張 怡，張 超，楊艷杰，于 潔，季慧佳，陳 紅，劉文婷，李曉博，李 蒙，李成偉,3

(1.周口師范學(xué)院，植物遺傳與分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 周口 466001；2.杭州師范大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，浙江 杭州 310000；3.河南科技學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453007)

周口地區(qū)大豆根瘤菌的分離與分子鑒定

張 怡1，張 超2，楊艷杰1，于 潔1，季慧佳1，陳 紅1，劉文婷1，李曉博1，李 蒙1，李成偉1,3

(1.周口師范學(xué)院，植物遺傳與分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 周口 466001；2.杭州師范大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，浙江 杭州 310000；3.河南科技學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453007)

為了進(jìn)一步研究發(fā)掘新的根瘤菌資源庫，采用平板劃線分離的方法從大豆根瘤中分離純化根瘤菌，并且將獲得的菌株進(jìn)行盆栽回接試驗(yàn)，結(jié)果表明，分離獲得的大豆根瘤菌菌株均可在大豆和苜蓿上結(jié)瘤，具有結(jié)瘤能力。根據(jù)已公布大豆根瘤菌共同結(jié)瘤基因nodA、nifH、16SrDNA保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物，并且對nodA、nifH、16SrDNA序列進(jìn)行擴(kuò)增分析和系統(tǒng)發(fā)育分析，由此鑒定分離的根瘤菌為費(fèi)式中華根瘤菌，從而在分子水平上實(shí)現(xiàn)了對大豆根瘤菌的快速鑒定。

大豆；根瘤菌；回接鑒定；費(fèi)式中華根瘤菌

根瘤菌需要特定的基因才能與豆科植物形成有效的共生。包括編碼產(chǎn)生nod因子的nod基因，該基因能刺激植物產(chǎn)生共生節(jié)結(jié)和固氮基因，從而產(chǎn)生固氮酶。nod基因是根瘤菌中一類獨(dú)特的基因[7]，包括nodA、nodB、nodC，這些基因是根瘤形成的關(guān)鍵，參與了共生早期階段，其中任何一個基因的突變，都會使菌株失去結(jié)瘤的能力[8-9]。相比之下，發(fā)現(xiàn)nif基因在許多細(xì)菌中均存在。在大豆固氮菌中，研究最多的固氮基因是nifH和nifD[10-11]。在固氮生物的進(jìn)化歷程中，其編碼固氮酶鐵蛋白成分的基因nifH核苷酸序列具有高度良好的保守性，它常常用來證明固氮菌的存在[12]。

在細(xì)菌基因組中，編碼16S rRNA的rDNA基因具有較強(qiáng)的保守性[13]，片段大小適宜檢測，所以一直成為細(xì)菌分子鑒定的標(biāo)準(zhǔn)序列，但是由于16SrRNA序列的高度保守性，使它在種屬以下的分類水平具有很大的不穩(wěn)定性；而親緣關(guān)系在種屬以上分類水平的菌株具有非常良好的分辨率[14]。所以，16SrDNA全序列的分析在分類學(xué)的地位上具有非常明顯優(yōu)勢，可廣泛用于細(xì)菌和真菌的分類鑒定。

本研究對周口師范學(xué)院試驗(yàn)田中的大豆進(jìn)行根瘤菌的分離純化和回接試驗(yàn)，并且根據(jù)已經(jīng)公布的大豆根瘤菌共同結(jié)瘤基因nodA、nifH、16SrDNA保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物，從分子水平進(jìn)一步鑒定分離的根瘤菌，并對nodA、nifH、16SrDNA序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹分析，以期對周口的大豆根瘤菌資源的分類和研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌株 周口師范學(xué)院試驗(yàn)田大豆根瘤菌株。

1.1.2 培養(yǎng)基與試劑 YMA固體培養(yǎng)基：酵母粉3 g，甘露醇10 g，NaCl 10 g，MgSO4·7H2O 0.20 g，K2HPO40.25 g，pH值 7.0，瓊脂粉15～18 g。

根瘤菌提取試劑(緩沖液GUTC)：稱取23.26 g的異硫氰酸胍和0.078 g反式環(huán)己二胺四乙酸，溶解于40 mmol/L Tris-HCl (pH值 8.0)緩沖液20 mL，待試劑完全溶解后，再用相同濃度的Tris-HCl定容為50 mL，即最終濃度為4 mol/L的GUTC緩沖液。

