張安紅，王志安，肖娟麗，羅曉麗

(1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 棉花研究所，山西 運城 044000；2. 棉花種質(zhì)資源利用與分子設(shè)計育種山西省重點實驗室，山西 運城 044000)

轉(zhuǎn)GHABF4轉(zhuǎn)錄因子棉花植株的耐鹽性研究

張安紅1,2，王志安1，肖娟麗1，羅曉麗1,2

(1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 棉花研究所，山西 運城 044000；2. 棉花種質(zhì)資源利用與分子設(shè)計育種山西省重點實驗室，山西 運城 044000)

AREB/ABFs轉(zhuǎn)錄因子家族基因主要參與干旱、高鹽、低溫等脅迫應(yīng)答反應(yīng)。為了獲得具有較高耐鹽水平的棉花新種質(zhì)材料，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將耐鹽轉(zhuǎn)錄因子基因(GHABF4 )導(dǎo)入陸地棉中棉35中，通過對轉(zhuǎn)化植株的卡那霉素初步篩選及T1、T2、T3目的基因 PCR的分子檢測，獲得T3轉(zhuǎn)基因棉花純合系。通過鹽脅迫試驗對5個T3轉(zhuǎn)基因棉花株系和非轉(zhuǎn)基因棉花對照進(jìn)行耐鹽性分析。結(jié)果表明，在200 mmol/L NaCl脅迫下，與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ障啾龋?個轉(zhuǎn)基因棉花株系株高提高2.5～4.4 cm，地上部分的鮮質(zhì)量增加3.6%～11.8%；且抗氧化物酶SOD、POD、CAT活性以及葉綠素含量提高。在鹽脅迫條件下，轉(zhuǎn)GHABF4基因棉花表現(xiàn)出優(yōu)良的生長和生理優(yōu)勢，轉(zhuǎn)GHABF4基因能夠提高棉花的抗鹽能力。

棉花；GHABF4轉(zhuǎn)錄因子；轉(zhuǎn)基因棉花；耐鹽性

土壤鹽漬化嚴(yán)重影響植物了的生長發(fā)育，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上經(jīng)常造成農(nóng)作物大幅度減產(chǎn)[1]。因此，如何提高作物的耐鹽性、增加鹽脅迫下作物的產(chǎn)量，是人們關(guān)注的焦點。棉花是我國重要的經(jīng)濟(jì)作物，其主要種植在西北內(nèi)陸、黃河流域和長江流域，形成三大主產(chǎn)棉區(qū)。棉花雖然是耐鹽性較強的作物之一，但是棉花的常規(guī)品種耐鹽能力只有0.3%左右，其耐鹽能力仍然有限。土壤中過多的鹽離子會對棉花產(chǎn)生離子毒害和滲透脅迫[2]。因此，進(jìn)一步提高棉花耐鹽能力是鹽堿地能廣泛種植棉花、擴大棉花種植面積的前提條件。為了較快獲得品質(zhì)優(yōu)良的抗逆棉花品系，育種工作者通過基因工程手段對棉花進(jìn)行了性狀改良，以期能夠提高棉花的抗逆能力。

轉(zhuǎn)錄因子是植物中廣泛存在的一類與植物脅迫應(yīng)答相關(guān)的基因，在調(diào)控植物應(yīng)答非生物脅迫的過程中起著非常重要的作用。當(dāng)植物受到外界高鹽、干旱等刺激時，其體內(nèi)會發(fā)出一系列脅迫應(yīng)答信號，激發(fā)轉(zhuǎn)錄因子活性，響應(yīng)脅迫調(diào)控。堿性亮氨酸拉鏈(Basic leucine zipper，bZIP)蛋白是真核生物轉(zhuǎn)錄因子中分布最廣、最保守的一類蛋白，它參與植物對脫落酸、光和發(fā)育中各種信號的反應(yīng)，在植物抵御逆境脅迫過程中起著非常重要的作用[3]。AREB/ABFs轉(zhuǎn)錄因子屬于堿性亮氨酸拉鏈類蛋白中的A亞族。目前，AREB/ABFs類轉(zhuǎn)錄因子在擬南芥、煙草、小麥、大麥、花生、玉米、馬鈴薯等作物中均有報道，且已經(jīng)從多種植物中克隆出AREB/ABFs類轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)基因，并且成功導(dǎo)入棉花、煙草等植物中，從而獲得具有抗旱耐鹽能力的轉(zhuǎn)基因植物新品系[4]。

