袁 敏，葛偉娜，王 莉，張 嵐，張家琦

(華北理工大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，基因組學(xué)與計(jì)算生物學(xué)研究中心，河北 唐山 063000)

擬南芥蛋白激酶SnRK1.1對(duì)轉(zhuǎn)錄因子FD的磷酸化分析

袁 敏，葛偉娜，王 莉，張 嵐，張家琦

(華北理工大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，基因組學(xué)與計(jì)算生物學(xué)研究中心，河北 唐山 063000)

為了獲得純化的SnRK1.1與FD蛋白，分析蛋白激酶SnRK1.1是否能夠磷酸化開花調(diào)控途徑中的轉(zhuǎn)錄因子FD，成功克隆了1 608 bp的SnRK1.1基因以及858 bp的FD與FD-T282A基因，分別與PGEX-4T-3載體連接，獲得原核表達(dá)載體GST-SnRK1.1、GST-FD和GST-FD-T282A，并分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21菌株；SDS-PAGE電泳和考馬斯亮藍(lán)染色(CBB)表明，0.5 mmol/L IPTG能夠成功誘導(dǎo)出GST-SnRK1.1、GST-FD和GST-FD-T282A蛋白。利用GST純化介質(zhì)純化獲得了84 kDa的GST-SnRK1.1蛋白以及58 kDa的GST-FD與GST-FD-T282A融合蛋白；利用體外磷酸化體系證實(shí)SnRK1.1能夠磷酸化FD，不能磷酸化突變的FD-T282A。研究結(jié)果為進(jìn)一步解析SnRK1.1通過磷酸化轉(zhuǎn)錄因子FD參與開花途徑調(diào)控的機(jī)制奠定了良好的基礎(chǔ)。

SnRK1.1；FD；蛋白激酶；轉(zhuǎn)錄因子；磷酸化

蛋白質(zhì)所受的修飾調(diào)節(jié)直接影響其活性及生物學(xué)功能。磷酸化作為一種重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾，廣泛參與植物的激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，抗逆境脅迫、氣孔發(fā)育、光信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等多種生命活動(dòng)[1-2]。近年來(lái)的研究表明，蛋白質(zhì)磷酸化修飾也存在于植物開花調(diào)控過程中[3-5]。轉(zhuǎn)錄因子FD只有在被磷酸化之后才能與成花素蛋白FT以及生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子14-3-3蛋白形成成花素激活復(fù)合體(FAC)[6-10]。蛋白激酶CPKs家族成員CPK6和CPK33能夠磷酸化FD蛋白C末端第282位蘇氨酸[11-13]。

筆者在篩選FD互作蛋白時(shí)發(fā)現(xiàn)了蛋白激酶SnRK1.1。SnRK1.1是植物蔗糖非發(fā)酵-1相關(guān)蛋白激酶SnRK1的催化亞基，此外，還有SnRK1.2和SnRK1.3 2個(gè)同源基因編碼其催化亞基。SnRK1通常由1個(gè)催化亞基和2個(gè)具有調(diào)節(jié)功能的亞基組裝成三聚體發(fā)揮功能[14-17]。SnRK1參與調(diào)控植物礦物質(zhì)營(yíng)養(yǎng)的攝取、脫落酸ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、非生物/生物脅迫、逆境響應(yīng)等很多植物生長(zhǎng)發(fā)育過程[18-20]。蛋白激酶SnRK1.1與CPKs都能識(shí)別并磷酸化具有R-X-X-pS/T-X-P氨基酸序列的蛋白[21]。但是，SnRK1.1是否也能磷酸化轉(zhuǎn)錄因子FD尚不清楚。本研究從大腸桿菌中分別純化了SnRK1.1、FD和FD-T282A(第282位絲氨酸突變?yōu)楸彼?融合蛋白，體外激酶試驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)SnRK1.1能夠磷酸化轉(zhuǎn)錄因子FD，不能磷酸化帶有突變位點(diǎn)的FD-T282A蛋白，表明T282位點(diǎn)參與SnRK1.1對(duì)轉(zhuǎn)錄因子FD的磷酸化作用。研究結(jié)果為后續(xù)研究SnRK1.1通過磷酸化轉(zhuǎn)錄因子FD參與植物開花調(diào)控提供了直接的證據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

