王一鳴，汪 湖，龍勝舉，趙英鵬，陳 延，賀忠群

(四川農(nóng)業(yè)大學 園藝學院，四川 成都 611130)

干旱脅迫對蒲公英滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、酶保護系統(tǒng)及質(zhì)膜水孔蛋白PIP2-3基因表達的影響

王一鳴，汪 湖，龍勝舉，趙英鵬，陳 延，賀忠群

(四川農(nóng)業(yè)大學 園藝學院，四川 成都 611130)

為了揭示蒲公英在干旱脅迫下滲透調(diào)節(jié)和酶保護系統(tǒng)的作用機理以及質(zhì)膜水孔蛋白PIP2-3基因的表達特征，采用盆栽控水試驗，研究了不同干旱脅迫(RWC=(90±5)%、RWC=(75±5)%、RWC=(50±5)%下蒲公英滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、酶保護系統(tǒng)以及質(zhì)膜水孔蛋白基因的相關(guān)表達。結(jié)果表明：隨著干旱脅迫的加重，蒲公英葉片中的可溶性糖、可溶性蛋白、游離脯氨酸的含量顯著增加，超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)的活性顯著提高，在輕度脅迫(MS)中呈持續(xù)上升的趨勢，重度脅迫(SS)中則呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(可溶性糖除外)；質(zhì)膜水孔蛋白PIP2-3基因的相對表達量上調(diào)，輕度脅迫(MS)顯著高于重度脅迫(SS)。復水7 d后，滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累以及SOD的含量下降，但仍顯著高于CK，POD、CAT的含量以及質(zhì)膜水孔蛋白PIP2-3基因的相對表達量恢復正常，說明在干旱脅迫條件下蒲公英通過增加滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累，提高酶保護系統(tǒng)的活性來增強植株的抗逆性，上調(diào)質(zhì)膜水孔蛋白基因的相對表達量來加強水分運輸能力。

蒲公英；干旱脅迫；滲透調(diào)節(jié)；酶保護系統(tǒng)；質(zhì)膜水孔蛋白

蒲公英(TaraxacummongolicumHand.-Mazz.)，又名蒲公草、婆婆丁、尿床草。屬菊科，蒲公英屬多年生草本植物，葉邊緣具有波狀齒或羽狀深裂[1]。目前臨床醫(yī)學已經(jīng)證實蒲公英具有抗氧化、抑菌、降血脂、降血糖、保肝利膽、胃黏膜損傷修復等作用[2]。具有十分重要的營養(yǎng)價值和藥用價值。

隨著全球氣候的逐步變暖，干旱已經(jīng)成為植物生長的限制因素，可造成作物產(chǎn)量的嚴重下降[3]。在我國，干旱、半干旱地區(qū)的面積約占國土面積的52.5%[4]，并呈逐年增加的趨勢。植物在遭受干旱脅迫而受到損傷之前，通過調(diào)節(jié)滲透物質(zhì)含量，讓細胞膨壓維持在一個正常的范圍內(nèi)，使細胞內(nèi)各種代謝過程得以正常進行[5]，同時依靠酶保護系統(tǒng)的響應(yīng)，降低植株體內(nèi)自由基的含量，從而減輕活性氧(ROS)對植株的傷害[6]，以此來降低脅迫對植物造成的損傷[7]。

水孔蛋白是原生質(zhì)膜上的水通道蛋白，可高效轉(zhuǎn)運水分子，屬于膜內(nèi)蛋白MIP家族[8]。有研究表明，擬南芥受到嚴重干旱脅迫時，AtPIP1對調(diào)節(jié)花節(jié)和根的滲透壓起著關(guān)鍵作用[9-10]。而水稻在受到嚴重干旱脅迫時，其質(zhì)膜水孔蛋白PIP的表達或者磷酸化水平會下降，以此降低質(zhì)膜的透水性[11]；但其液泡膜水孔蛋白TIP的表達量卻會提高[12]，所以在干旱脅迫下，植物可能通過降低PIP的表達以減少細胞內(nèi)水分的流失，提高TIP的表達，利用液泡來維持胞質(zhì)的滲透壓平衡[13]。

