王國東，李金晶，白智偉，關瑞攀，楊 野，曲 媛，崔秀明，劉迪秋

(昆明理工大學 生命科學與技術學院，云南 昆明 650500)

三七NAC轉錄因子基因PnNAC1的克隆及表達特性分析

王國東，李金晶，白智偉，關瑞攀，楊 野，曲 媛，崔秀明，劉迪秋

(昆明理工大學 生命科學與技術學院，云南 昆明 650500)

為了揭示三七抗病防衛(wèi)反應的調控機制，對三七的一個NAC轉錄因子的全長cDNA進行了克隆和表達特性分析。以一年生三七幼苗為材料，根據編碼NAC轉錄因子的三七轉錄組Unigene設計引物，采用快速擴增cDNA末端技術，克隆得到一個新的NAC轉錄因子基因，命名為PnNAC1。序列分析表明，該基因全長815 bp，含有24 bp的5′非翻譯區(qū)和215 bp的3′非翻譯區(qū)，以及576 bp開放閱讀框，共編碼191個氨基酸，具有保守的NAC結構域。實時熒光定量PCR結果顯示茉莉酸甲酯預處理三七根部大幅提高了PnNAC1在根中的轉錄水平，接種茄腐鐮刀菌后，PnNAC1的表達進一步上升，在接種后4 h轉錄水平達最大值；無菌水預處理的三七中，PnNAC1也快速響應茄腐鐮刀菌的侵染，但表達水平明顯低于茉莉酸甲酯預處理的樣品。接種人參鏈格孢后PnNAC1在葉片的表達量受抑制。茉莉酸甲酯、乙烯利、水楊酸和過氧化氫4種信號分子處理三七根部均誘導PnNAC1的表達。表明PnNAC1響應幾種逆境相關信號分子，并參與三七對茄腐鐮刀菌和人參鏈格孢的防衛(wèi)反應。

三七；NAC轉錄因子；茄腐鐮刀菌；人參鏈格孢；防衛(wèi)反應

轉錄因子又稱反式作用因子，通過調節(jié)基因表達水平參與調控生物體的生長代謝過程。NAC (NAM，ATAF and CUC)轉錄因子是植物中特有的最大的一類轉錄因子之一。最早在矮牽牛(Petuniahybrida)中分離出第一個NAC轉錄因子NAM[1]，緊接著在擬南芥(Arabidopsisthaliana)中發(fā)現(xiàn)了具有類似功能的ATAF1/2和CUC2基因[2]，它們編碼的蛋白質N端都有一段保守的氨基酸序列。分別取自矮牽牛NAM、擬南芥AT-AF1/ATAF2和CUC2基因的首字母將這類蛋白質命名為NAC[3]。大部分NAC轉錄因子結構中含有一個保守的N端DNA結合域和一個核定位信號以及一個 C端可變結構域[4]，N端保守的NAC結構域可進一步分為A～E 5個保守的子結構域，具有結合DNA或蛋白質的功能及二聚體化的作用。與N端的高度保守性不同，NAC轉錄因子的C端無論是在氨基酸序列還是序列長度上都表現(xiàn)出多樣性，C端具有轉錄激活、抑制或結合蛋白質活性[5]。