為了提高棉花自身抗逆境能力，獲得耐鹽棉花新品系，山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所生物技術(shù)研究課題組從陸地棉中克隆了耐鹽轉(zhuǎn)錄因子基因GHABF4，并構(gòu)建成了植物表達(dá)載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)入陸地棉品種中棉35，獲得了一定數(shù)量的轉(zhuǎn)基因棉花株系，通過對5個轉(zhuǎn)基因棉花株系(L1、L2、L3、L4、L5)和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ者M(jìn)行NaCl脅迫處理，研究處理后轉(zhuǎn)基因棉花株系與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ盏闹旮摺⒌厣喜糠值孽r質(zhì)量、抗氧化物酶SOD、POD、CAT活性以及葉綠素含量的變化，旨在為進(jìn)一步培育出耐鹽棉花育種新材料奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 植物材料、菌株、載體 轉(zhuǎn)基因棉花的受體材料是陸地棉品種中棉35；大腸桿菌(Escherichiacoli)菌株為DH5α，根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌株為LBA4404；抗性篩選劑為利福平(Rif)，克隆載體為pGEM Teasy，表達(dá)載體為pBin438；抗性標(biāo)記為卡那霉素(Kn+)，以上菌株和載體均由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所生物技術(shù)實驗室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基 基本培養(yǎng)基MSB：MS 無機鹽，B5維生素，2×3.8 g/L KNO3，3%的葡萄糖，2.5 g/L的植物凝膠，pH值5.8。無菌苗培養(yǎng)基 MS0為1/2 MSB。共培養(yǎng)培養(yǎng)基MSB1：MSB+0.1 mg/L KT+0.1 mg/L 2,4-D。愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基MSB2：MSB+0.1 mg/L KT+0.1 mg/L 2,4-D+50 mg/L卡那霉素+500 mg/L頭孢菌素。愈傷組織增殖培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基MSB。分化培養(yǎng)基MSB3：MSB(去除NH4NO3)+1.0 g/L 谷胺酰氨(Asn)+2.0 g/L天門冬酰氨(Gln)，pH值 6.2，該培養(yǎng)基用于體細(xì)胞胚成熟和萌發(fā)及植株再生。LB液體培養(yǎng)基：酵母提取物(5 g/L)+胰蛋白胨(10 g/L)+NaCl(10 g/L)。

具體配置方法參見羅曉麗等[5]的方法進(jìn)行。

1.2 試驗方法

1.2.1 組培法棉花遺傳轉(zhuǎn)化 將經(jīng)硫酸脫絨的陸地棉中棉35的種子用70%的乙醇表面消毒1 min后，用10%的過氧化氫浸泡3～4 h，再用無菌水沖洗3～4 次，浸泡于無菌水中至種子露白。在無菌條件下，將種子種于MS0 固體培養(yǎng)基上；5 d后，取其幼苗下胚軸作為外植體進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化試驗；挑取含有目的基因和卡那抗性篩選基因的農(nóng)桿菌LBA4404 單菌落，接種于含有卡那霉素(50 mg/L)和利福平(25 mg/L)的LB 液體培養(yǎng)基中，28 ℃ 過夜培養(yǎng)，至對數(shù)生長期，200 r/min對菌液進(jìn)行離心，棄上清。用LB 液體培養(yǎng)基重懸菌體至菌液OD600≈0.3，以此作為浸染液。將下胚軸切成約1 cm 小段，浸于農(nóng)桿菌菌液5～10 min，期間輕輕搖晃培養(yǎng)皿使菌液充分被吸收。之后用無菌濾紙吸干下胚軸殘余的菌液，將下胚軸切段置入共培養(yǎng)培養(yǎng)基MSB1中48 h后，置入愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基MSB2中，15 d左右可見有少量的愈傷組織，大約30～60 d可形成直徑為10 mm左右大小的愈傷組織塊，將其作為試驗材料。每隔30 d換一次相同培養(yǎng)基MSB2。待長出愈傷后轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基MSB繼代培養(yǎng)3～5 次，至愈傷長成小米粒狀時，將其挑出轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基MSB3中，愈傷分化成胚狀體再長成幼苗需要90～120 d，期間每隔30 d更換一次MSB3培養(yǎng)基。對組培瓶里的幼苗進(jìn)行卡那霉素初篩和PCR分子檢測，將陽性幼苗通過嫁接方式移栽至溫室。