DH5α和BL21菌株由華北理工大學(xué)基因組學(xué)與計(jì)算生物學(xué)研究中心保存；基因克隆相關(guān)試劑購(gòu)于大連生工公司；GST蛋白純化介質(zhì)、純化柱和HRP標(biāo)記的二抗購(gòu)于美國(guó)Bio-Rad公司；anti-pThr抗體購(gòu)于Sigma公司；Western Blot免疫印跡檢測(cè)底物購(gòu)于Pierce公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1FD、FD-T282A及SnRK1.1基因的克隆 分別利用各自的基因特異引物擴(kuò)增獲得全長(zhǎng)基因。第282位蘇氨酸靠近FD蛋白KC末端，因此可以直接設(shè)計(jì)帶有突變位點(diǎn)的引物來(lái)擴(kuò)增FD-T282A。所用的引物分別如下(下劃線標(biāo)注酶切位點(diǎn))：FD-BamH Ⅰ-F：5′-CGGGATCCATGTTGTCATCAGCTAAGCATC-3′，F(xiàn)D-NotⅠ-R：5′-ATAAGAATGCGGCCGCAAATGGAGCTGTGGAAGACCG-3′，F(xiàn)D-T282A-NotⅠ-R：5′-ATAAGAATGCGGCCGCTCAAAATGGAGCTGCGGAAGAC-3′，SnRK1.1-BamH I-F：5′-CGGGATCCATGGATGGATCAGGCACAGG-3′，SnRK1.1-NotⅠ-R：5′-ATAAGAATGCGGCCGCGAGGACTCGGAGCTGAGCA-3′。

1.2.2 GST-FD、GST-FD-T282A和GST-SnRK1.1表達(dá)載體構(gòu)建 利用BamH Ⅰ和NotⅠ酶切擴(kuò)增產(chǎn)物，連入PGEX-4T-3載體，分別獲得GST-FD、GST-FD-T282A和GST-SnRK1.1表達(dá)載體。

1.2.3 GST-FD、GST-FD-T282A和GST-SnRK1.1蛋白純化 離心收集菌體，棄上清，用樣品緩沖液重懸沉淀。菌體經(jīng)過超聲破碎后于4 ℃，14 000 r/min離心15～20 min。將上清液于離心管中與純化介質(zhì)混合低溫低速混勻2～3 h。500～1 000 r/min離心后舍棄上清，樣品緩沖液重懸洗滌GST基質(zhì)3次。利用適量體積的蛋白洗脫緩沖液與純化介質(zhì)孵育洗脫目標(biāo)蛋白，可重復(fù)洗脫多次，再用濃縮管離心來(lái)收集目標(biāo)蛋白。

1.2.4 蛋白質(zhì)的透析與純度檢測(cè) 透析的目的是去除蛋白質(zhì)溶液中的谷胱甘肽，避免對(duì)后續(xù)試驗(yàn)的影響。將純化的蛋白溶液裝入透析袋，置于裝有適量透析液的燒杯中，緩慢攪拌，更換數(shù)次透析液，直至充分降低蛋白溶液中谷胱甘肽的濃度。透析后取0.5～1.0 μg蛋白，加入適量的2×SDS上樣緩沖液，95 ℃加熱10 min，12 000 r/min離心5 min，取上清液進(jìn)行SDS-PAGE電泳，檢測(cè)目標(biāo)蛋白的質(zhì)量。

1.2.5 體外激酶試驗(yàn) 將1.0 μg GST-SnRK1.1與0.5 μg GST-FD或者0.5 μg GST-FD-T282A在激酶反應(yīng)緩沖液(40 mmol/L Tris.HCl，pH值7.4，1 mmol/L MgCl2，10 μmol/L ATP)中室溫孵育20～30 min。然后利用Western Blot免疫印跡技術(shù)以及特異檢測(cè)磷酸化修飾的抗體anti-pThr檢測(cè)GST-FD或者GST-FD-T282A是否被GST-SnRK1.1磷酸化。