洗滌緩沖液：2 mmol/L EDTA (pH值 8.0)，40 mmol/L Tris-HCl (pH值8.0)，無水乙醇600 mL，800 mmol/L NaCl，定容至1 L，存放于錐形瓶中。

硅藻土吸附緩沖液：稱取5 g的硅藻土，用1×TE緩沖液洗滌硅藻土2～3次，最后按照1∶1的量加入1×TE緩沖液，即為硅藻土吸附緩沖液。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 根瘤菌的分離和純化 大豆根瘤菌的分離和純化參考Peter等[15]方法，具體如下：在超凈臺中，選取新鮮飽滿的根瘤，用剪刀將其剪下，先將根瘤放在無菌水中浸泡5～6 min，清除表面的雜質(zhì)，用75%無水乙醇表面消毒3～5 min后，再用3.5%的NaClO消毒8 min，之后用無菌水將其沖洗9～10次，用消過毒的刀子將單個根瘤切開后，再用鑷子夾住根瘤在剛果紅培養(yǎng)基上劃線，在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d后就會有清晰的菌落長出，并且根據(jù)菌體的形態(tài)、大小、透明度、黏稠度、顏色、光澤等特征，對分離得到的根瘤菌單克隆進(jìn)行3～4次的劃線分離，直到長出清晰的單克隆。

1.2.2 根瘤菌的抗性鑒定 在含有100，200 μg/L抗生素(利福平、羧芐青霉素、頭孢菌素)的YMA固體培養(yǎng)基上，挑取單菌落進(jìn)行平板劃線，對照采用無抗性的YMA固體培養(yǎng)基，放置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d直到對照有清楚的單菌落出現(xiàn)。1.2.3 根瘤菌的回接誘導(dǎo)根瘤 將滅過菌的營養(yǎng)土裝入塑料杯中，供試大豆的根瘤菌為本研究所分離的菌株。首先將大豆種子用70%無水乙醇表面消毒3～4 min，苜蓿種子消毒1～2 min后，再用3.5% NaClO消毒大豆種子7～8 min，苜蓿種子4～6 min，然后用無菌水將其沖洗7～8次，待大豆和苜蓿的種子在無菌水中吸水膨脹后，倒出多余的水并保留一層水，在28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)至發(fā)芽后，播入裝有營養(yǎng)土的塑料杯中。將植株放置于白天25～30 ℃、夜間13～20 ℃、每天12 h的光照培養(yǎng)室中培養(yǎng)觀察。等到大豆和苜蓿植株長出真葉后再接種根瘤菌菌液。供試菌株經(jīng)搖菌活化培養(yǎng)后，在塑料杯中接根瘤菌菌液7 d 3次，每次約10 mL，接種30 d后洗根觀察結(jié)果。

1.2.4 根瘤菌總DNA提取 根瘤菌總DNA的提取方法參考陳強(qiáng)等[16]的試驗(yàn)方法。提取總的根瘤菌DNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后，質(zhì)量較好的可作為模板進(jìn)行PCR檢測(圖1)。

M.DL2000；1～3.根瘤菌DNA。M.DNA Ladder 2000；1-3.DNA of rhizobium.

1.2.5nodA、nifH、16SrDNA序列分析及系統(tǒng)發(fā)育分析 根據(jù)NCBI上公布的nodA、nifH、16SrDNA基因序列，Blast后在保守區(qū)設(shè)計(jì)3對特異性引物(表1)[13,17]，對根瘤菌的基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測出目的基因。PCR反應(yīng)的總體積為20 μL，其中模板1 μL，引物各0.5 μL，ddH2O 8 μL，TaqDNA聚合酶Mix 10 μL。反應(yīng)程序：94 ℃，5 min預(yù)變性；94 ℃ 30 s變性，56 ℃ 45 s退火，72 ℃ 2 min延伸，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min延伸，12 ℃保存。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物切膠純化后連接pEASY-T1 克隆載體，進(jìn)行測序，將所測的序列用NCBI軟件中Blast比對分析其同源性。并利用DNAMAN軟件對同源性較高的序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析及進(jìn)化樹的構(gòu)建。

