劉文俊，王娟萍，姚敬明，吳 忻，孟 帆，韓一超，樊振華，薛翼鵬，米瑞娟，李紅麗，趙 岳

(山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，山西 太原 030032)

豬流行性腹瀉病毒山西分離株ORF3基因序列分析

劉文俊，王娟萍，姚敬明，吳 忻，孟 帆，韓一超，樊振華，薛翼鵬，米瑞娟，李紅麗，趙 岳

(山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，山西 太原 030032)

為了研究山西地區(qū)豬流行性腹瀉病毒ORF3基因的遺傳變異情況，2014-2015年從山西地區(qū)11個(gè)地市收集的PEDV陽(yáng)性病料中擴(kuò)增到4株P(guān)EDV 的ORF3基因，并進(jìn)行序列比對(duì)及遺傳分析。序列分析結(jié)果表明，4株P(guān)EDV 山西分離毒株的ORF3基因與CV777毒株相比，無核苷酸插入和缺失，有部分核苷酸及氨基酸發(fā)生變異；4株P(guān)EDV 山西分離毒株的ORF3基因之間核苷酸和氨基酸的同源性分別為99.6%～100.0%和98.7%～99.6%，與CV777、疫苗株CV777 truncated和attenuated DR13核苷酸同源性分別為96.6%～97.0%，90.6%，97.6%～98.1%，氨基酸同源性分別為95.1%～96.0%，88.0%，97.1%～98.1%。遺傳進(jìn)化分析結(jié)果顯示，4株P(guān)EDV 山西分離毒株與12株2010-2015年我國(guó)各地方分離的毒株和2009年分離的CH/JL/09毒株親緣關(guān)系較近；與CV777、LZC、Brl/87和2個(gè)疫苗株(CV777truncated和attenuated DR13)親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

豬流行性腹瀉；山西分離株；ORF3基因；序列分析

豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhea，PED)是由豬流行性腹瀉病毒(Porcineepidemicdiarrheavirus，PEDV)引起的一種急性、高度傳染性腸道傳染病，臨床上以嘔吐、水樣腹瀉和脫水死亡為特征[1-2]。1978年比利時(shí)和英國(guó)首次報(bào)道該病[3-4]，宣化等[5]在1984年研究證實(shí)，該病在我國(guó)存在。豬流行性腹瀉病毒是冠狀病毒科、冠狀病毒屬的成員，為有囊膜單股正鏈RNA病毒，基因組全長(zhǎng)約28 kb，包括5′端非編碼區(qū)、3′端非編碼區(qū)以及至少7個(gè)開放閱讀框(ORF1a、ORF1b、ORF2～ORF6)[6-7]。ORF3基因與病毒毒力有關(guān)[8-10]，當(dāng)ORF3表達(dá)被抑制時(shí)，PEDV對(duì)細(xì)胞侵襲能力下降[11]。PEDV弱毒疫苗株的ORF3基因有49～51個(gè)核苷酸的缺失。因此，可以根據(jù)ORF3基因的差別來區(qū)別鑒定野毒毒株和疫苗毒株[12-15]。

本研究通過RT-PCR方法對(duì)2014-2015年采集自山西省11個(gè)地市的PEDV陽(yáng)性病料的ORF3基因進(jìn)行測(cè)序和進(jìn)化分析，旨在了解山西地區(qū)PEDVORF3基因的遺傳變異情況，為山西地區(qū)的PED防控提供理論依據(jù)和參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 病料 于2014-2015年從山西省太原、晉中、呂梁等11個(gè)地市規(guī)?；i場(chǎng)采集疑似豬流行性腹瀉病料。