2 結(jié)果與分析

2.1FD、FD-T282A基因的克隆及表達(dá)載體的構(gòu)建

利用FD特異性引物PCR擴(kuò)增，分別獲得858 bp的FD和858 bpFD-T282A全長(zhǎng)基因(圖1-A)。將目的條帶利用BamH Ⅰ和NotⅠ酶切后與表達(dá)載體PGEX-4T-3連接轉(zhuǎn)化DH5α，菌落PCR擴(kuò)增鑒定后測(cè)序獲得正確的表達(dá)載體GST-FD和GST-FD-T282A(圖1-B)。

A. PCR擴(kuò)增FD基因：1.FD，2.突變的FD-T282A； B. GST-FD和GST-FD-T282A的菌落PCR擴(kuò)增結(jié)果：1～3. GST-FD菌落，4～6. GST-FD-T282A菌落；M.DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。

A. PCR amplification ofFD：1.FDgene，2. MutatedFD-T282Agene； B. Colony PCR amplification of GST-FDand GST-FD-T282A： 1-3. GST-FDcolonies，4-6. GST-FD-T282Acolonies；M.DNA Marker.

圖1FD表達(dá)載體的構(gòu)建
Fig.1 Construction of expression vector ofFD

2.2SnRK1.1基因的克隆及表達(dá)載體的構(gòu)建

利用SnRK1.1基因上下游引物擴(kuò)增，獲得1 608 bp的SnRK1.1全長(zhǎng)基因(圖2-A)。BamHⅠ和NotⅠ酶切后連接到PGEX-4T-3載體上，經(jīng)菌落PCR及測(cè)序鑒定獲得正確的表達(dá)載體GST-SnRK1.1(圖2-B)。

A. PCR擴(kuò)增SnRK1.1基因:1.SnRK1.1； B. GST-SnRK1.1菌落PCR擴(kuò)增結(jié)果:1～4. GST-SnRK1.1菌落;M.DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。 A. PCR amplification of SnRK1.1；B.Colony PCR amplification of GST-SnRK1.1:1-4.GST-SnRK1.1 colonies；M.DNA Marker.

2.3 GST-FD和GST-FD-T282A蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

將分別轉(zhuǎn)化重組載體GST-FD或GST-FD-T282A的大腸桿菌利用合適濃度的IPTG室溫誘導(dǎo)6 h。SDS-PAGE電泳和考馬斯亮藍(lán)染色(CBB)結(jié)果表明，室溫0.5 mmol/L IPTG能夠誘導(dǎo)出分子量約為58 kDa的GST-FD和GST-FD-T282A蛋白(圖3)。

1.GST-FD誘導(dǎo)前；2.GST-FD誘導(dǎo)后；3.GST-FD-T282A誘導(dǎo)前；4.GST-FD-T282A誘導(dǎo)后；M.蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)。 1. GST-FD before induction；2.GST-FD after induction； 3. GST-FD-T282A before induction；4.GST-T282A after induction；M.Protern Marker.

2.4 GST-SnRK1.1蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

將轉(zhuǎn)化空載體PGEX-4T-3或重組載體GST-SnRK1.1的大腸桿菌利用合適濃度的IPTG，18 ℃誘導(dǎo)過夜。SDS-PAGE電泳和考馬斯亮藍(lán)染色(CBB)結(jié)果表明，0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)出分子量為84 kDa的GST-SnRK1.1蛋白和26 kDa的GST蛋白(圖4)。

2.5 GST-FD和GST-FD-T282A融合蛋白的純化

將分別轉(zhuǎn)化GST-FD或GST-FD-T282A表達(dá)載體的大腸桿菌進(jìn)行大量誘導(dǎo)，超聲破碎菌體，離心，收集上清液使用GST純化介質(zhì)純化。透析去除蛋白洗脫液中的谷胱甘肽。SDS-PAGE電泳和考馬斯亮藍(lán)染色(CBB)分析，獲得的GST-FD和GST-FD-T282A蛋白純度高，分子量為58 kDa(圖5)。

1.GST誘導(dǎo)前；2.GST誘導(dǎo)后；3.GST-SnRK1.1誘導(dǎo)前；4. GST-SnRK1.1誘導(dǎo)后；M.蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)。 1. GST before induction；2.GST after induction； 3. GST-SnRK1.1 before induction；4.GST-SnRK1.1 after induction；M.Protein Marker.

