何 平，疏 冕，蔡曉丹，傅雪琳

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510642；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，廣東 廣州 510642)

栽培稻×藥用野生稻種間雜種基因組DNA甲基化的遺傳與變異研究

何 平1，疏 冕1，蔡曉丹1，傅雪琳2

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510642；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，廣東 廣州 510642)

為了探索栽培稻與藥用野生稻種間雜種體內(nèi)異源基因組重組引起的DNA甲基化變異規(guī)律，及其生物學(xué)效應(yīng)，利用甲基化敏感擴增多態(tài)性(MSAP)技術(shù)對遼粳944、藥用野生稻及其雜種F1不同發(fā)育時期的葉片和小穗基因組DNA甲基化水平和模式的遺傳變異特點進行了分析。結(jié)果表明，遼粳944、藥用野生稻及其雜種F1的葉片和小穗DNA的甲基化水平表現(xiàn)出相同的變化趨勢，即隨著生長發(fā)育的進行，DNA甲基化水平呈下降趨勢，各組織的全甲基化率均顯著高于半甲基化率(P=0.000)；雜種在分蘗期、減數(shù)分裂期及開花期葉片DNA平均總甲基化率、全甲基化率和半甲基化率分別為20.19%，16.06%及4.13%，其甲基化水平高于雙親；而雜種在減數(shù)分裂期、小孢子發(fā)育期及花粉成熟期小穗DNA平均總甲基化率、全甲基化率和半甲基化率分別為17.38%，13.67%及3.71%，均比遼粳944高，而比藥用野生稻低；雜種小穗的半甲基化率顯著高于遼粳944(P=0.015)。雜種葉片和小穗DNA的甲基化模式均有5種類型。經(jīng)過對94個甲基化特異片段的序列分析，有38個片段的序列與已知或假定功能的基因具有同源性。為進一步研究栽培稻與野生稻種間雜種不育機理奠定了基礎(chǔ)。

栽培稻；藥用野生稻；種間雜種；DNA甲基化；甲基化敏感擴增多態(tài)性

藥用野生稻(O.officinalis)屬于CC染色體組，是原產(chǎn)我國的3種野生稻之一。藥用野生稻在長期的自然適應(yīng)與選擇過程中積累了大量重要的有利基因，包括抗生物脅迫的防御基因、耐非生物脅迫的基因以及高光效基因等有利基因[1-2]，這些基因多數(shù)都是目前水稻育種所重視和需要的。截至目前，栽培稻與野生稻種間雜交仍然是實現(xiàn)野生稻有利基因向栽培稻轉(zhuǎn)移的主要途徑，如在藥用野生稻方面，研究者通過栽培稻與野生稻雜交和進一步的回交等，將藥用野生稻的褐飛虱等的抗性基因?qū)氲搅嗽耘嗟?，獲得了新的種質(zhì)[3-4]。盡管如此，研究也表明，在AA組栽培稻與CC組藥用野生稻種間雜交方面由于雙方基因組的不同，存在著嚴重的交配障礙，其中雜種不育是影響基因交流和雜種利用的主要限制因素，對其機理的研究主要集中在減數(shù)分裂過程同源染色體配對及大孢子與小孢子發(fā)育的異常上，這種異常使得雜種表現(xiàn)為高度的雄性不育和雌性不育，進而影響結(jié)實[5]。研究也表明，即使在栽培稻背景下構(gòu)建的藥用野生稻單體異附加系的種質(zhì)中，A和C 2個基因組間的互作顯得非常復(fù)雜，影響了其遺傳的穩(wěn)定性和基因的表達[6]，但是目前依然缺乏對其分子機理的研究。