近年來，野生蔬菜的市場認可度越來越高，像蒲公英這樣具有藥用和食用功能的野生蔬菜，已經(jīng)在醫(yī)學和營養(yǎng)方面引起了廣泛的研究。目前，蒲公英在栽培技術(shù)、病蟲害防治、藥用成分提純等方面都有研究，但在逆境生理方面的研究較少，特別是抗旱研究。因此，研究干旱脅迫下蒲公英的各種生理變化，對于探討蒲公英的抗旱機制以及在干旱地區(qū)的種植都具有一定的參考價值。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗所用蒲公英種子來自遼陽園藝花卉科學研究所。

1.2 試驗方法

采用盆栽試驗法，在大棚中進行種植。將蒲公英種子散播在苗床中，等幼苗長出4片真葉時，移栽至以腐葉土∶蛭石∶珍珠巖(2∶1∶1)混合基質(zhì)的營養(yǎng)缽中(10 cm×10 cm)，基質(zhì)重量為370 g，每個營養(yǎng)缽中種2株幼苗。長出7片真葉時進行干旱處理，試驗設(shè)置3個脅迫水平(土壤相對含水量)，分別為對照CK(RWC=(90±5)%)，輕度脅迫MS(RWC=(75±5)%)，重度脅迫SS(RWC=(50±5)%)。每個處理30盆，總共90盆。處理開始前，使每個營養(yǎng)缽中土壤的含水量達到飽和，然后使其自然干旱至各脅迫水平并保持。試驗采取稱重法測定土壤含水量，每天進行一次。相關(guān)生理指標在持續(xù)脅迫0，3，6，9 d時進行測定，9 d后從每個處理中取出10盆復水至對照水平，復水7 d再測定相關(guān)生理指標。

1.3 測定內(nèi)容與方法

1.3.1 滲透調(diào)節(jié)物質(zhì) 可溶性蛋白采用考馬斯亮藍法測定；可溶性糖采用蒽酮法測定；脯氨酸(Pro)含量用酸性茚三酮法測定[14]。

1.3.2 抗氧化酶活性的測定 SOD測定方法參考《植物生理學實驗教程》[14]；POD、CAT測定參考孫群等《植物生理學研究技術(shù)》[15]。

1.3.3 總RNA的提取及cDNA的合成 將脅迫0，9 d、復水7 d的新鮮葉片用液氮速凍后，使用寶生物工程有限公司的RNAiso Plus試劑盒提取總RNA，使用寶生物工程有限公司的PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄。

1.3.4 水孔蛋白PIP2-3基因的分離與表達分析 根據(jù)NCBI中登陸的擬南芥、黃瓜、釀酒葡萄的質(zhì)膜水孔蛋白參考基因組中PIP2的保守區(qū)核苷酸序列設(shè)計合成引物[16]，上、下游引物(F：5′-CCATGGCCGCGATCGTCCTG-3′，R：5′-TGATGGTGAGAATCTCGCGG-3′，擴增長度310 bp，Gene ID：818294)。用pMD18-T載體進行鏈接克隆[17-18]，擴增克隆得到PIP2-3基因的中間片段序列，送擎科生物成都合成部進行測序。

根據(jù)測序所得的結(jié)果，運用Primer 5.0進行RT-PCR的引物設(shè)計(G1F：5′-TTATACAGAGCAGTCATC-3′，G1R：5′-CTGAATCTTGTAACCAATG-3′)，以擬南芥Actinβ(101260631)作為內(nèi)參基因(ActinβF：5′-GATGGTGTCAGCCACAC-3′，ActinβR：5′-ATTCCAGCAGCTTCCATTCC-3′)，以ddH2O作為空白對照，以不加模板的cDNA作為陰性對照，采用2-ΔΔCT法計算目的基因的相對表達量[19]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

用Excel 2016對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，用SPSS軟件采用最小顯著差異法(LSD)進行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 干旱脅迫與復水對可溶性糖的影響

可溶性糖可參與細胞的滲透調(diào)節(jié)[20]。研究結(jié)果表明(圖1)，蒲公英在干旱脅迫下，葉片內(nèi)的可溶性糖含量持續(xù)上升，隨著脅迫程度的進一步加重，葉片內(nèi)的可溶性糖含量迅速增加。蒲公英在重度脅迫(SS)下3 d可溶性糖含量顯著上升，在第3，6，9天時葉片內(nèi)的可溶性糖含量比對照CK高75.62%，212.47%，238.88%。輕度脅迫(MS)在3 d以后，葉片內(nèi)的可溶性糖含量才顯著性上升，在第6，9天時葉片內(nèi)的可溶性糖含量比對照CK高124.02%，167.05%。在復水7 d后，輕度脅迫(MS)條件下蒲公英葉片內(nèi)可溶性糖含量恢復正常，重度脅迫(SS)下蒲公英葉片內(nèi)可溶性糖含量雖然顯著下降，但依然比對照CK高79.08%，差異達顯著水平。

圖中不同時間段不同小寫字母表示在P< 0.05水平上差異顯著。圖2-4，6同。 The small-letter of each time means significantly different at the P<0.05 level.The same as Fig.2-4,6.

