劉雪華，宋琎楠，張玉喜，侯麗霞，于延沖，趙方貴，劉春英，董春海，楊洪兵

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東省高校植物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266109)

苦蕎麥FtNHX1基因的克隆及表達(dá)分析

劉雪華，宋琎楠，張玉喜，侯麗霞，于延沖，趙方貴，劉春英，董春海，楊洪兵

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東省高校植物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266109)

為深入研究液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在植物耐鹽中的作用，以耐鹽苦蕎麥品種川蕎1號(hào)為材料，利用同源克隆方法得到NHX基因，命名為FtNHX1，并在GenBank中注冊(cè)，登錄號(hào)為KY438929；序列分析表明，該基因開放閱讀框1 662 bp，共編碼553個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)蛋白分子量61.24 kDa，等電點(diǎn)5.15。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，F(xiàn)tNHX1與擬南芥(AtNHX1)、水稻(OsNHX1)和小麥(TaNHX1)的親緣關(guān)系較近，氨基酸同源率分別為60.22%，58.95%和57.30%；熒光定量PCR分析表明，隨著NaCl脅迫濃度的增加，F(xiàn)tNHX1基因在苦蕎麥根部、莖基部和葉片的相對(duì)表達(dá)量極顯著增加，150 mmol/L NaCl脅迫下增加幅度最大，分別比對(duì)照增加了254.10%，311.35%和256.18%；NaCl脅迫下FtNHX1基因在苦蕎麥根部、莖基部和葉片的平均表達(dá)量分別比對(duì)照增加了109.46%，145.67%和155.94%，莖基部和葉片的平均表達(dá)量較高，說明苦蕎麥FtNHX1基因的表達(dá)明顯受鹽脅迫誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)，F(xiàn)tNHX1基因與苦蕎麥的耐鹽性有密切聯(lián)系。

苦蕎麥；鹽脅迫；基因克??；相對(duì)表達(dá)量；耐鹽性

土壤鹽漬化是限制農(nóng)作物產(chǎn)量的重要非生物脅迫之一[1]；因?yàn)檫^高的Na+會(huì)干擾細(xì)胞內(nèi)離子平衡，導(dǎo)致代謝活動(dòng)失調(diào)及破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，從而抑制細(xì)胞生長(zhǎng)甚至死亡[2-3]。植物抵御Na+的侵害主要分為2種形式，即排Na+和Na+的區(qū)隔化，其中液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白以H+-ATPase形成的H+跨膜電化學(xué)梯度為驅(qū)動(dòng)力，將細(xì)胞質(zhì)中Na+泵入液泡進(jìn)行Na+的區(qū)隔化，從而提高植物的耐鹽性[4-6]。Apse等[7]從擬南芥中鑒定出第一個(gè)高等植物液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因AtNHX1，隨后在多種植物中克隆到了Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因。NaCl脅迫下，擬南芥過表達(dá)AtNHX1的轉(zhuǎn)基因植株中Na+含量明顯高于野生型[8]。

蕎麥?zhǔn)请p子葉蓼科(Polygonaceae)、蕎麥屬(Fagopyrum)植物，具有很高的營養(yǎng)價(jià)值和保健功效，主要栽培品種有甜蕎麥(Fagopyrumesculentum)和苦蕎麥(Fagopyrumtartaricum)[9]?？嗍w麥營養(yǎng)豐富，抗逆性更強(qiáng)，目前的研究主要集中在品質(zhì)營養(yǎng)及栽培方面，在分子遺傳育種和耐鹽相關(guān)基因克隆方面研究較少[10]。本研究以耐鹽苦蕎麥品種川蕎1號(hào)為材料克隆FtNHX1基因，分析不同濃度鹽脅迫對(duì)FtNHX1基因表達(dá)量的影響及其在苦蕎麥不同部位的表達(dá)差異，為植物耐鹽分子機(jī)理研究提供一定的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料培養(yǎng)與處理

