張 紅，張 斌，聞鳳英，劉曉暉，王超楠，李 梅，黃志銀

(天津科潤蔬菜研究所，蔬菜種質(zhì)創(chuàng)新國家重點實驗室，天津市蔬菜遺傳育種企業(yè)重點實驗室，天津 300384)

大白菜根腫病的遺傳規(guī)律及抗病基因定位研究

張 紅，張 斌，聞鳳英，劉曉暉，王超楠，李 梅，黃志銀

(天津科潤蔬菜研究所，蔬菜種質(zhì)創(chuàng)新國家重點實驗室，天津市蔬菜遺傳育種企業(yè)重點實驗室，天津 300384)

為探究根腫病抗病遺傳規(guī)律，采用根腫病抗性差異的材料G57和G70，構建了包含500個單株的F2分離群體。通過對父母本、F1及F2分離群體的人工接種表型鑒定結果進行統(tǒng)計分析，結果發(fā)現(xiàn)，材料中的根腫病抗性由顯性單基因控制。為進一步定位試驗材料中的抗病基因，利用678個分子標記對雙親、F1及F2群體進行了篩選驗證，初步將抗病基因定位在分子標記KBRH129J18和TCR02-F。并基于2個連鎖標記，開發(fā)設計了更緊密連鎖的分子標記，最終獲得與抗病基因連鎖的5對SSR分子標記，分別為Bra0345-1、Bra0235-2、Bra0235-1、Bra19317、Bra019392。其與抗病基因的遺傳距離依次為2.4，2.4，2.4，2.5，3.3 cM。開發(fā)設計的多態(tài)性標記經(jīng)驗證在大白菜中具有較好的適用性。

大白菜；根腫病；抗病遺傳規(guī)律；抗病基因；分子標記

根腫病是由蕓薹根腫菌(PlasmodiophorabrassicaeWoron) 侵染引起的一種世界性病害[1-2]，主要危害大白菜等十字花科蔬菜，最常見的病癥是在受侵染根部形成明顯的腫瘤。該病最初在 1737 年英國地中海西岸和歐洲南部發(fā)現(xiàn)，隨后在世界各地十字花科蔬菜種植區(qū)蔓延。感病植物根部釋放的休眠孢子在土壤中可存活長達 20 年，且發(fā)病初期地上部分癥狀不明顯，不易檢測，很難根治，又有“根癌”之稱，已成為世界性難題。

近年來，針對根腫病害防治的手段主要為農(nóng)藝防治、生物防治、化學防治及抗病育種等。研究者們從環(huán)保、經(jīng)濟等方面考慮，通過不斷實踐發(fā)現(xiàn)進行抗病品種的育種是目前防治該病害最理想的方法[3]。隨著現(xiàn)代分子技術的不斷發(fā)展，在育種工作中利用分子標記技術定位抗病基因來輔助選擇育種的優(yōu)勢日益凸顯。目前，研究者們利用分子技術定位的大白菜抗根腫病基因已有8個，分別是Crr1、Crr2、Crr3、Crr4、CRa、CRb、CRc和CRk[4-11]，其中Crr1定位于A8連鎖群，Crr2定位于A1連鎖群，Crr4定位于A6連鎖群，CRc定位于A2連鎖群，Crr3、CRa、CRb、CRk定位于A3連鎖群。Saito等[12]通過與擬南芥的比較精細定位了Crr3基因，且證明Crr3與CRb不是同一位點。Diederichsen等[13]提出CRa與CRb可能是等位基因或緊密連鎖的2個抗病基因位點，Crr3與CRk可能也是等位基因或緊密連鎖的2個抗病基因位點。隨著分子技術的發(fā)展，近年來逐漸開發(fā)設計的一些與大白菜抗根腫病緊密連鎖的分子標記數(shù)量仍然有限，在一定程度上限制了分子標記輔助育種，同時研究者們由于所用材料的差異及抗病基因的不同，所開發(fā)的標記通用性不強，難以滿足育種實踐的需要。因此，針對性的開發(fā)與大白菜抗根腫病基因緊密連鎖的分子標記，采用分子標記輔助選擇將對培育出優(yōu)質(zhì)大白菜抗根腫病品種有著極大的幫助。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試菌株為采自云南省昆明市嵩明縣的大白菜根腫病發(fā)病腫根。遺傳規(guī)律研究及基因定位試驗中的材料，主要由天津科潤蔬菜研究所提供，包括根腫病極抗材料G57、極感材料G70及雜交獲得的F1，利用F1自交構建了包含500個單株的F2分離群體。分子標記的適用性驗證試驗中使用的材料共計54份。包括16份商業(yè)品種及38份由含抗病基因F1小孢子培養(yǎng)得到的DH系。