2.2 干旱脅迫下可溶性蛋白含量的變化

圖2表明，隨著脅迫的程度以及脅迫時間的增加，蒲公英葉片內(nèi)可溶性蛋白的含量(以鮮質(zhì)量計)呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢。其中輕度脅迫(MS)在第9天時，葉片內(nèi)的可溶性蛋白含量達到最大值，與對照CK相比可溶性蛋白含量提高了73.35%。重度脅迫(SS)在第3天時，葉片內(nèi)的可溶性蛋白含量顯著高于CK和輕度脅迫(MS)，在第6天時達到最大值，葉片內(nèi)的可溶性蛋白含量相比CK提高了111.08%，在第9天時葉片內(nèi)的可溶性蛋白含量顯著下降，并顯著低于輕度脅迫(MS)。在復水7 d以后，輕度(MS)和重度脅迫(SS)蒲公英葉片內(nèi)的可溶性蛋白含量仍顯著高于CK 33.83%和84.55%。輕度脅迫(MS)相比于復水前，葉片內(nèi)的可溶性蛋白含量開始顯著降低并接近CK。但重度脅迫(SS)相比于復水前，葉片內(nèi)的可溶性蛋白含量不降反升，這可能是復水7 d以后，植株依然在對重度脅迫(SS)下造成的損傷進行修復。

2.3 干旱脅迫下游離脯氨酸的變化

由圖3可知，隨著脅迫時間增加，蒲公英葉片內(nèi)的游離脯氨酸含量(以鮮質(zhì)量計)迅速增加。在第3天，輕度(MS)和重度脅迫(SS)蒲公英葉片內(nèi)的游離脯氨酸含量比CK高58.56%和71.19%，之后輕度脅迫(MS)蒲公英葉片內(nèi)的游離脯氨酸含量一直增加，在第9天時達到最大值，比對照CK高107%。

重度脅迫(SS)蒲公英葉片內(nèi)的游離脯氨酸含量在第6天時達到最大值，比對照CK高187.76%，在第9天時開始下降。復水7 d以后，輕度(MS)和重度脅迫(SS)蒲公英葉片內(nèi)的游離脯氨酸含量開始顯著下降，但仍顯著于高CK 30.97%和74.02%。

圖2 干旱脅迫與復水對可溶性蛋白含量的影響Fig.2 Effect of drought stress and rewatering on dandelion soluble protein content

圖3 干旱脅迫與復水對脯氨酸含量的影響Fig.3 Effect of drought stress and rewatering on dandelion proline content

2.4 干旱脅迫對SOD、POD、CAT的影響

SOD、POD、CAT屬于抗氧化酶，在維持活性氧自由基的產(chǎn)生與清除系統(tǒng)的平衡中發(fā)揮著重要的作用[21]。研究結(jié)果表明(圖4)，隨著脅迫時間延長以及脅迫程度的加深，蒲公英葉片內(nèi)的SOD、POD、CAT的含量(以鮮質(zhì)量計)基本上呈現(xiàn)出先增高后保持在一個較高水平的現(xiàn)象。其中輕度脅迫(MS)蒲公英葉片內(nèi)SOD含量在第6天顯著高于CK，在第9天達到最大值，比CK高67.86%。重度脅迫(SS)蒲公英葉片內(nèi)SOD的含量在第3天顯著高于CK，在第6天達到最大值，比CK高75.34%，然后一直維持在一個較高的水平。

輕度脅迫下(MS)蒲公英葉片內(nèi)的POD含量上升緩慢，在第9天才顯著高于CK，比CK高35.72%。重度脅迫(SS)蒲公英葉片內(nèi)的POD含量在第3天顯著上升，在第6天達到最大值，比CK高59.8%，在第9天其含量顯著下降，只比CK高15.63%。

