郭樹春，張艷芳，孫瑞芬，李素萍，于海峰，劉臘青，王洪波，安玉麟

(1.內(nèi)蒙古大學(xué) 物理科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031；3.和林格爾縣黑老夭鄉(xiāng)農(nóng)技推廣綜合服務(wù)站，內(nèi)蒙古 呼和浩特 011500；4.鄂爾多斯生態(tài)環(huán)境職業(yè)學(xué)院，內(nèi)蒙古 鄂爾多斯 017010)

向日葵核心種質(zhì)資源基礎(chǔ)類群劃分研究

郭樹春1,2，張艷芳2，孫瑞芬2，李素萍2，于海峰2，劉臘青3，王洪波4，安玉麟2

(1.內(nèi)蒙古大學(xué) 物理科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031；3.和林格爾縣黑老夭鄉(xiāng)農(nóng)技推廣綜合服務(wù)站，內(nèi)蒙古 呼和浩特 011500；4.鄂爾多斯生態(tài)環(huán)境職業(yè)學(xué)院，內(nèi)蒙古 鄂爾多斯 017010)

向日葵是一種重要的油料作物，同時(shí)也是一種潛在的能源植物，其核心種質(zhì)資源基礎(chǔ)類群的劃分可為向日葵遠(yuǎn)緣雜交提供理論依據(jù)。采用形態(tài)學(xué)標(biāo)記與RAPD標(biāo)記相結(jié)合的方法，利用UPGMA聚類法對50份向日葵核心種質(zhì)資源材料親緣關(guān)系進(jìn)行了深入研究。形態(tài)學(xué)標(biāo)記法結(jié)果顯示，50份供試種質(zhì)資源可分為三大類群，其中第Ⅰ類群27份種質(zhì)，第Ⅱ類群22份種質(zhì)，第Ⅲ類群只包含1份種質(zhì)，進(jìn)一步研究表明，供試種質(zhì)資源的種質(zhì)地理分布以及用途與聚類結(jié)果關(guān)聯(lián)性較強(qiáng)。同時(shí)，分子標(biāo)記的UPGMA聚類結(jié)果也驗(yàn)證了上述結(jié)論；RAPD分子標(biāo)記聚類法也將供試材料分為三大類群，其中第Ⅰ類群26份種質(zhì)，第Ⅱ類群23份種質(zhì)，第Ⅲ類群包含1份種質(zhì)，形態(tài)學(xué)與RAPD聚類結(jié)果的吻合率為96.30%；形態(tài)學(xué)標(biāo)記結(jié)果與RAPD標(biāo)記分類結(jié)果可靠。

向日葵；形態(tài)學(xué)；RAPD；類群劃分

向日葵(HelianthusannuusL.)是一種集觀賞、藥用、油用于一身的優(yōu)良資源植物[1-2]，其具有耐鹽堿、耐干旱、耐瘠薄、適應(yīng)性強(qiáng)的特點(diǎn)，特別適合在我國西部干旱少雨地區(qū)栽培種植[3]。20世紀(jì)70年代法國人用向日葵雄性不育系三系配套技術(shù)育成雜交種[4-5]，我國20世紀(jì)80年代開始從國外引進(jìn)向日葵雜交種。目前，遠(yuǎn)緣雜交在向日葵育種中占據(jù)重要地位，種質(zhì)資源基礎(chǔ)類群劃分是實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)緣雜交的基礎(chǔ)，因而很多學(xué)者開始運(yùn)用分子標(biāo)記技術(shù)對向日葵種植資源類群劃分進(jìn)行了深入研究[6-7]，從而揭示向日葵種質(zhì)資源間的親緣關(guān)系，尋找產(chǎn)量、抗性、品質(zhì)與基因的對應(yīng)關(guān)系，提高向日葵育種的準(zhǔn)確性，并為育種材料的深入研究提供依據(jù)。