1.2.2轉(zhuǎn)化棉苗的卡那霉素涂抹篩選 將T0植株收獲種子后種植于網(wǎng)室，每株收獲種子后種植一行，進(jìn)行卡那霉素抗性篩選，先采用2 000 mg/kg卡那霉素溶液均勻涂抹在3～5 片真葉棉花幼苗的幼葉正面，5～7 d 后觀察被涂抹葉片變色情況，淘汰葉片變黃的植株。30 d后，卡那霉素篩選增加到3 000 mg/kg，分別對非轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)化棉株葉片進(jìn)行第2 次卡那霉素抗性檢測，淘汰棉花葉片變黃的植株。

1.2.3 基因組DNA提取及PCR檢測目的基因 挑選經(jīng)卡那霉素 2 次篩選鑒定均呈抗性的轉(zhuǎn)化棉株新鮮葉片作為材料，利用改良的CTAB 法提取基因組DNA；以此DNA 為模板，并根據(jù)GHABF4的基因序列設(shè)計引物ABF4-F：5′-GAAGATCTATGGGGTCTAATCTGAATTTC-3′，ABF4-R：5′-ACGCGTCGACCTACCAAGGGCCTGTCAG-3′進(jìn)行PCR擴增。PCR 反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性 3 min；94 ℃變性 30 s，58 ℃退火 30 s，72℃延伸90 s，35 個循環(huán)；最后 72℃延伸 10 min。1.0 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.4 鹽脅迫對棉花幼苗的影響 轉(zhuǎn)基因棉花T3的 5個株系分別種植在含有蛭石的花盆中，以非轉(zhuǎn)基因棉花中棉35為對照，當(dāng)棉花長出3片真葉時，開始進(jìn)行鹽脅迫處理，剛開始用50 mmol/L的NaCl溶液澆灌植株(設(shè)置清水對照)，5 d 后逐步提高到200 mmol/L濃度進(jìn)行澆灌，每5 d 澆一次溶液，連澆3 次；第3次澆灌后的第5天取棉花新鮮葉片測定相關(guān)指標(biāo)，并觀察植株的生長情況，統(tǒng)計棉花植株的株高和地上部分的單株鮮質(zhì)量。每個處理 10 株，重復(fù) 3 次。1.2.5 轉(zhuǎn)基因植株的生理生化分析參照鄒琪[6]的植物生理學(xué)實驗指導(dǎo)進(jìn)行指標(biāo)分析。其中，超氧化物歧化酶(SOD)活性測定采用NBT 光化還原法；過氧化氫酶(CAT)活性的測定采用高錳酸鉀滴定法；非特異性過氧化物酶(POD)活性采用愈創(chuàng)木酚顯色法，葉綠素含量的測定采用乙醇丙酮法[7]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)基因棉株卡那霉素(Kn+)的抗性鑒定與篩選

由于目標(biāo)基因構(gòu)建時帶有NPT-Ⅱ標(biāo)記基因，因此，轉(zhuǎn)化植株和非轉(zhuǎn)化植株用卡那霉素涂抹幼苗，以葉片反應(yīng)情況來進(jìn)行初步篩選。用2 000 mg/kg 濃度卡那霉素溶液涂抹棉苗的幼葉，進(jìn)行第一次篩選，圖1顯示了7 d后轉(zhuǎn)化植株和非轉(zhuǎn)化植株的葉片反應(yīng)情況。30 d后，用3 000 mg/kg濃度的卡那霉素進(jìn)行再次鑒定。

圖1 T1植株卡那霉素篩選Fig.1 Kanamycin resistance screening in T1

2.2 PCR 分析

挑選經(jīng)卡那霉素 2 次篩選鑒定均呈抗性的轉(zhuǎn)化棉株的新鮮葉片作為材料，以非轉(zhuǎn)基因材料為對照進(jìn)行目的基因檢測。通過 PCR 擴增，結(jié)果表明，GHABF4 基因已經(jīng)被整合到轉(zhuǎn)化植株的基因組中(圖2)。經(jīng)過卡那霉素和PCR分子檢測，獲得T3轉(zhuǎn)基因棉花純合系。

-. 陰性對照；M. DL2000 Marker；P. 質(zhì)粒；1～8. 轉(zhuǎn)化植株。 -. Negative control；M. DL2000 Marker；P. Plasmid；1-8. Transgenic plants.