1.1.2 病料的處理 將采集的小腸及腸內(nèi)容剪碎后研磨，加入PBS緩沖液勻漿后，4 ℃ 12 000 r/min離心5 min，收集上清液，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3 主要試劑 RNAiso Plus、PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit、Premix TaqTM、DNA Marker DL2000、pMD18-T Vector購(gòu)自寶生物(大連)工程有限公司；DNA膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自上海生工生物工程有限公司；E.coliDH5α菌株購(gòu)自天根生物科技(北京)有限公司；乙醇、異丙醇、氯仿等試劑均為分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank中收錄的PEDV CV777ORF3基因保守區(qū)設(shè)計(jì)了擴(kuò)增ORF3基因全序列的引物，擴(kuò)增產(chǎn)物片段預(yù)期長(zhǎng)度為675 bp。引物序列如下：ORF3-F：5′-ATGTTTCTTGGACTTTTTCAATACA-3′，ORF3-R：5′-TCATTCACTAATTGTAGCATACTCGTC-3′。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2.2 病毒總RNA的提取 按RNAiso Plus試劑盒說明書操作，從陽(yáng)性病料中提取病毒基因組RNA，用適量的DEPC水溶解，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3ORF3基因的擴(kuò)增、克隆和測(cè)序 以提取的RNA為模板制備cDNA，參照PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit說明書進(jìn)行操作。在PCR管中依次加入RNase free H2O 7 μL，RNA 1 μL，dNTP 1 μL，下游引物1 μL；混勻后，65 ℃保溫5 min后，冰上迅速冷卻；在上述的PCR管加入5×PrimeScript Ⅱ Buffer 4 μL，RNase Inhibitor 0.5 μL，PrimeScript Ⅱ RTase 1 μL，RNase free dH2O 4.5 μL，緩慢混勻，42 ℃ 60 min，95 ℃保溫5 min，冰上冷卻。PCR反應(yīng)體系：Premix Taq 25 μL，上下游引物各1 μL，cDNA模板2 μL，滅菌蒸餾水21 μL，混勻后進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增反應(yīng)條件：94 ℃ 預(yù)變性3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃45 s，72 ℃ 60 s，35個(gè)循環(huán)；再72 ℃延伸10 min。取10 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，觀察結(jié)果。將PCR產(chǎn)物純化后與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)鑒定后將陽(yáng)性菌液送上海生工生物有限公司進(jìn)行測(cè)序。1.2.4 序列分析 對(duì)所獲得的4株P(guān)EDV 的ORF3基因序列用DNAStar軟件與GenBank中收錄的12株國(guó)內(nèi)外PEDV的ORF3基因進(jìn)行同源性分析，并構(gòu)建進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 PEDVORF3基因的擴(kuò)增結(jié)果

從陽(yáng)性病料中提取 RNA，用引物ORF3-F和ORF3-R進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，分別獲得與預(yù)期片段大小相符的特異片段，大小約為675 bp，結(jié)果如圖1所示。

2.2ORF3基因序列變化

4株P(guān)EDV山西分離株ORF3基因全長(zhǎng)均為675 bp，無核苷酸插入和缺失；與CV777ORF3基因相比，其中3株P(guān)EDV山西分離株ORF3基因有21個(gè)相同的核苷酸突變，分別為62，162，360，393位核苷酸T→C，54，60，235，301位核苷酸G→A，63，237，243，264，274，369，439，450位核苷酸C→T，238，546位核苷酸T→G，438位核苷酸T→A，497位核苷酸A→G，631位核苷酸T→A；另外，CH_SXCH11_2015株的第616位核苷酸A→T，第630位核苷酸A→C。4株P(guān)EDV山西分離株ORF3基因推導(dǎo)的氨基酸序列與CV777相比，相同核苷酸突變的有第21位氨基酸V→A，第54，79位V→I，第80位F→V，第92位L→F，第101位A→T，第165位N→S，第182位H→Q；另外，CH_SXCH11_2015株的第206位氨基酸I→F，第211位F→I。4株P(guān)EDV山西分離株ORF3基因與attenuated DR13相比，在244-245位核苷酸間多了51個(gè)核苷酸(圖2)，推導(dǎo)的氨基酸序列比attenuated DR13在81-82位氨基酸間多了17個(gè)氨基酸(圖3)。

圖2 PEDV ORF3基因核苷酸序列分析Fig.2 Nucleotide sequence analysis of the ORF3 gene of PEDV

圖3 PEDV ORF3基因氨基酸序列分析Fig.3 Amino acid sequence analysis of the ORF3 gene of PEDV

2.3ORF3基因同源性分析

4株山西分離毒株ORF3基因之間的核苷酸和氨基酸同源性分別為99.6%～100.0%和98.7%～99.6%。與CV777、疫苗株CV777 truncated和attenuated DR13核苷酸同源性分別為96.6%～97.0%，90.6%，97.6%～98.1%，氨基酸同源性分別為95.1%～96.0%，88.0%，97.1%～98.1%。