NAC類轉錄因子在植物的生命活動中發(fā)揮重要作用。擬南芥AtNAC2主要在花和根中高度表達，在擬南芥中超表達AtNAC2能夠促進側根的發(fā)育，同時增加植株的耐鹽性，AtNAC2的超表達以及促進側根的形成受乙烯和生長素的誘導[6]。大豆GmNAC004通過促進生長素信號，抑制ABA信號，從而促使側根的發(fā)育[7]。此外，NAC類轉錄因子還參與調控葉片的衰老和凋亡[8]、頂端分生組織的形成[2,9]、木質部形成及生長調節(jié)[10]、促進次生壁的形成和增厚[11-13]。NAC類轉錄因子也參與植物對生物和非生物脅迫的防衛(wèi)反應。小麥(Triticumaestivum)TaNAC5參與非生物逆境脅迫及相關信號分子的應答，在小麥受滲透和低溫脅迫下TaNAC5基因的表達受誘導并上調，而高鹽脅迫則抑制TaNAC5基因表達[13]。水稻(Oryzasativa)SNAC2過表達提高了轉基因水稻植株對冷和鹽脅迫的抗性，還增強植株對ABA的靈敏度[14]。在水稻中過量表達水稻SNAC1能通過調控保衛(wèi)細胞的閉合來增強水稻的抗旱性[4]，在小麥植株中表達SNAC1基因增加了小麥對ABA的敏感性，并提高了轉基因小麥對干旱和鹽堿化的耐受性[15]。

三七(Panaxnotoginseng(Burk) F.H. Chen)是我國傳統(tǒng)中藥材的一顆璀璨明珠，有“南國神草”、“參中之王”等美稱。三七主要分布在云南、廣西等地，尤其云南省文山州，主要化學成分有皂苷、多糖、氨基酸和揮發(fā)油，具有止血、活血、補血、抗腫瘤、降血糖、調節(jié)免疫和抗炎等作用。三七藥材的市場需求量逐年上升，然而三七的生長周期長，三年生三七才能入藥，三七喜溫濕環(huán)境，生長過程中極易滋生病蟲害，尤其是根腐病、黑斑病等幾種真菌病害[16]。揭示三七的抗病機制，培育三七抗病品種，對保證三七種植業(yè)及相關產業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。外源茉莉酸甲酯(Methyl jasmonate，MeJA)能明顯誘導三七對根腐病菌茄腐鐮刀菌(Fusariumsolani)的抗性，從MeJA預處理三七受茄腐鐮刀菌侵染過程的轉錄組序列中發(fā)現(xiàn)了一個差異表達的Unigene編碼NAC轉錄因子。為了揭示MeJA對三七抗病性調控的分子機制，本研究對一個NAC轉錄因子基因的全長cDNA進行了克隆和表達特性分析。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

植物材料為一年生三七幼苗，種于昆明理工大學的遮陰大棚中。試驗所用茄腐鐮刀菌以及人參鏈格孢(Alternariapanax)菌株由昆明理工大學國家中醫(yī)藥管理局三七資源可持續(xù)利用重點實驗室從三七根腐病及黑斑病病株中分離、鑒定并保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品處理 用剪刀對正常生長的一年生三七根部進行受傷處理，然后用MeJA (100 μmol/L)和無菌水(對照) 蘸根處理三七30 min，24 h后用200 mL茄腐鐮刀菌分生孢子懸液(2×106個孢子/mL) 蘸根接種三七30 min，最后收集接種后4，12，24，48，72 h的三七根；一年生三七葉片受傷處理后接種人參鏈格孢菌絲，采集接種后2，12，24，48，72，96 h的三七葉片；分別用200 mL茉莉酸甲酯(100 μmol/L)、水楊酸(Salicylic acid，SA，200 μmol/L)、H2O2(1 mmol/L)以及乙烯利(Ethephon，ETH，1 mmol/L)溶液蘸根處理三七30 min，收集處理后4，12，24，48，72 h的三七根。所有樣品先經液氮速凍，然后保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 RNA提取、mRNA分離及RACE (Rapid-amplification of cDNA ends) 用TRIGene總RNA提取試劑盒(GenStar Biosolutions)提取上述各樣品中的總RNA。分別從各RNA樣品中取等量混勻，然后按照張南南等[17]的方法分離mRNA，并采用SMARTRACE cDNA Amplification Kit (Clontech，USA)分別合成5′-RACE和3′-RACE 的cDNA模板。依據MeJA預處理三七受茄腐鐮刀菌侵染過程轉錄組測序產生的編碼NAC轉錄因子的Unigene序列，設計并合成基因特異引物。5′-RACE及3′-RACE特異引物序列分別為5′-CATCGTCGTAGTTGTGCTCGTAAACTCG-3′和 5′-TAGATGGTAAAGCTATGGCAGAAGGCAA-3′。擴增DNA條帶經TA克隆后轉化至大腸桿菌中，并挑選單克隆進行測序。