所有供試材料均播種于天津科潤蔬菜研究所的溫室內(nèi)，待幼苗長到 5～6 片真葉時取樣，并保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

分子標記引物來源：共計678個分子標記引物，包括14個與大白菜根腫病抗病基因連鎖的分子標記引物[14]，王艷[15]構建的大白菜遺傳圖譜中的415個InDel和92個SSR引物標記，來自大白菜基因組的144個SSR引物標記，根據(jù)Brassica Database(http：//brassicadb.org)的數(shù)據(jù)，分析序列信息，設計合成13個SSR分子標記。以上引物均由南京金斯瑞有限公司合成。

1.2 試驗方法

1.2.1 根腫病人工接種鑒定方法 接種鑒定試驗在天津科潤蔬菜所溫室進行。按比例將制備好的休眠孢子液和無菌土混合，使菌土孢子含量達到108個/g，將pH值調(diào)至6.5，含水量控制在60%左右，然后將配好的菌土置入裝滿滅菌營養(yǎng)土的育苗穴盤中，把試驗材料種子播于穴盤菌土內(nèi)，其中抗感親本、F1各25株，F(xiàn)1自交構建的F2群體500株，少量蛭石覆蓋。苗盤置于溫室，25 ℃下生長，避免陽光長時間直曬，苗盤下保持1 cm水層，30 d后調(diào)查發(fā)病情況。

1.2.2 大白菜DNA的提取及檢測采集 親本、F1及F2材料的嫩葉，參照文獻[16-17]的CTAB法進行改良提取大白菜DNA，提取得到的大白菜基因組DNA的質(zhì)量利用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。再取1 μL DNA溶液在分光光度計上測定其濃度和純度，其中DNA的OD260/280值需保持介于1.8～2.0。最后用蒸餾水將DNA原液稀釋到50 ng/μL，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 多態(tài)性標記的篩選 產(chǎn)物擴增采用20 μL的PCR標準反應體系進行。具體PCR反應體系如表1所示。

表1 大白菜PCR標準反應體系Tab.1 Standard PCR reaction system of Chinese cabbage

PCR擴增后產(chǎn)物采用 8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分離，將具有多態(tài)性的標記使用快速銀染法[18]進行檢測。

1.2.4 分子標記的開發(fā)及抗病基因的定位 利用Join Map 4.0軟件，統(tǒng)計F2單株的電泳擴增條帶并構建遺傳連鎖圖，同時結合大白菜數(shù)據(jù)庫(http://brassicadb.org/brad/)的信息，利用Primer 5.0軟件在抗病基因附近設計新的分子標記，進一步逼近抗病基因。

分子連鎖圖譜的構建采用了JoinMap 4.0軟件，操作如下：

創(chuàng)建新文件夾：點擊“New Project”命令；②數(shù)據(jù)錄入：根據(jù)親本的帶型來確定多態(tài)性條帶，與感病親本帶型相同的條帶記為“a”，與抗病親本帶型條帶相同的記為“b”，雜合帶型記為“h”，由于其他原因造成的條帶不清或缺失的賦值“-”。點擊“Load data”命令導入分子標記的條帶數(shù)據(jù)，選擇“Individual genotfreq”選項排除缺失數(shù)據(jù)過多的單株；③數(shù)據(jù)分析：點擊“Calculate”分析分子標記的偏分離情況，設置LOD=3，并選擇“Group”進行分組，最后點擊“Map”命令構建遺傳連鎖圖，采用Kosambi函數(shù)進行圖距計算。

1.2.5 分子標記的適用性驗證 利用開發(fā)設計的分子標記擴增16份商業(yè)品種及38份DH系材料，記錄電泳條帶，將與感病親本相同的電泳帶型標記為a，與抗病親本相同的電泳帶型標記為b，雜合帶型標記為h。最后進行田間鑒定及分子試驗結果統(tǒng)計。