以耐鹽苦蕎麥品種川蕎1號(hào)為試驗(yàn)材料，挑選籽粒飽滿的種子，1 g/L高錳酸鉀溶液浸泡消毒10 min，去離子水通氣吸漲5 h，種子均勻擺放在鋪有濕紗布的培養(yǎng)皿，26 ℃恒溫箱培養(yǎng)，種子萌發(fā)后移至新培養(yǎng)皿，1/2 Hoagland營養(yǎng)液培養(yǎng)，自然光照，晝夜溫度26 ℃/16 ℃，相對(duì)濕度為60%左右，培養(yǎng)至兩葉一心期開始NaCl脅迫處理，NaCl(1/2 Hoagland營養(yǎng)液配制)濃度為50，100，150 mmol/L，脅迫處理2 d。每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)。

1.2FtNHX1 基因的克隆

取兩葉一心期對(duì)照苦蕎麥幼苗葉片，去離子水沖洗2遍，稱取0.1 g，液氮研磨至粉末，采用RNA提取試劑盒提取總RNA，電泳檢測(cè)其質(zhì)量，分光光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度，以此RNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，cDNA合成按照Prime Script RTase反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)方法進(jìn)行。根據(jù)NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫中注冊(cè)的苦蕎麥FtNHX1的序列(登錄號(hào)：KY438929)，設(shè)計(jì)正反向引物P1和P2(表1)，引物由上海桑尼生物科技有限公司合成。以得到的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將得到產(chǎn)物進(jìn)行凝膠檢測(cè)，目的片段膠回收，連接到pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，用含有50 mg/L氨芐固體培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，PCR鑒定的陽性菌株由上海桑尼生物科技有限公司測(cè)序。

1.3 熒光定量PCR分析

分別取對(duì)照和不同濃度NaCl脅迫處理的苦蕎麥根部、莖基部和葉片材料，去離子水沖洗2遍，吸干水分，各稱取0.1 g，提取RNA(方法同1.2)，按照Prime ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒(TaKaRa)方法反轉(zhuǎn)錄成cDNA。實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物為FtNHX1-F和FtNHX1-R引物序列，選用內(nèi)參基因Actin的實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物為Actin-F和Actin-R引物序列(表1)。參考SYBR? PremixExTaqⅡ試劑盒(TaKaRa)方法在Agilent Technologies Stratagene Mx3000P儀器上進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，采用2-ΔΔCT的方法[11-12]計(jì)算FtNHX1基因在苦蕎麥不同部位的相對(duì)表達(dá)量。

表1 熒光定量PCR分析所用引物Tab.1 The primers of RT-qPCR

1.4 數(shù)據(jù)處理和分析

數(shù)據(jù)處理采用SPSS軟件，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)偏差和差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 苦蕎麥RNA的提取與FtNHX1基因克隆及序列分析

以川蕎1號(hào)葉片為材料提取RNA，得到的RNA用1.2%瓊脂糖凝膠、150 V電壓電泳15 min，電泳結(jié)果如圖1所示。檢測(cè)RNA濃度在葉片中濃度平均1 000 ng/μL，莖基部濃度平均500 ng/μL，根部濃度平均200 ng/μL，OD600為1.8～2.0。用葉片RNA為模板反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以該cDNA為模板，P1和P2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在1 500 ～2 000 bp有一條明顯的亮帶，且沒有雜帶，與目的片段大小一致，如圖2。

1，2，3.RNA提取物。1，2，3.RNA extraction.