眾所周知，遠緣雜交在作物種質(zhì)創(chuàng)新和新品種培育上發(fā)揮著重要的作用，但遠緣雜交后代會產(chǎn)生基因組重組或加倍形成異源多倍體，從而導(dǎo)致基因組變異和表型變異。由于遠緣雜種體內(nèi)高度異源的基因組的重組，產(chǎn)生細胞內(nèi)染色體之間和質(zhì)核之間的不協(xié)調(diào)，因此遠緣雜交對植物基因組構(gòu)成一種強烈沖擊，在這種情況下，基因組內(nèi)處于沉默狀態(tài)的轉(zhuǎn)座子(包括反轉(zhuǎn)座子)可能被激活，從而對這一沖擊發(fā)生應(yīng)答并會引起基因組的重建即包括甲基化改變等的染色體結(jié)構(gòu)性改變[7]。前人研究表明，遠緣雜交后代F1及其染色體加倍形成異源多倍體的過程發(fā)生了廣泛的甲基化變異。例如，在菰(ZizanialatifoliaGriseb)與栽培稻漸滲雜交系中發(fā)現(xiàn)，菰的DNA滲入引起了水稻全基因組和特異基因位點的甲基化變異[8]；在小白菜品種矮抗青(B.rapa，AA)和芥藍品種中華芥蘭(B.oleracea，CC)雜交后代F1及其自交后代中，F(xiàn)1甲基化狀態(tài)以雙親遺傳為主，雜種F1甲基化狀態(tài)發(fā)生變異的比例約為6%，同時13.1%的基因位點發(fā)生了甲基化修飾[9]。此外，在與植物生殖發(fā)育及育性有關(guān)的研究中，DNA甲基化也表現(xiàn)出變化，例如，Baroux等[10]對植物配子形成過程表觀遺傳與重編程的研究表明，植物配子形成過程中會發(fā)生一系列不同于親本的包括甲基化和小分子RNA在內(nèi)的調(diào)節(jié)變化；Ba等[11]在小麥雄性不育系與保持系的研究中，發(fā)現(xiàn)不同細胞質(zhì)背景對核基因的甲基化影響表現(xiàn)出顯著差異，與普通小麥遺傳距離越遠的供體種的細胞質(zhì)產(chǎn)生的影響越大。Chen等[12]在玉米C型雄性可育和雄性不育雜種的研究中發(fā)現(xiàn)，育性恢復(fù)雜種的雄花甲基化水平顯著高于雄性不育雜種，且在CMS-C育性恢復(fù)基因Rf5的區(qū)域發(fā)現(xiàn)一個特異的甲基化位點，表明DNA甲基化可能參與了CMS-C育性恢復(fù)基因的表達調(diào)控過程。由此看來，DNA甲基化作為最早發(fā)現(xiàn)的和最主要的表觀遺傳修飾方式之一，已被越來越多的研究發(fā)現(xiàn)其具有許多變異及重要的生物學(xué)功能。

水稻DNA甲基化的研究也在與之相關(guān)的多個方面都取得了重要進展，如抗性基因表達[13]、開花的基因控制[14]、轉(zhuǎn)座子激活[15]，DNA甲基化在水稻的生長、發(fā)育及基因表達調(diào)控等諸多過程中都發(fā)揮著極為重要的作用。更為重要的是，在水稻遠緣雜交中產(chǎn)生的以DNA甲基化變異為主的表觀遺傳變異可能與雜種優(yōu)勢產(chǎn)生的分子機理密切相關(guān)，并在作物進化的過程當中起著十分關(guān)鍵的作用[16-18]。此外，Jin 等[19]在栽培稻與藥用野生稻種間雜交研究中，對栽培稻與藥用野生稻種間雜種F1(染色體組為AC)及其回交后代BC1F1(染色體組為AAC)抽穗期旗葉基因組DNA甲基化變異的研究表明，雜種F1的甲基化變異率接近7.6%，其中90.9%的甲基化位點變異在BC1F1得到保持，雜種基因和轉(zhuǎn)座子都是甲基化變異發(fā)生的目標位點，且證明甲基化變異對雜種基因表達產(chǎn)生直接而快速的影響。盡管如此，至今未見有關(guān)栽培稻與野生稻種間雜種小穗發(fā)育過程中甲基化變異相關(guān)研究的報道，本研究利用甲基化敏感擴增多態(tài)性(MSAP)技術(shù)系統(tǒng)研究了遼粳944與藥用野生稻雜種F1不同發(fā)育時期葉片及小穗基因組DNA甲基化的變異特點及相關(guān)基因表達，旨在為探討栽培稻與藥用野生稻種間雜種敗育過程中的表觀遺傳修飾變異規(guī)律及其與雜種不育的關(guān)系提供參考。