2.3 轉(zhuǎn)基因純合系的耐鹽分析

轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性檢測結(jié)果顯示，200 mmol/L NaCl脅迫下，轉(zhuǎn)GHABF4基因棉花株系的生長表型比非轉(zhuǎn)基因?qū)φ臻L勢強，株高比對照提高2.5～4.4 cm，地上部分的鮮質(zhì)量比對照增加3.6%～11.8%，非轉(zhuǎn)基因棉花葉片有少許脫落，說明GhABF4 基因的導(dǎo)入提高了棉花植株對鹽堿的抗性(圖3，4 )。

圖3 NaCl脅迫下轉(zhuǎn)基因棉花與對照株高比較Fig.3 Comparison of transgenic cotton and control plants under NaCl stress

圖4 NaCl脅迫下轉(zhuǎn)基因棉花與對照植株鮮質(zhì)量比較Fig.4 Comparison of fresh weight between transgenic cotton and control plants under NaCl stress

2.4 轉(zhuǎn)基因棉花的生理生化分析

2.4.1 NaCl脅迫對轉(zhuǎn)基因和對照棉花體內(nèi)抗氧化酶活性的影響 植物在受到鹽脅迫時，植物體內(nèi)活性氧代謝加強，SOD 可協(xié)同其他相關(guān)酶如CAT、POD等共同防御活性氧和過氧化物自由基對細(xì)胞膜的傷害，其活性與植物的代謝強度及抗逆能力密切相關(guān)。因此，本研究通過測定 SOD、CAT和POD 活性大小來推斷棉花受脅迫傷害程度[8-9]。轉(zhuǎn)基因棉花的酶活性結(jié)果顯示，在棉花植株沒有受到脅迫之前，轉(zhuǎn)基因植株和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ盏腟OD、CAT、POD之間并沒有太大的差異；而在200 mmol/L NaCl脅迫下，轉(zhuǎn)基因植株的SOD、CAT和POD活性明顯高于非轉(zhuǎn)基因?qū)φ眨渲?，品系L2的SOD 活性達(dá)到最大值 (80.3 U/g)，約為處理后對照組的1.23倍；品系L4的CAT活性達(dá)到最大值(342 U/g)，約為處理后對照組的1.58倍；品系L1的POD活性達(dá)到最大值(1 580 U/g)，約為處理后對照組的1.31倍(圖5)。說明在鹽脅迫誘導(dǎo)基因表達(dá)時，GHABF4 基因能上調(diào)植株體內(nèi)氧化酶活性，從而使活性氧含量增加。

圖5 NaCl脅迫下轉(zhuǎn)基因棉花與對照植株SOD、CAT、POD比較Fig.5 Comparison of POD，CAT and SOD between transgenic cotton and control plants under NaCl stress

2.4.2 NaCl處理對棉花葉綠素含量的影響 植物在受到鹽脅迫時，光合色素含量減少，使得光合作用減弱，最終導(dǎo)致植物的生長發(fā)育受阻[10]。鹽脅迫結(jié)果顯示，在正常生長條件下，各轉(zhuǎn)基因棉花葉片的綠素含量均在4.0～7.3 mg/g，而200 mmol/L NaCl處理 20 d后，非轉(zhuǎn)基因?qū)φ彰藁▏?yán)重失綠，葉綠素含量降低，而轉(zhuǎn)基因棉花植株葉綠素含量明顯高于對照，品系L3的葉綠素含量達(dá)到4.3 mg/g，約為處理后對照組的2.26倍。說明鹽脅迫能夠嚴(yán)重影響非轉(zhuǎn)基因棉花植株的葉綠素含量，而對轉(zhuǎn)基因棉花的葉綠素含量影響較小(圖6)。

圖6 NaCl脅迫下轉(zhuǎn)基因棉花與對照植株葉綠素含量比較Fig.6 Comparison of chlorophyll content between transgenic cotton and control plants under NaCl stress