2.4ORF3基因的遺傳進(jìn)化分析

利用DNAStar對(duì)獲得的ORF3基因與GenBank中收錄的PEDV的ORF3基因序列比對(duì)，并構(gòu)建進(jìn)化樹，結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，PEDV毒株可分為3大群：G1包括CV777、LZC和Brl/87；CV777 truncated和attenuated DR13屬于G2；G3又分為3個(gè)小群，其中，G3-1群包括DR13、Chinju99和CH/S；3個(gè)韓國(guó)株(CPF299、PFF188、PFF285)和3個(gè)中國(guó)株(CH/FJND-3/2011、CH/ZKXH/11、CH/SHH/06)組成G3-2；G3-3包括本研究中得到的4株山西分離毒株、12株2010-2015年我國(guó)各地方分離的毒株和2009年分離的CH/JL/09毒株。遺傳進(jìn)化分析結(jié)果表明，4株山西分離毒株與12株2010-2015年我國(guó)各地方分離的毒株、2009年分離的CH/JL/09毒株親緣關(guān)系較近，與CV777、LZC、Brl/87和2個(gè)疫苗株(CV777 truncated和attenuated DR13)親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖4 PEDV ORF3基因的進(jìn)化樹分析Fig.4 Phylogenetic tree analysis of the ORF3 gene of PEDV

3 討論

2010年10月，我國(guó)南方暴發(fā)PED[16]，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大損失。2014年冬季至2015年春季，山西省部分規(guī)?；i場(chǎng)哺乳仔豬暴發(fā)腹瀉病，山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所動(dòng)物基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究室對(duì)山西11個(gè)地市仔豬腹瀉進(jìn)行了流行病學(xué)調(diào)研，結(jié)果顯示，PEDV陽(yáng)性率為73.26%，TGEV陽(yáng)性率為7.36%。表明山西省豬群發(fā)生的腹瀉，主要是由豬流行性腹瀉病毒所引起。

4株P(guān)EDV山西分離毒株的ORF3基因與GenBank中收錄的PEDV進(jìn)行對(duì)比分析，4株山西分離毒株與12株2010-2015年我國(guó)各地方分離的毒株和2009年分離的CH/JL/09毒株親緣關(guān)系較近，與CV777以及2個(gè)疫苗株(CV777truncated和attenuatedDR13)親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，同源性較低。Park等[12]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過細(xì)胞適應(yīng)的毒株比親本毒株和野生毒株的ORF3基因有51個(gè)核苷酸的缺失。4株山西分離毒株與attenuated DR13相比，在244-245位核苷酸插入51個(gè)核苷酸，表明4個(gè)山西分離毒株為野生毒株。4個(gè)山西分離毒株與CV777ORF3基因相比，無核苷酸插入和缺失，有多處核苷酸發(fā)生變異，與董彥鵬等[17]、顧超逸等[18]、黃冬妮等[19]、鄧小紅等[20]分離的毒株既有相同的變異位點(diǎn)，又有不同的變異位點(diǎn)，可能是由于受到各個(gè)地方當(dāng)?shù)氐沫h(huán)境、免疫壓力或藥物等因素的影響產(chǎn)生不同變異，變異的多樣性，增加了PED的防控難度。因此，各地應(yīng)及時(shí)收集分析當(dāng)?shù)氐腜EDV變異情況，為PED的防控提供理論參考。

[1] 陳溥言. 獸醫(yī)傳染病學(xué)[M]. 5版. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2006：229-231.

[2] 斯特勞 B E. 豬病學(xué)[M]. 9版. 趙德明，張仲秋，沈建忠，譯. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2008：399-403.

[3] Pensaert M B,Debouck P. A new coronavirus-like particles associated with diarrhea in swine[J]. Arch Virol，1978，58 (3)：243-247.

[4] Chasey D，Cartwright S F. Virus-like particles associated with porcine epidemic diarrhea [J]. Res Vet Sci，1978，25(2)：255-256.

[5] 宣 化，邢德坤，王殿瀛，等. 應(yīng)用豬胎腸單層細(xì)胞培養(yǎng)豬流行性腹瀉病毒的研究[J]. 中國(guó)人民解放軍獸醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，1984，4(3)：202-208.

[6] Kocherhans R，Bridgen A，Ackermann M，et al. Completion of thePorcineepidemicdiarrheacoronvirus(PEDV)genome sequence [J]. Virus Genes，2001，23(2)：137-144.

[7] Park S J,Kim H K,Song D S. Complete genome sequences of a Korean virulentPorcineepidemicdiarrheavirusand its attenuated counterpart [J]. J Virol，2012，86(10)：5964-5964.

[8] Song D S，Yang J S，Oh J S，et al. Differentiation of a Vero Cell adaptedPorcineepidemicdiarrheavirusfrom Korean field strains by restriction fragment lengthpolym orphism analysis of ORF3[J]. Vaccine，2003，21(17/18)：1833-1842.

