合并2型糖尿病乳腺癌患者腫瘤組織中FOXC2的表達(dá)情況及其臨床意義[J].東南大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2017，36(4)：619- 623.

R737.9; R587.1

A

1671- 6264(2017)04- 0619- 05

10.3969/j.issn.1671- 6264.2017.04.025