1.2.3 全長ORF的克隆以及生物信息學分析 5′-RACE擴增序列、3′-RACE擴增序列和三七NAC轉錄因子Unigene序列進行拼接，然后查找拼接序列中的最大開放閱讀框(Open reading frame，ORF)。根據所拼接的cDNA序列設計擴增全長ORF的特異引物，再次進行PCR擴增，然后將擴增產物經T-A克隆后測序。擴增ORF的特異引物序列為5′-TTAATTAATCATGGGGGATAATAAT-3′和 5′-TATTGATGGGTTACACTTTTGTGAT-3′。接著對克隆所得 cDNA序列及編碼的蛋白質序列進行生物信息學分析，具體方法見參考文獻[18]。

1.2.4 Quantitative reverse transcription-PCR (qRT-PCR) 本研究采用qRT-PCR分析三七PnNAC1的轉錄水平。三七NAC轉錄因子基因的特異引物為5′-GTTGTGCTCGTAAACTCGACAGAC-3′和5′-ATATAGGCTTTGGCATGGTACTGG-3′。內參基因選擇、qRT-PCR反應體系、程序以及相對表達水平的計算等參照陳瑞等[19]的qPCR方法進行。

2 結果與分析

2.1 三七PnNAC1全長cDNA的克隆

根據前期研究中三七轉錄組測序產生的編碼NAC轉錄因子的EST序列，通過快速擴增cDNA末端技術擴增獲得該EST的全長cDNA序列。RACE的結果見圖1，序列測定結果顯示NAC轉錄因子基因的5′-RACE產物長511 bp，3′-RACE產物長為633 bp。經過序列拼接獲得NAC轉錄因子基因的全長cDNA序列長為815 bp，其中包含一個長度為576 bp的ORF、24 bp 5′-UTR (Untranslated region)以及215 bp 3′-UTR。ORF編碼的蛋白質由191個氨基酸殘基組成。根據拼接的全長cDNA序列，設計并合成特異性引物，成功擴增出了576 bp的全長ORF (圖1)。后續(xù)序列分析結果表明該基因編碼NAC蛋白，因此將該基因命名為PnNAC1 (GenBank登錄號KX530029)。

M.DL2000標記；1.5′-RACE擴增結果；2.3′-RACE擴增結果；3.PnNAC1基因全長ORF的擴增結果。M. DL2000 Marker；1.Amplification result of 5′RACE；2.Amplification result of 3′RACE；3.Amplification result of ORF of PnNAC1.

2.2 序列分析、多重序列比對及進化樹構建

BlastN分析結果顯示，三七PnNAC1的第25-405位核苷酸序列與馬鈴薯(Solanumtuberosum)StNAC25 (XM015310658.1)的第250-627位核苷酸序列的相似性為80%。PnNAC1 ORF編碼的蛋白質序列與芝麻(Sesamumindicum) SiNAC25 (XP_011092697.1)、可可(Theobromacacao) TcNAC (XP007043034.1)和StNAC25 (XP_015166144.1)的同源性較高，分別為75%，74%和74%。PnNAC1與StNAC25、煙草(Nicotianatomentosiformis) NtNAC25 (XP_009622295.1)、大豆(Glycinemax) GmNAC56(XP_003531559.1)的多重序列比對見圖2。PnNAC1編碼的蛋白質序列與其他3種植物的NAC轉錄因子高度相似，其中一些堿性氨基酸(R、K、H)和酸性氨基酸(D、E)殘基高度保守。在幾個NAC轉錄因子的C端分布較多的酸性氨基酸，堿性氨基酸則主要集中于N端。