1 材料和方法

1.1 供試材料

親本材料分別為栽培稻品種遼粳944(O.sativa)(AA染色體組，2n=2x=24)、藥用野生稻(O.officinalis)(CC染色體組，2n=2x=24，來源于中國廣西)，種間雜種為以遼粳944為母本、藥用野生稻為父本進行雜交及雜種幼胚拯救所獲得的雜種F1(AC染色體組，2n=2x=24)。各材料均盆栽種植于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)稻屬核心種質(zhì)收集圃。常規(guī)管理。

1.2 基因組DNA的提取

分別于分蘗盛期、小孢子母細胞減數(shù)分裂期和開花期取頂部第一片展開葉或劍葉葉片用于基因組總DNA的提??；此外，取每株主莖穗在減數(shù)分裂期、小孢子發(fā)育期及花粉成熟期小穗用于基因組總DNA的提取。每個材料各個發(fā)育時期提取DNA的葉片或小穗為3株相應(yīng)組織的混合樣品。DNA提取采用改良的CTAB法[20]。將提取出的DNA溶于TE并加入10 μL RNase(5 μg/μL)去除RNA，純化后的DNA質(zhì)量和濃度分別采用0.8%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計測定，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 DNA甲基化敏感擴增多態(tài)性(MASP)分析

MSAP分析參考Xiong等[16]方法進行。具體如下：

1.3.1 接頭序列、預(yù)擴增引物及選擇性擴增引物(表1) MASP試驗所用的EcoR Ⅰ、MspⅠ、HpaⅡ、TaqDNA聚合酶和T4連接酶等工具酶以及PCR反應(yīng)體系均購自TaKaRa公司，凝膠回收試劑盒和質(zhì)粒微量抽提試劑盒購自上海生工生物工程有限公司，總RNA抽提用TRIzol試劑盒購自Invitrogen公司，酵母提取物和蛋白胨購自O(shè)xoid公司，其余試劑均為國產(chǎn)分析純或化學(xué)純試劑。

1.3.2 基因組DNA雙酶切與連接 選取對甲基化敏感的同位酶MspⅠ、HapⅡ分別與限制性內(nèi)切酶EcoR Ⅰ組成的雙酶切組合EcoR Ⅰ/MspⅠ和EcoR Ⅰ/HpaⅡ進行酶切。30 μL酶切體系中含有10 μL基因組DNA(60 ng/μL)，1 μLEcoR Ⅰ(15 U/μL)，1 μLMspⅠ或HpaⅡ (10 U/μL)，3 μL 10×T Buffer，3 μL 0.1% BSA，12 μL ddH2O。酶切體系置于37 ℃酶切5 h，70 ℃ 15 min，然后于-20 ℃保存?zhèn)溆没蛑苯佑糜谶B接。30 μL連接體系含有酶切產(chǎn)物12.5 μL，50 μmol/LEcoR Ⅰ接頭1和接頭2各1 μL，50 μmol/LMspⅠ/HpaⅡ接頭1和接頭2各1 μL，T4連接酶1 μL (5 U/μL)，10×T4Buffer 3 μL，ddH2O 9.5 μL。連接體系于4 ℃ 連接過夜。

表1 MSAP分析中的接頭和擴增引物序列Tab.1 Sequences of adapters and primers used for MSAP analysis