自從20世紀(jì)80年代向日葵雜交種在得到大面積推廣、應(yīng)用以來，我國乃至其他國家收集了豐富的向日葵種質(zhì)資源，并提出了核心種質(zhì)(Core collection)理念，其有效促進(jìn)了種質(zhì)資源利用與發(fā)掘重要基因的效率。目前，可利用已建立向日葵的核心種質(zhì)為多元化向日葵育種打下良好基礎(chǔ)，對選育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗逆向日葵新品種具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。向日葵種質(zhì)資源蘊(yùn)藏產(chǎn)量基因、品質(zhì)基因及抗性基因是現(xiàn)代多元化向日葵育種的物質(zhì)基礎(chǔ)，為了促進(jìn)有利基因發(fā)掘及其在生產(chǎn)上有效利用，對其種質(zhì)資源進(jìn)行系統(tǒng)評價(jià)顯得十分重要，也是向日葵研究的先決條件，可減少親本選配的盲目性進(jìn)而提高育種工作的預(yù)見性和準(zhǔn)確性。運(yùn)用傳統(tǒng)手段與生物技術(shù)結(jié)合的方法辨識資源親緣關(guān)系在常規(guī)育種中尤為常見，特別是形態(tài)學(xué)標(biāo)記與分子標(biāo)記技術(shù)結(jié)合的方法對向日葵核心種質(zhì)資源類群劃分已成為向日葵育種的應(yīng)用典范，本研究采用了形態(tài)學(xué)標(biāo)記與RAPD相結(jié)合的方法，運(yùn)用聚類分析對50份向日葵種質(zhì)材料的基礎(chǔ)類群進(jìn)行了劃分研究，將50份核心向日葵種質(zhì)資源材料分為4個(gè)基礎(chǔ)類群，并對其與地理分布的關(guān)系做了進(jìn)一步分析，該研究結(jié)果可直接指導(dǎo)向日葵育種，并為優(yōu)良基因的挖掘提供有價(jià)值的信息。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)在內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院完成，參試種質(zhì)是內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院從國內(nèi)外收集的50份向日葵核心資源材料，包含：25份恢復(fù)系、10份不育系、15份自交系(表1)。

表1 50份參試向日葵材料Tab.1 50 sunflower germplasms in the study

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 形態(tài)學(xué)標(biāo)記分析 將50份材料3次重復(fù)種植，每份材料重復(fù)種60株，并保持各重復(fù)的培養(yǎng)條件(光照、溫度、濕度等)相同，并分階段對其不同性狀進(jìn)行調(diào)查統(tǒng)計(jì)，調(diào)查性狀包括：出苗期、現(xiàn)蕾期、莖粗、株高、花盤的直徑、形狀、傾斜度，葉片的數(shù)量、大小、粒型、粒色、產(chǎn)量等。

1.2.2 RAPD分子標(biāo)記分析 挑選飽滿度、大小一致的各參試向日葵種子播種在營養(yǎng)缽中，播種深度2～3 cm，每缽播種10～12粒，設(shè)3個(gè)重復(fù)，每缽澆水50～100 mL，在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天定時(shí)澆水1～2次，保持營養(yǎng)缽表面土壤濕潤為宜，出苗后保留每缽5～6株整齊一致的向日葵幼苗待用。

從每份制備好的材料中選擇3～5個(gè)生長良好的向日葵幼苗，取幼嫩葉片提取DNA(提取方法參考Plant Genomic DNA Kit產(chǎn)品說明)。各樣品DNA用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后保存在-70 ℃超低溫冰箱。RAPD反應(yīng)體系優(yōu)化結(jié)果：體系大小20 μL；2×Taq MasterMix 10 μL；引物(10 μmol/L)2 μL；植物總DNA(20 ng/μL)100 ng；ddH2O 3 μL[8-9]；PCR擴(kuò)增程序(RAPD)：95 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性40 s，38 ℃退火90 s，72 ℃延伸70 s，40個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min[10-11]。

本試驗(yàn)選用的RAPD引物共100條，經(jīng)篩選得到19條特異性好的引物作為向日葵RAPD標(biāo)記特異引物，序列信息見表2。

表2 篩選出的RAPD引物序列及擴(kuò)增結(jié)果 Tab.2 The RAPD sequences and results of selected primers