2.6 GST-SnRK1.1融合蛋白的純化

利用上述同樣的方法進(jìn)行GST-SnRK1.1蛋白的純化。SDS-PAGE電泳和考馬斯亮藍(lán)染色(CBB)分析，獲得了純度好、分子量84 kDa 的GST-SnRK1.1融合蛋白，與預(yù)期蛋白分子量大小一致(圖6)。

2.7 蛋白激酶GST-SnRK1.1能夠磷酸化GST-FD

室溫條件下，將1.0 μg GST-SnRK1.1分別與0.5 μg GST-FD或0.5 μg GST-FD-T282A于激酶反應(yīng)緩沖液中孵育30 min。然后利用Western Blot免疫印跡技術(shù)和anti-pThr抗體檢測(cè)GST-FD或GST-FD-T282A是否能被激酶GST-SnRK1.1磷酸化。蛋白質(zhì)的蘇氨酸(Thr)位點(diǎn)被磷酸化后可以被anti-pThr抗體識(shí)別。試驗(yàn)結(jié)果顯示，與GST-SnRK1.1共同孵育的GST-FD(泳道2)被anti-pThr識(shí)別，但是與GST-SnRK1.1共同孵育的GST-FD-T282A(泳道3)未被anti-pThr識(shí)別，其余泳道為單獨(dú)的GST-SnRK1.1、GST-FD或者GST-FD-T282A作為陰性對(duì)照。該結(jié)果直接證實(shí)了GST-SnRK1.1能夠磷酸化GST-FD但不能磷酸化GST-FD-T282A(圖7)。

1. GST-SnRK1.1蛋白；M. 蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)。 1. GST-SnRK1.1 recombinant protein；M. Protein Marker.

1.單獨(dú)GST-SnRK1.1；2. GST-SnRK1.1和GST-FD；3. GST-SnRK1.1和GST-FD-T282A；4. 單獨(dú)GST-FD；5. 單獨(dú)GST-FD-T282A；M.蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)。

1.GST-SnRK1.1 alone；2.GST-SnRK1.1 and GST-FD；3.GST-SnRK1.1 and GST-FD-T282A；4.GST-FD alone；5.GST-FD-T282A alone；M.Protein Marker.

圖7 GST-SnRK1.1蛋白能夠磷酸化GST-FD
Fig.7 GST-SnRK1.1 could phosphorylate GST-FD

3 討論與結(jié)論

生物體執(zhí)行生命活動(dòng)最終是依靠蛋白質(zhì)來(lái)完成的，并且常常通過蛋白翻譯后修飾來(lái)傳遞遺傳信息。由蛋白激酶和蛋白磷酸酶分別控制的蛋白質(zhì)可逆磷酸化修飾是一種十分重要的修飾方式，參與調(diào)控生物體內(nèi)許多的生物學(xué)過程。近年來(lái)的研究表明，蛋白質(zhì)的磷酸化修飾在植物開花途徑中發(fā)揮重要作用，主要在于開花途徑轉(zhuǎn)錄因子FD蛋白存在磷酸化修飾調(diào)節(jié)。FD是bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族成員，F(xiàn)D的磷酸化修飾對(duì)于其在開花途徑中發(fā)揮必不可少的作用。只有磷酸化狀態(tài)的FD才能夠與成花素蛋白FT結(jié)合進(jìn)而調(diào)節(jié)下游SOC1和AP1基因的表達(dá)，促進(jìn)花分生組織的形成。因此，尋找并研究開花途徑中負(fù)責(zé)磷酸化FD的蛋白激酶對(duì)于解讀植物開花機(jī)制具有十分重要的意義。SnRK1.1是植物蔗糖非發(fā)酵-1相關(guān)蛋白激酶SnRK1家族的重要成員，結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜，廣泛參與植物非生物/生物脅迫、逆境信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、脫落酸ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及植物生長(zhǎng)發(fā)育等眾多生物學(xué)過程，但是目前關(guān)于SnRK1.1是否參與植物開花調(diào)控還不清楚。Williams等[9-10，14]的研究結(jié)果表明，擬南芥SnRK1.1過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出輕微的晚花表型。那么，SnRK1.1是否直接參與開花時(shí)間調(diào)控值得進(jìn)一步研究和探索。