使用MEGA6軟件對11個NACs以及PnNAC1蛋白構建系統(tǒng)進化樹。如圖3所示，所選NAC轉錄因子聚類為兩大支，Group Ⅰ和Group Ⅱ。PnNAC1與StNAC25、NtNAC25、GmNAC56、LOC Os04g35660.1和LOC Os02g34970.1屬于Group Ⅰ，包括AT2G02450.1在內的另外6個NAC轉錄因子屬于Group Ⅱ。Group Ⅰ又分為兩小支，PnNAC1與StNAC25、NtNAC25、GmNAC5位于同一小支，LOC Os04g35660.1和LOC Os02g34970.1聚為另一小支，可見PnNAC1與StNAC25和NtNAC25具有更高的同源性。

黑色倒三角標識的是保守的酸性氨基酸；星號標識的是保守的堿性氨基酸；黑色下劃線是預測的可能的DNA結合結構域。The conserved amino acid acid residues were labelled with black triangle；The conserved basic amino acid residues were labelled with asterisk；The putative DNA binding domain was underlined.

圖3 PnNAC1與一些植物NACs的進化樹分析Fig.3 Phylogenetic tree of the deduced amino acid sequence of PnNAC1 and some plant NACs

2.3PnNAC1編碼蛋白質的理化性質及信號肽預測

利用ProtParam在線工具對PnNAC1的理化性質進行預測，結果顯示PnNAC1的分子量約為22.13 kDa，等電點約為5.08。PnNAC1蛋白由191個氨基酸殘基組成，富含Asp (19，9.9%)、Leu ( 16，8.4%)、Ser (16，8.4%)、Gly (14，7.3%)，此外，有29個氨基酸殘基(Asp+Glu)帶負電，21個氨基酸殘基(Arg+Lys)帶正電。PnNAC1蛋白在酵母和大腸桿菌中的半衰期分別大于20 h和10 h。SignalP 4.1分析結果表明PnNAC1中不存在信號肽。此外，PredictProtein分析結果顯示該蛋白在植物細胞中定位于細胞核中，PnNAC1編碼的蛋白質可能為核內蛋白。

2.4PnNAC1編碼蛋白質的二級結構及三維結構預測

根據PredictProtein分析結果，PnNAC1蛋白結構中含有α-螺旋(H)、β-折疊(E)以及無規(guī)則卷曲(L)這3種二級結構，且它們的百分比分別為5.24%，21.99%和72.77%。蛋白質功能在很大程度上取決于蛋白質的三級結構。PnNAC1與水稻SNAC1 (Stress-responsive NAC1，3ULX)的一級結構相似，以水稻SNAC1為模板預測PnNAC1的三級結構。PnNAC1的三維結構二聚體模型如圖4所示，主要特征為幾個螺旋環(huán)繞一個由反向平行β-折疊組成的桶狀結構。

2.5PnNAC1的表達特性分析

MeJA預處理明顯增強了PnNAC1在三七根中的轉錄水平，接種茄腐鐮刀菌后PnNAC1的表達量繼續(xù)上升，4 h表達量最高，約為無菌水預處理對照的28倍，4 h后PnNAC1的轉錄水平明顯下降。對照(無菌水預處理三七)接種茄腐鐮刀菌后PnNAC1的表達量迅速上升，與接種前相比，4 h轉錄水平增加了16倍，之后表達量開始降低(圖5)。人參鏈格孢是三七黑斑病的致病菌，人參鏈格孢接種三七葉片后96 h內，PnNAC1的表達水平不同程度地受到抑制(圖5)。