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

根據(jù)形態(tài)學(xué)性狀調(diào)查的數(shù)據(jù)，采用SPSS軟件，利用歐氏距離法對50份核心資源材料進(jìn)行UPGMA聚類分析[12]。根據(jù)RAPD擴(kuò)增結(jié)果，同一引物的擴(kuò)增產(chǎn)物中電泳遷移率一致的條帶被認(rèn)為具有同源性，本試驗(yàn)分別以DL1200和DL500為標(biāo)準(zhǔn)分子量標(biāo)記，對照反應(yīng)物在瓊脂糖凝膠上的位置，按照相同遷移率位置上有擴(kuò)增帶記為1無帶記為0的方法記錄電泳譜帶，并建立0、1矩陣，該過程由Quantity one軟件完成[13]，本試驗(yàn)中3次重復(fù)都出現(xiàn)的條帶記為1，否則記為0。

條帶多態(tài)性計(jì)算方法：

相異性系數(shù)與聚類分析方法：相異系數(shù)與聚類分析均采用SPSS分析軟件進(jìn)行分析，以RAPD條帶為基礎(chǔ)建立的0，1矩陣計(jì)算Jaccard相異系數(shù)[14]，公式如下：Jij=a/(n-d)，a為i品種和j品種的多態(tài)性條帶數(shù)之和，n為RAPD總帶數(shù)，d為i和j品種都記為0的帶數(shù)。然后用非加權(quán)配對算術(shù)平均聚類方法(UPGMA)對其進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學(xué)標(biāo)記分析結(jié)果

為研究參試向日葵種質(zhì)資源在形態(tài)學(xué)上的親緣關(guān)系，采用SPSS軟件，利用12個(gè)性狀的田間調(diào)查結(jié)果計(jì)算50份種質(zhì)間的遺傳距離。經(jīng)計(jì)算50份種質(zhì)的遺傳距離為8.00～360.11，均值為123.13，可見參試種質(zhì)在形態(tài)學(xué)性狀上具有較廣泛的變異，形態(tài)多樣性較豐富。在種質(zhì)間的遺傳距離中，以種質(zhì)17(T785)與24(T837)間的最大，為306.11；遺傳距離最小的是種質(zhì)3(T364)與2(T361)，為8.25。根據(jù)12個(gè)形態(tài)學(xué)性狀計(jì)算種質(zhì)間的遺傳距離，對50份種質(zhì)進(jìn)行聚類分析，將供試種質(zhì)分為三大類群(圖1)。

圖1 基于形態(tài)學(xué)性狀的向日葵種質(zhì)聚類圖Fig.1 The dendrogram of sunflower germplasms on morphological characteristics

第Ⅰ類群(共27份材料、2個(gè)亞類)：

第一亞類(13份材料)包括種質(zhì)1：T649；13：T702；16：T752；22：T824；12：T717；18：T764；7：T676；8：T682；48：T1295；14：T736；15：T740；17：T758；24：T837。

第二亞類(14份材料)包括種質(zhì)2：T361；3：T364；6：T663；19：T794；25：T933；23：T827；4：T366；5：T660；20：T796；21：T810；9：T700；10：T707；11：T710；47：T1269。

第Ⅱ類群(共22份材料)：

第一亞類(11份材料)包含種質(zhì)27：T22；29：T38；36：T590；35：T232；41：T2；39：T594；44：T11；33：T192；43：T8；38：T593；46：T18。

第二亞類(11份材料)包含種質(zhì)28：T37；31：T42；30：T41；37：T592；49：T1484；32：T191；34：T231；42：T3；45：T16；50：赤葵2號；40：T595。