輕度(MS)和重度脅迫(SS)下蒲公英葉片內(nèi)的CAT含量在第3天便顯著高于CK，在第6天達到最大值，葉片內(nèi)的CAT含量比CK高20.69%和43.45%，然后一直保持在一個較高的含量。

復水7 d后輕度(MS)和重度脅迫(SS)下蒲公英葉片內(nèi)POD和CAT的含量恢復至正常，輕度脅迫(MS)蒲公英SOD的含量與CK差異不顯著，重度脅迫(SS)蒲公英SOD的含量依然顯著高于CK 43.38%。

2.5 干旱脅迫對蒲公英PIP2-3基因的誘導表達的影響

根據(jù)NCBI中已登錄的擬南芥、黃瓜、釀酒葡萄的質(zhì)膜水孔蛋白參考基因組中PIP2的保守區(qū)核苷酸序列設(shè)計合成引物，以cDNA為模板，成功克隆出了蒲公英質(zhì)膜水孔蛋白PIP2-3。測序結(jié)果表明蒲公英質(zhì)膜水孔蛋白PIP2-3的cDNA全長303 bp，將PIP基因序列在NCBI中進行Blast同源性比對，結(jié)果顯示該序列與已登錄的擬南芥、黃瓜、釀酒葡萄的質(zhì)膜水孔蛋白PIP2-3的同源性為93%，91%，90%(圖5)。說明該cDNA序列片段應(yīng)該是蒲公英質(zhì)膜水孔蛋白PIP2-3基因的保守區(qū)序列。

利用熒光定量PCR技術(shù)，對蒲公英質(zhì)膜水孔蛋白PIP2-3基因在葉片中的相對表達量進行分析。結(jié)果表明(圖6)，在脅迫剛開始以及復水7 d后，蒲公英葉片內(nèi)的質(zhì)膜水孔蛋白基因PIP2-3與對照CK無顯著差異，在脅迫9 d時，輕度(MS)和重度脅迫(SS)蒲公英葉片內(nèi)的質(zhì)膜水孔蛋白基因的相對表達量比對照CK高37.25%和18.35%。這可能是在重度脅迫(SS)條件下對蒲公英造成了較重的損傷，導致了表達量的下降。

圖6 蒲公英PIP2-3基因在干旱脅迫下的表達Fig.6 Dandelion PIP2-3 gene expression under drought stress

3 討論

隨著全球氣候變暖，干旱逆境問題日趨嚴重。干旱、鹽堿及冷害這三大非生物脅迫因素，目前已經(jīng)成為許多作物產(chǎn)量下滑的重要原因[22]，過度的脅迫會導致作物細胞失水，產(chǎn)生水分虧缺，從而對植物的滲透調(diào)節(jié)造成破壞。可溶性糖、可溶性蛋白、游離脯氨酸作為滲透調(diào)節(jié)的小分子物質(zhì)，在維持細胞滲透壓，防止原生質(zhì)過度失水[23]，抵御植物抗逆境生理上發(fā)揮著重要作用。邵艷軍等[24]認為可溶性糖在植物應(yīng)對干旱脅迫時參與滲透調(diào)節(jié)以及復水后生理的修復和恢復過程?？扇苄缘鞍卓梢栽诩毎彼那闆r下起到保水的作用[25]，是植物代謝中蛋白損傷的重要指標，細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的合成、變性以及降解等信息均可尤其反應(yīng)[26]。游離脯氨酸作為一種重要的滲透保護劑，在逆境脅迫條件下均會在植物體內(nèi)大量的積累[27]。試驗研究表明，隨著脅迫時間的延長以及脅迫程度的加重，蒲公英葉片內(nèi)的可溶性糖、可溶性蛋白、游離脯氨酸的含量基本呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，且脅迫程度越嚴重，滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)增加得越快，在植株葉片內(nèi)積累得越多，這與吳敏等[28]研究干旱脅迫對栓皮櫟幼苗細根的結(jié)果一致。在復水7 d后，3種物質(zhì)的含量雖然顯著下降，但在蒲公英葉片內(nèi)的含量依然較高，這可能與植物還在修復脅迫所遭受的損傷有關(guān)。