圖4 PnNAC1二聚體的三維結構模型Fig.4 The putative 3D structure of dimer of PnNAC1

分別用4種信號分子MeJA、ETH、H2O2、SA處理三七均會迅速誘導三七根中PnNAC1的轉錄水平，只是PnNAC1受這4種信號分子的誘導程度不同(圖6)。MeJA處理三七后，PnNAC1的轉錄水平升高，與對照相比處理后24 h轉錄水平增加了14倍，之后表達量持續(xù)下降，至72 h，其表達量仍高于對照。ETH處理三七后的4 h時，PnNAC1的表達量達到最高，約為處理前的4倍，隨后表達量開始下降，在12～48 h又開始上升，48 h以后表達量下降到處理前的3倍。H2O2處理三七后24 h內，PnNAC1表達量持續(xù)上升，在24 h時達到最高，約為處理前的7.5倍，然后其表達量又開始持續(xù)下降，到72 h時的表達量只到處理前的1.5倍左右。三七根部受SA處理后4 h，PnNAC1的表達量達到最高，約為處理前的5倍，隨后表達量下降。綜上所述，PnNAC1在轉錄水平響應茄腐鐮刀菌、人參鏈格孢的侵染以及外源MeJA、ETH、H2O2、SA處理，在三七應對幾種真菌病害的防御過程中PnNAC1可能起重要作用。

圖5 茄腐鐮刀菌和人參鏈格孢侵染過程PnNAC1的相對轉錄水平Fig.5 The relative transcription levels of PnNAC1 during F.solani and A. panax infection

圖6 茉莉酸甲酯、乙烯利、過氧化氫和水楊酸處理后PnNAC1的相對轉錄水平Fig.6 The relative transcription of PnNAC1 after treatment by MeJA，ETH，H2O2 and SA

3 討論

三七是我國特有的名貴中藥材，隨著三七原藥材的需求量和種植面積逐年上漲，三七栽培過程中連作障礙和病蟲危害等問題也日益受到關注。三七需在遮陰網下栽培，喜陰濕環(huán)境，病害多發(fā)，尤其是根腐病和黑斑病，嚴重影響了三七藥材的產量和品質。本研究從三七中分離了一個參與根腐病和黑斑病防衛(wèi)反應的NAC轉錄因子基因，PnNAC1。PnNAC1的全長cDNA序列為815 bp，編碼一個由191個氨基酸殘基組成的蛋白質，分子量約為22.13 kDa，等電點約為5.08。進化樹分析表明PnNAC1編碼的蛋白質屬于Group Ⅰ。NAC是植物中一類重要的轉錄因子，其N端相對保守，而C端的氨基酸殘基高度多變[20]。PnNAC1與幾個來自其他植物的NAC轉錄因子的序列比對結果表明，C端有2個部位高度可變，一個是絲氨酸(S)富含區(qū)，另一個是天冬氨酸(D)富含區(qū)。

NAC轉錄因子的表達受多種不同環(huán)境因素及植物自身發(fā)育時期的誘導，在不同植物不同時期以及不同組織中表達程度存在差異。擬南芥中NAC1在根、莖、葉中表達水平各不相同，根中表達水平最高，在莖和葉中表達水平相對較低[9]。SbNAC0584參與了高粱(Sorghumvulgare)的整個生長發(fā)育過程，在各個組織(根系、氣生根、葉片、穗、莖、旗葉)中均有表達，但SbNAC0584在高粱氣生根和旗葉中的表達量相對較高，其次是在根中，而在高粱莖和穗中的表達量相對較低[21]。擬南芥中，ANAC019和ANAC055基因能夠激活JA誘導基因LOX2 (Lipoxygenase2)和VSP1 (Vegetativestorageprotein1)的轉錄，從而提高植株抗病能力[22]。致病疫霉(Phytophthorainfestans)侵染馬鈴薯后，顯著誘導了StNAC2的表達[23]。水稻接種稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)后，ONAC122和ONAC131表達受誘導[24]。水稻OsNAC19的表達響應外源MeJA、ABA和ETH的誘導，且更易于被MeJA所誘導[25]。本研究qRT-PCR結果顯示，茉莉酸甲酯預處理三七根部大幅提高了PnNAC1在根中的轉錄水平，接種茄腐鐮刀菌后，PnNAC1的表達進一步上升，在接種后4 h轉錄水平達最大值；無菌水預處理的三七中，PnNAC1也快速響應茄腐鐮刀菌的侵染，但表達水平明顯低于茉莉酸甲酯預處理的樣品。而接種人參鏈格孢后PnNAC1在葉片的表達量受抑制。茉莉酸甲酯、乙烯利、水楊酸和過氧化氫4種信號分子處理三七根部均明顯誘導PnNAC1的轉錄水平，暗示PnNAC1可能通過這些信號通路介導三七對茄腐鐮刀菌、人參鏈格孢等生物脅迫的防衛(wèi)機制。