表1 根瘤菌分子鑒定中所使用的PCR引物Tab.1 PCR primers used in the identification of rhizobium

2 結(jié)果與分析

2.1 表型鑒定

通過稀釋平板劃線分離得到根瘤菌的表型發(fā)現(xiàn)，所得到的菌落其表面光滑、濕潤，同時菌落呈圓形，稍有凸起，不透明，這些均符合根瘤菌的基本形態(tài)特征(圖2)。

圖2 大豆根瘤菌的平板劃線分離Fig.2 Screening separation of soybean rhizobia on plate

2.2 根瘤菌的抗性分析

通過抗性鑒定表明，本研究所分離的根瘤菌具有羧芐青霉素、頭孢菌素抗性，而基本不具有利福平抗性(圖3)。

2.3 回接試驗(yàn)的結(jié)瘤情況

回接試驗(yàn)是鑒定根瘤菌的有效方法，采用盆栽接種大豆根瘤菌的方法，均能使大豆和苜蓿結(jié)瘤，且根系發(fā)達(dá)，結(jié)瘤數(shù)量較多(圖4)，初步可證明分離的細(xì)菌為根瘤菌。

A.羧芐青霉素；B.頭孢菌素；C.利福平；D.對照。A.Carbenicillin；B.Cephalosporin；C.Rifampicin；D.Control.

A.大豆；B.苜蓿。A.Soybean;B.Alfalfa.

2.4 根瘤菌的分子鑒定

提取總的根瘤菌DNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后，質(zhì)量較好的可作為模板進(jìn)行PCR檢測。對根瘤菌的16SrDNA、nodA和nifH保守基因序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，各個基因的目的片段都和已知基因片段大小相似，進(jìn)一步對該片段進(jìn)行膠回收后，連接pEASY-T1克隆載體進(jìn)行測序，所擴(kuò)增的片段分別和已知的16S rDNA、nodA和nifH基因序列高度同源(圖5)。且各個基因序列均與費(fèi)式中華根瘤菌的同源性達(dá)到98%以上，進(jìn)一步鑒定該菌株為費(fèi)式中華根瘤菌。

2.5nodA、nifH、16SrDNA的系統(tǒng)發(fā)育分析

根據(jù)上述16SrDNA、nodA和nifH保守基因序列的比對結(jié)果，從NCBI數(shù)據(jù)庫中獲得了多個同源性較高的序列，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，通過nifH、nodA、16SrDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育分析后發(fā)現(xiàn)，nodA的進(jìn)化樹明顯分為2支，nodA序列與德國的費(fèi)式中華根瘤菌(CP003572.1)的親緣關(guān)系在99%以上，聚集在一個分支上(圖6)。nifH的進(jìn)化樹枝也分為2支，nifH序列與費(fèi)氏中華根瘤菌菌株的nifH基因同源性在99%以上，并且聚集在同一個分支(圖7)。而16SrDNA的序列也分為2支，但本研究所分離菌株的16SrDNA序列(KX371347)單獨(dú)成為一支，而其他幾個序列聚集在一個分支，且它們的同源性在98%以上(圖8)，由此鑒定本研究所分離的大豆根瘤菌為費(fèi)式中華根瘤菌。

M.DL2000, DNA Ladder 2000；1～3.nifH的PCR產(chǎn)物；4～6.nodA 的PCR產(chǎn)物；7～9.16S rDNA的PCR產(chǎn)物。M.DNA Ladder 2000；1-3.nifH，PCR product of nifH；4-6.nodA，PCR product of nodA；7-9.16S rDNA，PCR product of 16S rDNA.

圖6 分離菌株nodA序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹

圖7 分離菌株nifH序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.7 Phylogenetic tree of isolates and reference strains based upon aligned sequences of nifH gene

圖8 分離菌株16S rDNA部分序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.8 Phylogenetic tree of isolates and reference strains based upon aligned sequences of 16S rDNA gene