2 結果與分析

2.1 大白菜根腫病人工接種鑒定結果與遺傳學分析

依據(jù)整理的病情分級標準[19]，對高抗病親本材料G57、高感病親本材料G70、F1以及由F1自交構建的包含500個單株的 F2分離群體進行人工接種的表型鑒定(圖1，2)，結果發(fā)現(xiàn)：25株G57均表現(xiàn)抗病、25株G70均表現(xiàn)為感病、25株F1均表現(xiàn)不同程度的抗病、500株F2群體中抗性發(fā)生分離，其中含抗病單株367株和感病單株133株(表2)。經(jīng)卡方檢測，χ2=P>0.05=0.68，抗感病表型符合3∶1的分離比，遵循孟德爾遺傳定律，說明該材料中抗病性受顯性單基因控制。

從左至右，依次為感病親本G70，抗病親本G57，F(xiàn)1。 From left to right，followed by the susceptible parent G70，resistant parent G57,F1.

從左至右，依次為F2分離群的401～410單株。From left to right，followed by F2 isolates of 401-410 plants.

材料編號Materialnumber病情分級Diseaseclassification0級0level1級1level3級3level5級5level7級7level總株數(shù)Totalnumber抗病∶感病實際比值Actualratio抗病∶感病理論比值Theoryratioχ2檢驗χ2inspectionG572500002525∶01∶0-G70000223250∶250∶1-F11870002525∶0--F2244123683233500367∶1333∶10.68

2.2 樣品DNA質(zhì)量的檢測

結果如圖3所示：樣品DNA條帶分明，無明顯的彌散現(xiàn)象，無RNA和多糖污染，符合后續(xù)試驗對DNA模板的要求。

M.Marker；1～5.F2群體不同單株。 M.Marker;1-5.Different segregation of F2 lines.

樣品DNA濃度曲線標準且OD260/280均為1.8～2.0，樣品DNA質(zhì)量合格，PCR過程樣品DNA濃度需稀釋至50 ng/μL。

2.3 多態(tài)性分子標記的篩選結果

本研究利用抗感親本及F1對與根腫病抗性基因緊密連鎖的14對分子標記、均勻分布在10條染色體上的236對SSR標記及415對InDel標記進行多態(tài)性篩選，如圖4中箭頭所指為多態(tài)性分子標記的引物擴增條帶，經(jīng)篩選得到均勻分布在10條染色體上的62對表現(xiàn)多態(tài)性、重復性好的分子標記。

為避免BSA法易出現(xiàn)的假陽性問題，本研究在F2分離群體中選取24株極抗單株和24株極感單株組成48株極端表型群體，將獲得的62個多態(tài)性標記在48個單株中進行驗證，得到7個連鎖標記(圖5)，分別為BRID90039、BRID90430、BRID10401、B4732、KB59N03、TCR74、KBRH129J18。7對分子標記主要位于A03染色體上且部分為已報道的CRb基因的連鎖分子標記，初步推斷試驗所選材料含CRb基因。

圖4 父母本、F1間多態(tài)性分子標記的篩選Fig.4 Screening of polymorphic markers between the parents and F1

前面的泳道表示F2群體中選出的24株感病單株;后面的泳道表示24株抗病單株。 Lane said in front of F2 population selected 24 strains infected individual;24 strains representing behind resistance per plant.

進一步深入檢索文獻，查找與CRb相連鎖的分子標記，經(jīng)過多態(tài)性篩選及在48株極端表型群體中進行驗證，又得到連鎖標記5對。為降低人工接種鑒定表型統(tǒng)計的誤差，將F2群體中抗病性為1級和3級的單株剔除，只保留極端抗病和極端感病的309株組成新的F2群體，將之前獲得的12對連鎖標記在309株F2群體中進一步驗證，并應用JoinMap 4.0軟件構建遺傳連鎖圖(圖6)，CR基因的兩側翼標記為KBRH129J18和TCR02_F。

圖6 多態(tài)性引物構建的遺傳圖譜Fig.6 Genetic map construction with polymorphism primers

2.4 新抗根腫病分子標記的開發(fā)及抗病基因的定位

通過篩選與抗病基因相連鎖的分子標記，初步定位了抗病基因的位置，在此基礎上利用大白菜數(shù)據(jù)庫(http://brassicadb.org/brad/)的基因組信息，搜索到兩側翼分子標記區(qū)域內(nèi)的SSR序列及該區(qū)域內(nèi)的基因注釋信息，采用Primer 5.0軟件在初定位的抗病基因附近設計了13對SSR分子標記引物(表3)。