第Ⅲ類群只有種質(zhì)26：T21。

結(jié)果表明，形態(tài)學(xué)聚類與參試種質(zhì)的地理來源關(guān)系密切，第Ⅰ類群(27份種質(zhì)資源材料)主要是來自國外的一些材料，其中第一類亞類(13份材料)包含：以色列的8份(12、13、14、15、16、17、18、24)，美國的3份(1、7、8)；第二亞類(14份材料)包括：以色列4份(9、10、11、23)，美國的6份材料(2、3、4、5、6、25)，其余6份為國內(nèi)材料。第Ⅱ類群(22份材料)均為國內(nèi)的材料。第Ⅲ類群(1份材料)：26為國內(nèi)材料，詳細(xì)信息見表3。

表3 形態(tài)學(xué)聚類向日葵種質(zhì)地理來源分析Tab.3 Analysis of sunflower origin on morphological characteristics

2.2 RAPD分子標(biāo)記分析結(jié)果

利用篩選出的19條引物對50份向日葵基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，19條引物共擴(kuò)增出150條DNA條帶，每個(gè)引物擴(kuò)增的條帶數(shù)在4～11條，平均每個(gè)引物產(chǎn)生7.42條，擴(kuò)增出的DNA條帶的大小在300～1 200 bp。進(jìn)一步分析表明，在擴(kuò)增的150條帶中，多態(tài)性條帶數(shù)為123條，占總條帶的82.00%，表明試用材料的遺傳多樣性豐富，可作為雜交育種的核心資源庫(圖2)。

編號見種質(zhì)名稱表1；M.100 bp Ladder。See number of germplasm in Tab.1;M.100 bp Ladder.

為研究參試向日葵種質(zhì)資源在分子水平的遺傳關(guān)系，采用SPSS軟件，利用19條RAPD引物計(jì)算了50份種質(zhì)間的遺傳距離。這些種質(zhì)資源的遺傳距離為0.812～0.241，均值為0.563，可見參試種質(zhì)在分子水平上遺傳差異較大，從而驗(yàn)證了各材料多態(tài)性研究結(jié)果。在種質(zhì)間的遺傳距離中，種質(zhì)16(T752)與24(T837)間的遺傳距離最大，為0.812；種質(zhì)6(T663)和種質(zhì)5(T660)遺傳距離最小，為0.241。根據(jù)19條RAPD引物計(jì)算得到的種質(zhì)間遺傳距離，對50份種質(zhì)進(jìn)行聚類分析，供試種質(zhì)可分為三大類群(圖3)。

圖3 RAPD標(biāo)記遺傳聚類圖Fig.3 The dendrogram of sunflower germplasms on RAPD markers

RAPD聚類結(jié)果顯示，第Ⅰ類包括26份種質(zhì)資源材料：

第一亞類(3份材料)包含種質(zhì)1：T649；22：T824；48：T1295。

第二亞類(23份材料)包含種質(zhì)2：T361；3：T364；12：T717；13：T720；15：T740；16：T752；14：T736；9：T700；10：T707；47：T1269；6：T663；7：T676；18：T764；21：T810；8：T682；24：T837；19：T794；20：T796；25：T933；17：T758；23：T827；4：T366；5：T660。

第Ⅱ類(包括23份材料)：

第一亞類(19份材料)包含種質(zhì)26：T21；28：T37；29：T38；30：T41；31：T42；32：T191；40：T595；37：T592；41：T2；50：赤葵2號；42：T3；45：T16；34：T231；35：T232；39：T594；27：T22；46：T18；33：T192；43：T8。

第二亞類(4份材料)包含種質(zhì)36：T590；38：T593；44：T11；49：T1484。

第Ⅲ類(包括1份材料)包含種質(zhì)11：T710。

RAPD聚類與參試種質(zhì)的地理來源也密切相關(guān)，第I類群(共26份)主要是來自國外的一些材料，其中包含：美國的9份種質(zhì)(1、2、3、4、5、6、7、8、25)，以色列的11份種質(zhì)(9、10、12、13、14、15、16、17、18、23、24)，其余6份為國內(nèi)種質(zhì)；第Ⅱ類群(共23份)均為我們收集的國內(nèi)的種質(zhì)資源材料，第Ⅲ類群是以色列種質(zhì)T710(表4)。