蛋白激酶CPKs家族成員CPK6和CPK33能夠磷酸化FD蛋白，作用位點(diǎn)是第282位的蘇氨酸[13]。本研究利用原核表達(dá)技術(shù)純化了高質(zhì)量的GST-SnRK1.1、GST-FD以及GST-FD-T282A蛋白，體外激酶試驗(yàn)證實(shí)了蛋白激酶SnRK1.1能夠磷酸化FD，不能磷酸化突變的GST-FD-T282A蛋白。由此看出SnRK1蛋白激酶也能夠磷酸化FD蛋白的第282位蘇氨酸位點(diǎn)。CPKs與SnRK1蛋白激酶都能夠磷酸化FD蛋白，那么CPKs與SnRK1對(duì)FD的磷酸化有何區(qū)別，二者如何協(xié)調(diào)控制FD蛋白的磷酸化,二者是否在不同的條件下或者不同的時(shí)段分別磷酸化FD,對(duì)FD蛋白氨基酸序列進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)該蛋白上存在多個(gè)絲氨酸/蘇氨酸位點(diǎn)，除了第282位蘇氨酸位點(diǎn)，CPKs與SnRK1是否能夠磷酸化其他的絲氨酸/蘇氨酸位點(diǎn)，以及CPKs與SnRK1是否通過磷酸化不同的位點(diǎn)或者不同數(shù)目的位點(diǎn)發(fā)揮作用等都將是值得研究的問題。

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Protein Kinase SnRK1.1 Phosphorylates Transcriptional Factor FD inArabidopsisthaliana

YUAN Min，GE Weina，WANG Li，ZHANG Lan，ZHANG Jiaqi

(College of Life Sciences，North China University of Science and Technology，Genomics and Computational Biology Research Center,Tangshan 063000,China)

This study aimed at obtaining purified SnRK1.1 and FD proteins，and analyzing whether SnRK1.1 could phosphorylate transcription factor FD in flowering regulation pathway. 1 608 bpSnRK1.1 gene and 858 bpFD/FD-T282Agenes were cloned successfully and linked into PGEX-4T-3 vector respectively. GST-SnRK1.1,GST-FDand GST-FD-T282Aexpression vectors were made and transformed intoE.colistrain BL21. SDS-PAGE and CBB staining showed that 0.5 mmol/L IPTG could successfully induce GST-SnRK1.1,GST-FD and GST-FD-T282A proteins. 84 kDa GST-SnRK1.1 and 58 kDa GST-FD or mutated GST-FD-T282A proteins were purified using GST tag protein purification system. The purified GST-SnRK1.1 recombinant protein could phosphorylate GST-FD proteins but not mutated GST-FD-T282A protein. This result would provide a good basis to study how SnRK1.1 mediates flowering through phosphorylating FD.

SnRK1.1；FD；Protein kinase；Transcription factor；Phosphorylation

2017-06-01

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31401212)；河北省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(C2014209134)；唐山市科技局項(xiàng)目(15140202a)

袁 敏(1982- )，女，河北盧龍人，講師，博士，主要從事植物激素與生長(zhǎng)發(fā)育方面的研究。

Q71;Q78

A

1000-7091(2017)04-0037-05

10.7668/hbnxb.2017.04.006