表3 SSR分子標記引物Tab.3 SSR molecular marker primers

將新設計的13個SSR標記在親本及48株極端表型群體中進行初步篩選驗證，獲得與抗病基因連鎖的5對SSR分子標記，分別為Bra0345-1、Bra0235-2、Bra0235-1、Bra19317、Bra019392。進一步在309株F2分離群體中進行驗證，利用JoinMap 4.0軟件繪制遺傳連鎖圖。結果顯示，在遺傳連鎖圖中5對分子標記與抗病基因的遺傳距離依次為2.4，2.4，2.4，2.5，3.3 cM(圖7)。經(jīng)Brassica Database(http://brassicadb.org/brad/)信息查詢抗病基因CR兩側翼分子標記在大白菜基因組中的物理位置，將抗病基因初步定位到物理距離為24.75～24.81 Mb的區(qū)域內(nèi)。

圖7 新設計的多態(tài)性引物構建的遺傳圖譜Fig.7 Genetic map construction with the new design of polymorphism primers

2.5 分子標記的適用性分析

為驗證與抗病基因緊密連鎖的標記Bra0235-2和Bra19317在白菜中的適用性。利用兩分子標記擴增了相應材料的DNA，結果如圖8，9，所有DH系的電泳條帶類型與表型均一致，抗病株系與抗病親本G57一致，感病株系與感病親本G70條帶一致，說明新開發(fā)的分子標記對本試驗所用抗病基因有很好的適用性，可用于后續(xù)分子標記輔助選擇育種。在16份商業(yè)品種中有10份表型和電泳條帶類型一致(表4)，而本試驗編號為C42、C47、C48、C49、C51和C52的抗根腫病商業(yè)品種的表型與分子標記的帶型不同，推測這6個商業(yè)品種所含抗病基因與本試驗所用材料的抗病基因不同。

圖8 分子標記 Bra0235-2在部分DH系中的銀染結果Fig.8 Silver stain result of molecular markers Bra0235-2 in the part of the DH system

圖9 分子標記 Bra0235-2在部分商業(yè)品種中的銀染結果Fig.9 Silver stain result of molecular markers Bra0235-2 in the part of the commodity

試驗編號Testnumber名稱Name來源Source表型PhenotypicBra0235-2Bra193171DH系Rbb2DH系Rbb3DH系Rbb4DH系Rbb5DH系Rbb6DH系Rbb7DH系Rbb8DH系Rbb9DH系Rbb10DH系Rbb11DH系Rbb12DH系Rbb13DH系Rbb14DH系Rbb

表4(續(xù))

注：a.與感病親本相同的電泳帶型;b.與抗病親本相同的電泳帶型;h.雜合帶型。

Note：a.The same as the infected parent type electrophoresis;b.Hybrid type the same as the infected parents electrophoresis;h.Hybrid type.

3 結論與討論

3.1 關于大白菜人工接種鑒定及遺傳學分析

本試驗對抗病親本、感病親本、F1及F2群體進行人工接種抗性鑒定，經(jīng)數(shù)據(jù)統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，本試驗中根腫病抗性受顯性單基因控制，這與趙卓[20]的研究相符。但不同試驗材料中大白菜的抗根腫病的遺傳規(guī)律不同。也有部分試驗研究顯示根腫病的抗性呈數(shù)量遺傳，受多基因控制。

國內(nèi)外人工接種抗病鑒定的方法主要是對材料發(fā)病表型進行人為分級，分級標準不一，目前，人工接種鑒定過程也主要依靠目測，大量的材料鑒定極容易受到主觀因素的影響而產(chǎn)生視覺誤差。根腫病的接種條件對發(fā)病結果也存在很大影響，而在試驗過程很難保證接種條件的一致性，導致根腫病的抗性鑒定結果難免存在一些偏差。今后根腫病的接種鑒定方法仍需完善。

3.2 關于大白菜抗病基因的定位

本研究利用309個單株構建的F2分離群體，開發(fā)了5個與抗根腫病基因連鎖的分子標記，分別為Bra0345-1、Bra0235-2、Bra0235-1、Bra19317、Bra019392。它們與抗病基因的遺傳距離依次為2.4，2.4，2.4，2.5，3.3 cM。最終驗證分子標記在大白菜中的適用性較強，可應用于MAS育種中。