表4 RAPD聚類向日葵種質(zhì)地理分布分析Tab.4 Analysis of sunflower origin on RAPD

2.3 形態(tài)標(biāo)記結(jié)果與RAPD標(biāo)記結(jié)果的比較分析

從聚類分析來看，形態(tài)學(xué)性狀與RAPD標(biāo)記的遺傳關(guān)系基本一致。2種方法根據(jù)遺傳距離分別把50份向日葵種質(zhì)資源劃分為三類，在第Ⅰ類群中只有11號種質(zhì)是不同的，第Ⅱ類群全部相同。為進(jìn)一步研究形態(tài)標(biāo)記和RAPD標(biāo)記之間的關(guān)系，綜合考慮聚類圖特點(diǎn)和適宜的分組數(shù)，本研究把2種方法的聚類結(jié)果劃分為4組，將2種聚類結(jié)果進(jìn)行比較時(shí)，首先選擇吻合率最大的2個(gè)組進(jìn)行比較，然后在剩余的組中再選擇吻合率最大的比較，依此類推，從表5中可以看出，形態(tài)標(biāo)記與RAPD標(biāo)記吻合率達(dá)到90%以上，而且材料較多的前2組之間的吻合率達(dá)96.30%和95.65%，并且前兩類的聚類結(jié)果和地理分布有密切的關(guān)系。

表5 形態(tài)標(biāo)記和RAPD標(biāo)記聚類結(jié)果比較Tab.5 The comparation between morphological characteristics and RAPD

3 討論與結(jié)論

本研究采用了形態(tài)學(xué)標(biāo)記與RAPD分子標(biāo)記相結(jié)合的方法，運(yùn)用聚類分析工具UPGMA對50份向日葵種質(zhì)材料的基礎(chǔ)類群進(jìn)行了劃分。采用形態(tài)標(biāo)記方法對參試種質(zhì)的12個(gè)形態(tài)學(xué)性狀進(jìn)行聚類，結(jié)果表明：50份種質(zhì)的遺傳距離為8.00～360.11，其可分為三大類群：第Ⅰ類群27份種質(zhì)，第Ⅱ類群22份種質(zhì)，第Ⅲ類群只包含1份種質(zhì)，聚類結(jié)果與種質(zhì)的地理分布有密切聯(lián)系。利用RAPD技術(shù)，得到19條多態(tài)性高、重復(fù)性好的引物共擴(kuò)增出150條特異帶，其中有123條多態(tài)性條帶，占82.00%，種質(zhì)間遺傳距離在0.812～0.241。UPGMA聚類結(jié)果顯示，供試種質(zhì)可分為三大類群：第I類群共有26份種質(zhì)，第Ⅱ類群23份種質(zhì)，第Ⅲ類群1份種質(zhì)，且聚類結(jié)果也與地理分布有相關(guān)性。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)形態(tài)學(xué)與RAPD吻合率高達(dá)96.30%，形態(tài)學(xué)標(biāo)記與RAPD標(biāo)記的聚類結(jié)果基本一致。

從上述結(jié)果可知，形態(tài)學(xué)方法雖然是一種最古老的類群劃分方法，它簡單、直觀、容易獲得，具有不可替代的作用，但是它的均一性和穩(wěn)定性容易受到環(huán)境條件和發(fā)育時(shí)期的影響[15-16]。本研究利用形態(tài)學(xué)標(biāo)記方法對50份核心向日葵資源材料進(jìn)行基礎(chǔ)類群劃分，經(jīng)計(jì)算50份種質(zhì)的遺傳距離在8.00～360.11，50份種質(zhì)可分為三大類群。RAPD標(biāo)記穩(wěn)定性好，不受環(huán)境影響，缺點(diǎn)是難以區(qū)分雜合和純合基因型，而且容易受到反應(yīng)條件的影響，重復(fù)性較差，但可以通過固化反應(yīng)條件得到解決，已經(jīng)成為植物種質(zhì)資源研究的重要手段[17]。RAPD分子標(biāo)記方法在本研究中對供試材料的類群劃分結(jié)果顯示，篩選出的19條引物共擴(kuò)增出150條DNA帶，每個(gè)引物擴(kuò)增的條帶數(shù)在4～11條，平均每個(gè)引物產(chǎn)生7.42條，擴(kuò)增出的DNA條帶大小在300～1 200 bp。分析表明，在擴(kuò)增的150條帶中，多態(tài)性條帶數(shù)為123條，占總條帶的82.0%，UPGMA方法聚類結(jié)果顯示50份向日葵核心資源可分為三大類群[18-20]，將2種方法的結(jié)果綜合分析可以有效降低因其自身缺陷造成的誤差，將分析供試材料分為4個(gè)基礎(chǔ)類群。