該片段回收純化，測(cè)序發(fā)現(xiàn)該基因開放閱讀框1 662 bp，編碼553個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)蛋白分子量61.24 kDa，等電點(diǎn)5.15。經(jīng)過比對(duì)該基因編碼的氨基酸序列與液泡型Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相似度較高，命名為FtNHX1，GenBank注冊(cè)登錄號(hào)為KY438929。

CDS序列見圖3。

M.DL5000 DNA Marker。

2.2 FtNHX1蛋白的同源序列比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

將FtNHX1蛋白的氨基酸序列與GenBank中其他植物NHX的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)FtNHX1與擬南芥(Arabidopsisthaliana)的AtNHX1、水稻(Oryzasativa)的OsNHX6和小麥(Triticumaestivum)的TaNHX1序列相近，氨基酸同源率分別為60.22%，58.95%和57.30%，且高度保守區(qū)有氨氯吡嗪咪結(jié)合位點(diǎn)(lffiyllppi)，見圖4中矩形區(qū)域，可能與Na+的競(jìng)爭(zhēng)性抑制有關(guān)。

利用在線分析程序SOPMA進(jìn)行蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)其二級(jí)結(jié)構(gòu)中α螺旋含量為37.97%，β轉(zhuǎn)角為8.50%，延伸鏈為23.33%，無規(guī)則卷曲為30.20%(圖5)。

圖4 FtNHX1與其他植物NHX的氨基酸序列比對(duì)Fig.4 Amino acid sequence alignment of FtNHX1 and other plants NHX

h.α螺旋；t.β轉(zhuǎn)角；e.延伸鏈；c.無規(guī)則卷曲。h.α helix；t.β turning corner;e.Extended chain;c.Random crimp.

為進(jìn)一步分析FtNHX1與其他植物Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的親緣關(guān)系，對(duì)植物NHX蛋白和SOS1蛋白進(jìn)行了系統(tǒng)進(jìn)化樹分析(圖6)，F(xiàn)tNHX1與液泡膜型Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白親緣關(guān)系較近，而與質(zhì)膜型Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，通過氨基酸序列比對(duì)分析，F(xiàn)tNHX1應(yīng)為液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的相關(guān)基因。

At.擬南芥；Ft.苦蕎；Gm.大豆；Os.水稻；Ta.小麥；Zm.玉米。At.Arabidopsis thaliana;Ft.Fagopyrum tartaricum;Gm.Glycine max;Os. Oryza sativa;Ta.Triticum aestivum;Zm.Zea mays .

2.3 不同濃度NaCl脅迫對(duì)苦蕎麥FtNHX1基因相對(duì)表達(dá)量的影響

在小麥[13]、擬南芥[14]和馬藺[11]等植物中，液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因NHX受鹽脅迫的誘導(dǎo)調(diào)節(jié)，該基因可將細(xì)胞質(zhì)中的Na+泵入液泡內(nèi)將Na+區(qū)隔化，以減少Na+的毒害作用。圖7所示，50，100和150 mmol/L NaCl脅迫下，川蕎1號(hào)FtNHX1基因相對(duì)表達(dá)量都極顯著增加，根部分別比對(duì)照增加了23.14%，51.14%和254.10%；莖基部分別比對(duì)照增加了35.06%，90.61%和311.35%；葉片分別比對(duì)照增加了67.65%，144.00%和256.18%，F(xiàn)tNHX1基因均在150 mmol/L NaCl脅迫下達(dá)到最大相對(duì)表達(dá)。

取標(biāo)準(zhǔn)差作誤差線，n=3，**.P<0.01。圖8同。Values are means±SD，n= 3，**.P < 0.01. The same as Fig.8.

2.4 NaCl脅迫下苦蕎麥FtNHX1基因在不同部位的平均表達(dá)量

圖8可見，NaCl脅迫下，川蕎1號(hào)FtNHX1基因在不同部位的平均表達(dá)量都顯著增加，根部、莖基部和葉片的平均表達(dá)量分別比對(duì)照增加了109.46%，145.67%和155.94%，莖基部和葉片的FtNHX1基因平均表達(dá)量較高。說明苦蕎麥FtNHX1基因的表達(dá)明顯受鹽脅迫誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)。