選擇適宜規(guī)模的群體，是基因定位的基礎。通常粗定位對群體規(guī)模要求不高，達到200株左右即可；但精細定位則需要較大群體，常常需要達到上千株，有的甚至上萬。本研究選取500個單株構建的F2群體，對于基因精細定位，所建群體仍然過小。因此，要實現(xiàn)對基因的更精細的定位還需要加大群體的規(guī)模。為盡量降低表型鑒定過程中人工分級帶來的誤差，僅在構建圖譜時從500個單株的群體中剔除了共計191株1級和3級病情的單株，在一定程度上對于基因定位的準確度和精細度造成了影響。

對于尚無連鎖圖或連鎖圖飽和程度較低的植物，利用BSA法是快速獲得與目標基因連鎖的分子標記的有效方法。但假陽性現(xiàn)象即非連鎖的標記在兩池內(nèi)出現(xiàn)多態(tài)性條帶是BSA法的一大障礙，這種現(xiàn)象雖然可以通過增加混池單株數(shù)來降低，但卻不能完全消除。因此，本試驗直接選擇48株F2群體內(nèi)的極端表型單株對分子標記進行篩選驗證，有效地避免了BSA法的假陽性問題，而且相對于大群體的篩選驗證，工作量更小，效率更高。

本試驗通過父母本、F1及48株極端表型單株對678對分子標記進行篩選驗證，獲得7對與抗根腫病基因連鎖的分子標記，它們主要位于A03染色體上且部分為已報道過的CRb基因的連鎖分子標記，因此，本試驗所選材料所含抗根腫病基因有可能是CRb基因。趙卓[20]利用3個共顯性標記TCR01、TCR05及新開發(fā)的cnu_m413對大白菜抗根腫病基因CRb進行初步定位，并通過繪制抗根腫基因的物理圖譜，最終用兩側翼標記TCR79和TCR108將CRb定位于大白菜A03連鎖群23.6～23.7 Mb的位置。日本學者Kato等[21]則以CRShinki F1作為基因抗源材料并構建F2群體，通過SSR標記和InDel標記，最終將CRb基因定位到位于大白菜A03連鎖群的24.2～24.3 Mb的位置上。本研究中初步定位的CR基因的位置為24.75～24.81 Mb，更接近于Kato等[21]的定位結果。

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Chinese Cabbage Root Disease Genetic Law and Positioning of Resistance Genes Research

ZHANG Hong，ZHANG Bin，WEN Fengying,LIU Xiaohui,WANG Chaonan，LI Mei，HUANG Zhiyin

(Tianjin Kernel Vegetable Research Institute，State Key Laboratory of Vegetable Germplasm Innovation,Tianjin Vegetable Genetics and Breeding Enterprise Key Laboratory,Tianjin 300384,China)

To explore the root disease resistance genetic regularity，by root disease resistance difference material，G57 and G70，the F2segregation population containing 500 per plant was built.Through artificial inoculation of the parents，F(xiàn)1and F2segregation population phenotypic characterization results were statistically analyzed. The results showed that root disease resistance of materials was controlled by a single dominant gene. In order to further localization of resistance genes in test materials，we used 678 molecular markers of parents，F(xiàn)1and F2population screening verification，resistance genes was preliminarily located in molecular marker KBRH129J18 and TCR02-F.This test was based on two chain tags，chain development design closer chain of molecular markers，ultimately with resistance genes chain 5 of SSR molecular markers,respectively，Bra0345-1，Bra0235-2，Bra0235-1，Bra19317，Bra019392. Their genetic distance with resistance genes were 2.4，2.4，2.4，2.5，3.3 cM.Validated，development and design of polymorphism markers in Chinese cabbage had good applicability.

Chinese cabbage；Root disease；Disease resistance genetic law；Resistance genes；Molecular markers

2017-07-12

國家重點研發(fā)計劃項目(2016YFD0101701)；國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系項目(CARS-25-G-02)；天津市自然科學基金項目(16JCYBJC29300)；天津市科技創(chuàng)新體系及平臺建設計劃項目(16PTSYJC00260)；農(nóng)業(yè)部“農(nóng)業(yè)科研杰出人才培養(yǎng)計劃”項目

張 紅(1990-)，女，天津武清人，研究實習員，碩士，主要從事大白菜分子育種研究。

張 斌(1965-)，男，遼寧本溪人，研究實習員，研究員，博士，主要從事十字花科蔬菜育種研究。

S634.1

A

1000-7091(2017)04-0060-07

10.7668/hbnxb.2017.04.010