綜上所述，通過對向日葵核心種質(zhì)資源的類群劃分研究，可以為選育優(yōu)良品種以及對各資源特定性狀改良打下基礎(chǔ)。我國向日葵品種資源比較豐富，利用傳統(tǒng)標(biāo)記方法和分子標(biāo)記方法對向日葵核心資源庫遺傳多樣性進(jìn)行分析，并且得到一批穩(wěn)定性好且具有豐富多態(tài)性的RAPD標(biāo)記，通過對2種方法的比較發(fā)現(xiàn)，向日葵種質(zhì)資源的親緣關(guān)系和地理分布具有緊密聯(lián)系，因而地理分布可作為雜交育種親本選擇的一個(gè)依據(jù)，并且2種方法的結(jié)果一致性較好，形態(tài)學(xué)標(biāo)記和RAPD標(biāo)記可以作為研究類似問題的核心方法。

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Analysis of Classification and Genetic Relationship among Core Sunflower Germplasm Resources

GUO Shuchun1,2，ZHANG Yanfang2，SUN Ruifen2，LI Suping2，YU Haifeng2，LIU Laqing3，WANG Hongbo4，AN Yulin2

(1.School of Physical Science and Technology，Inner Mongolia University，Huhhot 010010，China；2.Inner Mongolia Academy of Agricultural and Animal Husbandry Sciences，Huhhot 010031，China；3.Helingeer Heilaoyao Township Agricultural Extension Service Station，Huhhot 011500，China；4.Ordos Vocational College of Eco-environment，Ordos 017010，China)

Sunflower is one of most important oil crops,and is also a kind of potential ornamental plants. Analysis of classification among the core sunflower germplasm resources is helpful for utilizing hetero.Morphological characteristics and RAPD markers were employed in detecting the genetic diversity among 50 sunflower germplasm resources with UPGMA method. The genetic diversity among the resources was revealed by cluster analysis on morphological characteristics. Clustering analysis indicated that the germplasms could be divided into three groups：27 germplasms were classified into group Ⅰ；group Ⅱ had 22 germplasms and group Ⅲ had 1 germplasm.Clustering analysis on morphological characteristics was associated with geological distribution.Furthermore，the results of RAPD cluster indicated that the germplasms could be divided into three groups，which were confirmed by the result of morphological characteristics cluster.The germplasms could be divided into three groups：26 germplasms were classified into group Ⅰ;group Ⅱ had 23 germplasms；group Ⅲ had 1 germplasm. Coincidence rate between morphological characteristics and RAPD was 96.30%. The results of the morphology and RAPD were identical.

Sunflower；Morphological characteristics；RAPD；Classification

2017-06-01

國家向日葵產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目(CARS-16)；內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院創(chuàng)新基金項(xiàng)目(2013CXJJN06)

郭樹春(1981-)，男，內(nèi)蒙古烏蘭察布人，助理研究員，博士，主要從事生物信息學(xué)研究。

安玉麟(1954-)，男，內(nèi)蒙古包頭人，研究員，主要從事作物遺傳育種研究。

S595.5

A

1000-7091(2017)04-0107-07

10.7668/hbnxb.2017.04.018