[9] Park S J, Moon H J, Luo Y, et al. Clonging and further sequence analysis of theORF3 gene of wild-and attenuated-type porcine epidemic diarrhea virus[J]. Virus Genes, 2008, 36: 95-104.

[10] Chen J, Wang C, Shi H, et al. Molecular epidemiology ofPorcineepidemicdiarrheavirusin China[J]. Arch Virol, 2010, 155:1471-1476.

[11] Brian D A，Baric R S. Coronavirus genome structure and replication [J]. Curr Top Microbiol Immunol，2005，287：1-30.

[12] Park S，Kim H K，Song D S，et al. Complete genome sequences of a Korean virulentPorcineepidemicdiarrheavirusand its attenuated counterpart [J]. J Virol，2012，86(10)：59-64.

[13] Wang K，Lu W，Chen J，et al. PEDV ORF3 encodes an ion channel protein and regulates virus production [J]. FEBS Lett，2012，586(4)：384-391.

[14] 霍金耀. 豬流行性腹瀉病毒檢測(cè)方法建立及基因變異分析[D]. 鄭州：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013.

[15] Wang K, Lu W, Chen J,et al. PEDV ORF3 encodes an ion channel protein and regulates virus production[J]. FEBS Lett, 2012, 586 (4)：384-391.

[16] Sun R Q，Cai R J，Chen Y Q，et al. Outbreak of porcine epidemic diarrhea in sucking piglets，China[J]. Emerg Infect Dis，2012，18(1)：161-163.

[17] 董彥鵬，白 娟，范寶超，等. 豬流行性腹瀉病毒RT-PCR檢測(cè)與ORF3基因分子流行病學(xué)調(diào)查[J]. 中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2013，35(7)：555-558.

[18] 顧超逸，孫 裴，施 雷. 安徽省豬流行性腹瀉病毒的ORF3基因序列分析[J]. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2015，43(2)：1-6.

[19] 黃冬妮，黃宗良，馬春全，等. 廣東省豬流行性腹瀉病毒ORF3和M基因的克隆與序列分析[J]. 黑龍江畜牧獸醫(yī)：科技版，2015(5)：136-139.

[20] 鄧小紅，余偉權(quán)，李 彬，等. 我國(guó)華東地區(qū)豬流行性腹瀉病毒ORF3基因的遺傳變異分析[J].畜牧與獸醫(yī)，2015,47(3)：34-38.

Sequence Analysis of theORF3 Gene ofPorcineepidemicdiarrheavirusin Shanxi Provine

LIU Wenjun，WANG Juanping,YAO Jingming，WU Xin，MENG Fan，HAN Yichao，F(xiàn)AN Zhenhua， XUE Yipeng，MI Ruijuan，LI Hongli，ZHAO Yue

(Institute of Animal Husbandry and Veterinary，Shanxi Academy of Agricultural Sciences，Taiyuan 030032，China)

To investigate the variation theORF3 gene ofPorcineepidemicdiarrheavirus，4 PEDV field strains were cloned and sequenced which were isolated from 11 cities of Shanxi from 2014 to 2015. These strains were analyzed and compared with the other published PEDV strains. Sequence analysis ofORF3 gene revealed that the 4 PEDV field strains had several specific nucleotides and amino acids which were different from CV777. The nucleotide and amino acid homologies were 99.6% to 100.0% and 98.7% to 99.6% among 4 PEDV field strains. Compared with CV777，CV777 truncated，attenuated DR13，the nucleotide homologies were 96.6% to 97.0%，90.6%，97.6% to 98.1%,and amino acid homologies were 95.1% to 96.0%，88.0%，97.1% to 98.1%，respectively. Phylogenetic analysis showed that the 4 PEDV field strains were genetically close to other prevalent strains from other parts of China from 2010 to 2015，CH/JL/09 isolated in 2009;However,there were genetically different from CV777，LZC，Brl/87，CV777 truncated，attenuated DR13.

Porcine epidemic diarrhea；Shanxi strains；ORF3 gene；Sequence analysis

2017-07-06

山西省科技攻關(guān)項(xiàng)目(20140311020-2-A；20150311018-3)

劉文俊(1979-)，男，山西河津人，助理研究員，碩士，主要從事動(dòng)物疫病分子生物學(xué)檢測(cè)與診斷技術(shù)研究。

王娟萍(1958-)，女，山西太原人，研究員，主要從事畜禽傳染病研究。

S852.65；S432.4

A

1000-7091(2017)04-0103-04

10.7668/hbnxb.2017.04.017