NACs是一類多功能蛋白，不僅調節(jié)植物的生長發(fā)育，還參與植物的自身免疫過程。上述結果表明，在三七應對幾種真菌病害的防衛(wèi)反應中PnNAC1可能起重要作用，因此有必要對其功能及生物學活性進行深入研究。下一步我們將驗證PnNAC1的反式激活能力，并驗證PnNAC1的生物學功能。

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Cloning and Expression Analysis of a NAC Transcription Factor GenePnNAC1 fromPanaxnotoginseng

WANG Guodong，LI Jinjing，BAI Zhiwei，GUAN Ruipan，YANG Ye，QU Yuan，CUI Xiuming，LIU Diqiu

(Faculty of Life Science and Technology，Kunming University of Science and Technology，Kunming 650500，China)

To reveal the regulatory mechanism of defense response inPanaxnotoginseng(Burk) FH Chen against diseases，a NAC transcription factor gene was cloned fromP.notoginseng，and its expression pattern was analyzed in the present study. One year oldP.notoginsengseedlings were used as materials. According to an Unigene fromP.notoginsengtranscriptome which encoded a NAC transcription factor，the gene-specific primers were designed. Using the rapid amplification of cDNA end technology，a new NAC transcription factor gene ofP.notoginsengwas obtained which was namedPnNAC1. The cDNA sequence ofPnNAC1 was 815 bp in length and contained an intact open reading frame (ORF) of 576 bp，a 24 bp 5′-untranslated region (UTR)，and a 215 bp 3′-UTR. The ORF ofPnNAC1 encoded a putative protein with 191 amino acid residues which had a conserved NAC domain. Real-time PCR results indicated that pre-treatment with methyl jasmonate to roots ofP.notoginsengseedlings increased the transcription level ofPnNAC1 in roots，then the transcription level ofPnNAC1 was further risen after inoculation withFusariumsolani，and its expression level was maximal at 4 h post inoculation withF.solani. For the control (pretreatment with sterile water)，PnNAC1 also rapidly responded to infection ofF.solani，but its expression level was evidently lower than that in samples which were pre-treated with methyl jasmonate. Moreover，the expression ofPnNAC1 was inhibited in the leaves after inoculation withAlternariapanax. Furthermore，the transcription level ofPnNAC1 was induced by treatment with four kinds of signaling molecules including methyl jasmonate，ethylene，salicylic acid，and hydrogen peroxid. The above results suggest thatPnNAC1 responds to several stress-related signaling molecules and is involved in the defense response ofP.notoginsengagainst the infection ofF.solaniandA.panax.

Panaxnotoginseng；NAC transcription factor；Fusariumsolani；Alternariapanax；Defense response

2017-07-06

國家自然科學基金項目(81560610)；云南省應用基礎研究計劃項目(2014FA003)

王國東(1993-)，男，云南普洱人，主要從事生物工程研究。

劉迪秋(1979-)，女，湖北建始人，教授，博士，主要從事植物抗病基因工程研究。

S567.03;Q78

A

1000-7091(2017)04-0091-07

10.7668/hbnxb.2017.04.015