3 討論

植物的生長發(fā)育往往受到環(huán)境中各種生物和非生物因素的影響，其中，高鹽、干旱、低溫等非生物脅迫已經(jīng)嚴(yán)重影響了農(nóng)作物的生長水平和產(chǎn)量[11]。利用基因工程方法獲得耐鹽植物新品系、新材料的研究越來越廣泛，且參與脅迫應(yīng)答的很多功能基因已經(jīng)被鑒定出來[12]。有研究表明，轉(zhuǎn)ScALDH21 基因棉花表現(xiàn)出優(yōu)良的生長和生理優(yōu)勢，轉(zhuǎn)ScALDH21 基因能提高棉花的抗鹽能力[13]。將水通道蛋白聚合基因ZmPLC1-betA轉(zhuǎn)化棉花，轉(zhuǎn)基因棉花在干旱脅迫下的相關(guān)生理指標(biāo)及農(nóng)藝性狀均優(yōu)于對照，表現(xiàn)出更強的耐旱性[14]。轉(zhuǎn)菠菜甜菜堿醛脫氫酶基因(SoBADH)株系在鹽脅迫下比對照長勢強，株高和地上部分的鮮質(zhì)量顯著高于非轉(zhuǎn)基因?qū)φ眨诘蜏孛{迫下，這些轉(zhuǎn)基因株系表現(xiàn)出顯著的抗凍性能。菠菜甜菜堿醛脫氫酶能夠在棉花中過量表達(dá)，并具有較高的酶活性，提高了棉花的耐逆性[15-16]。

本研究通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將GHABF4轉(zhuǎn)錄因子基因整合到棉花中，通過對轉(zhuǎn)基因植株T3材料進(jìn)行鹽脅迫來鑒定其耐鹽性，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因棉花受鹽脅迫后，株高比對照提高，地上部分的鮮質(zhì)量比對照增加，抗氧化物酶SOD、POD、CAT等的活性以及葉綠素的含量高于非轉(zhuǎn)基因?qū)φ眨辉邴}脅迫條件下，轉(zhuǎn)入GHABF4基因在一定程度上提高了植株的耐鹽性，使棉花獲得較高的耐鹽性。說明GhABF4基因參與了棉花對鹽脅迫的應(yīng)答反應(yīng)，為棉花耐鹽研究提供一定的理論依據(jù)[17-20]。

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Study on the Salt Tolerance of TransgenicGHABF4 Transcription Factor Cotton Plants

ZHANG Anhong1,2，WANG Zhian1，XIAO Juanli1，LUO Xiaoli1,2

(1.Cotton Research Institute，Shanxi Academy of Agricultural Sciences，Yuncheng 044000，China；2.Shanxi Key Laboratory of Cotton Germplasm Resources Utilization and Molecular Design Breeding，Yuncheng 044000，China)

AREB/ABFs transcription factor family genes are mainly involved in drought，high salt，low temperature and other stress response. To obtain the high salt tolerance level of cotton germplasm. The salt tolerance of transcription factor gene ofGHABF4 was transformated into cotton inbred Zhong 35 plant by Agrobacterium-mediated method. Transgenic plants in T1，T2and T3were detected by kanamycin resistance screening，PCR.Pure transgenic lines were obtained from T3.Salt tolerance analysis was carried out on 5 T3transgenic cotton lines and non transgenic cotton plants by salt stress test. The results showed that under 200 mmol/L NaCl stress，compared with non transgenic lines，5 transgenic cotton plant height increased from 2.5 to 4.4 cm，on the part of the fresh quality increased by 3.6%-11.8%，antioxidant enzyme SOD，POD，CAT activity and chlorophyll content were higher than the control. The results of this study showed that under salt stress，the transgenicGHABF4 cotton showed good growth and physiological advantages，and the transgenicGHABF4 gene could enhance the salt tolerance of cotton.

Cotton；GHABF4 transcription factor；Transgenic cotton；Salt tolerance

2017-06-14

山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)創(chuàng)新研究課題(ZDSYS1501)

張安紅(1977-)，男，山西稷山人，助理研究員，碩士，主要從事植物基因工程研究。

羅曉麗(1963-)，女，甘肅臨洮人，副研究員，主要從事植物基因工程研究。

S562.03；Q78

A

1000-7091(2017)04-0055-05

10.7668/hbnxb.2017.04.009