植物在遭受干旱脅迫時，其體內(nèi)會產(chǎn)生超氧陰離子自由基等活性氧自由基，對植物造成損傷，而SOD、POD、CAT等抗氧化酶，對維持植物體內(nèi)活性氧自由基的產(chǎn)生與清除系統(tǒng)的平衡發(fā)揮著重要的作用[21]。本試驗研究表明，蒲公英在遭受干旱脅迫的過程中SOD、POD、CAT的含量顯著上升，隨著脅迫時間的延長SOD和CAT保持在一個較高的水平。而POD的含量在重度脅迫(SS)下先上升后下降，這可能與活性氧的產(chǎn)生超過了細胞的清除極限，從而導致了酶保護系統(tǒng)活性的降低有關(guān)。復水7 d以后，POD、CAT下降至正常水平，而SOD雖然下降，但其含量仍顯著高于CK，這可能與細胞修復過程中持續(xù)產(chǎn)生的活性氧有關(guān)。

干旱所造成的水分虧缺，可以在植物細胞內(nèi)引發(fā)一系列復雜的響應(yīng)。植物水孔蛋白在水分運輸上發(fā)揮著重要的作用[29]。在干旱脅迫下，不同植物之間水孔蛋白的表達具有一定的差異，其在轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)節(jié)與植物不同的組織部位[30]、生長發(fā)育的不同階段[31]以及環(huán)境因子有關(guān)。有研究表明，在干旱脅迫條件下，煙草的NtPIP1;1和NtPIP2;1的轉(zhuǎn)錄水平顯著降低，而NtAQP1的轉(zhuǎn)錄水平則有一定的升高[32]。而本試驗的研究結(jié)果顯示，在干旱脅迫條件下，蒲公英的質(zhì)膜水孔蛋白PIP2-3基因的相對表達量上調(diào)，且輕度脅迫(MS)要顯著于重度脅迫(SS)，這與煙草的試驗結(jié)果相反。這可能與試驗環(huán)境即蒲公英可能增加質(zhì)膜水孔蛋白PIP2-3基因的相對表達量直接從空氣中吸收水分以彌補水分的虧缺有關(guān)，具體情況還需要進一步研究論證。

綜上所述，在干旱脅迫條件下，蒲公英通過增加葉片內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累(可溶性糖、可溶性蛋白、游離脯氨)，提高酶保護系統(tǒng)的活性，以及上調(diào)質(zhì)膜水孔蛋白PIP2-3基因的相對表達量來提高水分的運輸能力以應(yīng)對干旱脅迫。

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Effects of Drought Stress on Osmoregulation Substances，Enzyme Protection System and Expression of Plasma Membrane Hole Protein GenePIP2-3 inTaraxacummongolicumHand.-Mazz.

WANG Yiming，WANG Hu，LONG Shengju，ZHAO Yingpeng,CHEN Yan,HE Zhongqun

(College of Horticulture，Sichuan Agricultural University，Chengdu 611130,China)

In order to reveal the mechanism of osmotic adjustment and enzyme protection system of dandelion and gene expression characteristics of plasma membrane aquaporinPIP2-3 under drought stress.Using pot water control experiments to study the effects of soil drought stress(RWC=(90±5)%，RWC=(75±5)%，RWC=(50±5)% on osmoregulation substances，enzyme protection system and expression of plasma membrane hole protein genePIP2-3 inTaraxacummongolicumHand.-Mazz.. Important findings：Under soil drought stress could significantly increase the dandelion leaf blade soluble sugar，soluble protein and free proline content，enhance the activity of SOD，POD and CAT，light stress show a tendency of gradually rising while severe stress showed a trend of first increase after decrease (except blade soluble sugar). Expression of plasma membrane hole protein genePIP2-3 relative quantity increased significantly，and mild stress (MS) was higher than severe stress (SS). After restore water 7 d，the accumulation of osmotic regulation substances and the content of SOD decreased,but still significant in CK.The content of POD，CAT and plasma membrane hole protein genePIP2-3 back to normal. This means that under drought stress，the dandelion can increase the accumulation of osmotic regulation substances and enhance the protective enzyme systems activities to improve plant resistance，increase plasma membrane hole relative expression of protein gene to strengthen water transport capacity.

Dandelion；Drought stress；Osmoregulation substances；Enzyme protection system；Plasma membrane hole protein

2017-05-26

四川省教育廳項目(10ZB044)

王一鳴(1992-)，男，四川綿陽人，在讀碩士，主要從事生物技術(shù)與遺傳育種研究。

賀忠群(1971-)，女，重慶開縣人，教授，博士，主要從事蔬菜逆境生理及生物改良研究。

S647.03

A

1000-7091(2017)04-0085-06

10.7668/hbnxb.2017.04.014