3 結(jié)論與討論

大豆根瘤菌是一種活的微生物制劑能與豆科植物互利共生：豆科植物通過光合作用產(chǎn)生的有機(jī)物，一部分供給根瘤菌；根瘤菌則通過生物固氮產(chǎn)生的氨，并供給豆科植物[18-19]。根瘤菌是主要存在豆科植物根部和莖部的一種內(nèi)生細(xì)菌，不僅能與宿主植物形成共生體系，還能促進(jìn)植物的快速生長，提高其抗逆性、抗病蟲害等能力[20]。大豆根瘤菌與苜蓿和大豆建立的共生體系，是農(nóng)業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)中氮源的充分有效補(bǔ)充，共生體系分子機(jī)制的研究可以大大促進(jìn)根瘤菌在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用，在新型農(nóng)業(yè)的推廣中發(fā)揮著重要的作用。

本研究對根瘤菌菌株的16SrDNA、nodA和nifH保守基因進(jìn)行序列擴(kuò)增分析和系統(tǒng)發(fā)育分析的分子生物學(xué)方法，經(jīng)過對比GenBank中同源性較高的序列并通過對根瘤菌的分子鑒定及進(jìn)化樹的構(gòu)建，發(fā)現(xiàn)根瘤菌的nodA序列和德國的費(fèi)式中華根瘤菌聚在同一個分支上，種間差異很小，保守性很強(qiáng)，與埃及、墨西哥、塞維利亞、中國(西北農(nóng)林大學(xué))和德國(日內(nèi)瓦大學(xué))的根瘤菌聚在一個大支上。nifH序列與費(fèi)氏中華根瘤菌菌株的nifH基因同源性在99%以上，聚集在同一個分支上，與德國、巴西、中國(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)、四川農(nóng)學(xué)院)的根瘤菌聚在一個大支上。但本研究分離的根瘤菌菌株的16SrDNA在進(jìn)化樹上卻單獨(dú)成為一支，且黑龍江的根瘤菌與美國的根瘤菌在同一分支，且同源性很高，但與中國農(nóng)業(yè)大學(xué)的根瘤菌種間距離較遠(yuǎn)，由此推斷，根瘤菌的進(jìn)化并不與地域遠(yuǎn)近有直接的關(guān)系。

本試驗(yàn)通過對分離純化的根瘤菌菌株通過表型鑒定和分子鑒定，并通過回接結(jié)瘤驗(yàn)證，最終鑒定為費(fèi)式中華根瘤菌，本研究對周口的大豆根瘤菌進(jìn)行系統(tǒng)的分離和鑒定，豐富了河南省大豆根瘤菌的資源，為進(jìn)一步對其分子機(jī)制研究奠定了理論基礎(chǔ)。

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Isolation and Molecular Identification of Soybean Rhizobium in Zhoukou

ZHANG Yi1，ZHANG Chao2，YANG Yanjie1，YU Jie1，JI Huijia1，CHEN Hong1，LIU Wenting1，LI Xiaobo1，LI Meng1，LI Chengwei1,3

(1.Key Laboratory of Plant Genetics and Molecular Breeding，Zhoukou Normal University，Zhoukou 466001，China；2. Medical College of Hangzhou Normal University，Hangzhou 310000，China；3. Henan Institute of Science and Technology，Xinxiang 453007，China)

In order to explore new rhizobium resource，the method of separating and purifying the root nodule bacteria from soybean root nodules was studied，and a pot experiment was carried out. The results showed that the isolated rhizobium of soybean could form nodules in soybean and alfalfa. According to the published soybean rhizobium common node tumor genes ofnodA,nifH,16SrDNA，all the three genes were amplified. Phylogenetic analysis demonstrated that the strain isolated from Zhoukou was highly conserved withSinorhizabiumfrediiof Germany，which convinced that rhizobium strain wasS.fredii. The research provided the quick and accurate method for identification of soybean rhizobium at the molecular level.

Soybean；Rhizobium；Re-inoculation and identification；Sinorhizabiumfredii

2017-07-15

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31272168)；河南省教育廳科學(xué)技術(shù)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(14A180038)；河南省國際科技合作項(xiàng)目(144300510072)；周口師范學(xué)院校本項(xiàng)目(ZKNUB215202)

張 怡(1985-)，女，河南洛陽人，講師，碩士，主要從事植物與微生物互作研究。

李成偉(1972-)，男，河南商丘人，教授，博士，主要從事植物與病原體互作、抗性分子育種及生物反應(yīng)器制藥等研究。

S432.4

A

1000-7091(2017)04-0098-05

10.7668/hbnxb.2017.04.016