3 討論與結(jié)論

蕎麥?zhǔn)寝た浦参?，蕎麥根系比較細(xì)，蕎麥的根系很容易褐化，會(huì)影響RNA的提取，所以在提取RNA的過程中，要保證材料足量，更要保證材料的新鮮，要在液氮中冷凍并快速研磨，才能提高RNA的質(zhì)量。蕎麥葉片和莖基部RNA的提取較根部而言相對(duì)容易，但RNA很容易降解，所以在提取過程要保持相對(duì)較低的溫度，盡量放置于冰上，從而防止RNA的降解。

圖8 NaCl脅迫下苦蕎麥FtNHX1基因在不同部位的平均表達(dá)量 Fig.8 The average expression of FtNHX1 gene in different parts of tartary buckwheat under NaCl stress

近年來，高等植物基因表達(dá)調(diào)控的研究進(jìn)一步深入，其中逆境脅迫誘導(dǎo)植物抗逆相關(guān)基因的表達(dá)是研究的一個(gè)重要方面[15]。鹽漬環(huán)境可對(duì)植物產(chǎn)生滲透脅迫、氧化脅迫及離子毒害等效應(yīng)[13]；過高Na+水平擾亂細(xì)胞內(nèi)離子平衡，導(dǎo)致膜功能失調(diào)或代謝活動(dòng)紊亂，從而抑制植物細(xì)胞生長(zhǎng)甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡，植物為了抵御Na+離子毒害通常會(huì)有2種主要適應(yīng)形式：一種是將Na+泵到液泡區(qū)隔化，維持膨壓和細(xì)胞吸水[16-17]；另一種是將Na+泵到細(xì)胞外排Na+，從而提高植物的耐鹽性[18]。植物Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族可分為兩類，即液泡膜型和質(zhì)膜型[19]，液泡膜型Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的作用就是將細(xì)胞質(zhì)中過高的Na+轉(zhuǎn)運(yùn)到液泡內(nèi)進(jìn)行Na+的區(qū)隔化，從而減少Na+的毒害；質(zhì)膜型Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是將細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的Na+轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外進(jìn)行Na+外排，減少Na+的毒害。

液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(NHX)活性首先在甜菜(Betavulgaris)根中檢測(cè)到[20]；NHX可將細(xì)胞質(zhì)中Na+區(qū)隔化到液泡，在植物拒Na+過程中發(fā)揮重要作用[21]。本研究從苦蕎麥中分離得到液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因FtNHX1，其開放閱讀框ORF區(qū)1 662 bp，共編碼553個(gè)氨基酸，具有完整的編碼液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的cDNA序列[22]，與擬南芥AtNHX1的氨基酸同源率高達(dá)60%以上，且高度保守區(qū)有氨氯吡嗪咪結(jié)合位點(diǎn)(LFFIYLLPPI)，LFFIYLLPPI是結(jié)合Na+的位點(diǎn)，負(fù)責(zé)Na+轉(zhuǎn)運(yùn)；通過系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，F(xiàn)tNHX1與液泡膜型Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白親緣關(guān)系較近，推測(cè)FtNHX1定位表達(dá)于液泡膜，與其他植物液泡膜型Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因有類似功能。

Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在細(xì)菌、酵母、藻類、動(dòng)物和高等植物膜系統(tǒng)上普遍存在，它參與細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的pH調(diào)節(jié)，Na+濃度調(diào)節(jié)及細(xì)胞體積變化等活動(dòng)[23- 24]。鹽脅迫下，紫花苜蓿液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因MsNHX1表達(dá)量明顯增加，MsNHX1蛋白分子數(shù)也明顯增加[25]；隨鹽濃度的升高，馬藺NHX基因的表達(dá)量也不斷升高，說明該基因的表達(dá)量受鹽脅迫的誘導(dǎo)調(diào)節(jié)，在耐鹽過程中發(fā)揮重要作用[11]；將小麥和紫花苜蓿的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因在擬南芥中過表達(dá)，都明顯提高了轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性，而擬南芥本身并無不良反應(yīng)[26-27]。本研究中隨著NaCl脅迫濃度的增加，苦蕎麥根部、莖基部和葉片F(xiàn)tNHX1基因的表達(dá)量都呈顯著增加趨勢(shì)，其中在NaCl脅迫濃度最大時(shí)，苦蕎麥不同部位FtNHX1基因的表達(dá)量都達(dá)到最高水平，在莖基部的表達(dá)量最高，其次是葉片，根中的表達(dá)量比葉片稍低；并且NaCl脅迫下苦蕎麥不同部位FtNHX1基因的平均表達(dá)量都比對(duì)照增加了1倍以上，說明苦蕎麥FtNHX1基因的表達(dá)明顯受鹽脅迫的誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)，F(xiàn)tNHX1基因與苦蕎麥的耐鹽性有密切聯(lián)系。本研究對(duì)苦蕎麥FtNHX1的氨基酸序列、蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行了初步分析，也探究了苦蕎麥FtNHX1基因的表達(dá)特性，為進(jìn)一步研究該基因在苦蕎麥中的抗逆機(jī)理起到鋪墊作用，也為研究其他抗逆基因的抗逆機(jī)理提供了一定的參考作用?？嗍w麥具有較強(qiáng)的抗逆性，本身可能蘊(yùn)含著大量的抗性基因，本研究為探討蕎麥耐鹽機(jī)制提供了理論依據(jù)，為進(jìn)一步分析FtNHX1基因功能奠定了基礎(chǔ)。

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Cloning and Expression Analysis ofFtNHX1 in Tartary Buckwheat

LIU Xuehua，SONG Jinnan，ZHANG Yuxi，HOU Lixia，YU Yanchong，ZHAO Fanggui，LIU Chunying，DONG Chunhai，YANG Hongbing

(College of Life Sciences，Qingdao Agricultural University，Key Lab of Plant Biotechnology in Universities of Shandong，Qingdao 266109，China)

In order to further study the Na+/H+antiporter roles of vacuole membrane in salt tolerance of plants，the salt-tolerant tartary buckwheat variety Chuanqiao No.1 was used as materials，and theNHXgene was obtained by homology cloning，which namedFtNHX1，and registered in GenBank，the landing number was KY438929. Sequence analysis showed that the open reading frame ofFtNHX1 was 1 662 bp，encoding 553 amino acids，with predicted molecular weight of 61.24 kDa and isoelectric point of 5.15. Phylogenetic tree analysis showed that FtNHX1 was closely related to AtNHX1，OsNHX1 and TaNHX1，with 60.22%，58.95% and 57.30% amino acid homology rates. Quantitative real-time PCR analysis showed that the relative expression ofFtNHX1 gene in roots，stem base and leaf of tartary buckwheat was significantly increased with the concentration increasing of NaCl stress，and that increased the most under NaCl stress of 150 mmol/L，which was increased by 254.10%，311.35% and 256.18% respectively in contrast with control. The average expression ofFtNHX1 gene in roots and stem base and leaf of tartary buckwheat was increased by 109.46%，145.67% and 155.94% in contrast with control under NaCl stress，and that in stem base and leaf was very higher，indicating that the expression ofFtNHX1 gene in tartary buckwheat was obviously induced and regulated by salt stress，and there was a close relationship between theFtNHX1 gene and the salt tolerance of tartary buckwheat.

Tartary buckwheat；Salt stress；Gene cloning；Relative expression；Salt tolerance

2017-06-13

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31371552)；山東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(ZR2010CL019)

劉雪華(1990-)，女，山東濰坊人，在讀碩士，主要從事植物逆境生理與分子生物學(xué)研究。劉雪華、宋琎楠為同等貢獻(xiàn)作者。

楊洪兵(1968-)，男，山東日照人，教授，博士，主要從事植物逆境生理與分子生物學(xué)研究。

Q78；S517

A

1000-7091(2017)04-0049-06

10.7668/hbnxb.2017.04.008