1.3.3 連接產(chǎn)物預(yù)擴增 連接產(chǎn)物稀釋10倍用于預(yù)擴增反應(yīng)。30 μL預(yù)擴增體系含有稀釋10倍的連接產(chǎn)物5.0 μL，預(yù)擴增引物1 和引物2 各1.5 μL，Taq酶0.3 μL (5 U/μL)，10×PCR Buffer 3 μL，2.5 mmol/L dNTP 2.5 μL，ddH2O 16.2 μL。預(yù)擴增在EDC-810型基因擴增儀進行。擴增程序為：預(yù)變性94 ℃ 1 min；然后94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min。反應(yīng)結(jié)束后，取8 μL擴增產(chǎn)物于0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，若產(chǎn)生均勻彌散的帶型則符合條件，可用于下一步的選擇性擴增反應(yīng)，根據(jù)彌散的亮度確定稀釋的倍數(shù)，通常稀釋50倍。PCR產(chǎn)物 -20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 選擇性擴增 選擇性擴增體系30 μL，含有稀釋50倍的預(yù)擴增產(chǎn)物5.0 μL，分別采用16種選擇性引物組合，每個組合的成對擴增引物(表1中Primer 3～6，Primer 7～10)各1.5 μL，體系其余組分與預(yù)擴增體系相同。擴增程序為：94 ℃ 1 min；94 ℃ 30 s，65 ℃(每個循環(huán)遞減1 ℃)，72 ℃ 1 min，10個循環(huán)；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，25個循環(huán)；72 ℃ 10 min。 PCR產(chǎn)物 -20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.5 電泳與銀染檢測 取選擇性擴增產(chǎn)物8.0 μL，用6%聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染顯色，然后觀察、記錄并拍照。

1.3.6 MSAP 差異條帶統(tǒng)計與甲基化位點分析 將在凝膠上顯示清晰的電泳條帶進行統(tǒng)計，對于各材料在同一位點有帶則記為“+”，無帶則記為“-”，記錄所有引物組合的帶型以及不同帶型出現(xiàn)的數(shù)量，用于計算分析。具體如下：

甲基化敏感擴增多態(tài)性(MSAP)是在片段長度擴增多態(tài)性(AFLP) 技術(shù)的基礎(chǔ)上經(jīng)過改進的方法，常用到的2組雙酶切組合為EcoR Ⅰ/MspⅠ、EcoR Ⅰ/HpaⅡ。MspⅠ和HpaⅡ都能識別CCGG序列，但是對胞嘧啶甲基化的敏感程度不同。MspⅠ對雙鏈內(nèi)甲基化(CmCGG)序列具有活性而對外甲基化(mCCGG) 序列敏感，HpaⅡ?qū)Π爰谆蛄?即單鏈甲基化序列)具有活性而對全甲基化序列(即雙鏈甲基化序列)敏感。對于基因組中任意一個CCGG位點，MSAP分析中EcoR Ⅰ/MspⅠ(E+M)和EcoR Ⅰ /HpaⅡ(E+H)2種酶切組合中可能出現(xiàn)的譜帶一共有4種類型：Ⅰ、E+M和E+H 2種酶切都有帶，表明該CCGG位點為非甲基化位點(圖1，類型A)；Ⅱ、E+M酶切有帶而E+H酶切無帶，表明該CCGG位點胞嘧啶發(fā)生了雙鏈內(nèi)甲基化，即全甲基化(圖1，類型B)；Ⅲ、E+M酶切中無帶而E+H酶切中有帶，表明該CCGG位點胞嘧啶發(fā)生了半甲基化(圖1，類型C)；Ⅳ、E+M和E+H 2種酶切中都無帶，可能是該CCGG位點胞嘧啶發(fā)生了雙鏈外甲基化或內(nèi)側(cè)和外側(cè)胞嘧啶同時甲基化，但2種酶所不能識別的前述甲基化類型出現(xiàn)的頻率很低，因此當2種酶切均無帶時，認為不存在CCGG位點[21]。

圖1 MSAP分析中譜帶的類型

1.3.7 甲基化水平的計算與統(tǒng)計分析 全甲基化位點數(shù)(條帶數(shù))占總擴增條帶數(shù)的百分率為全甲基化百分率，用以表示全甲基化水平；半甲基化位點數(shù)(條帶數(shù))占總擴增條帶數(shù)的百分率為半甲基化百分率，用以表示半甲基化水平；全甲基化位點數(shù)與半甲基化位點數(shù)之和為總的甲基化位點數(shù)，用以表示基因組總的甲基化水平。利用SPSS 18.0軟件進行甲基化水平的方差分析、多重比較和相關(guān)分析等。

1.4 MSAP特異條帶的回收、克隆及測序

用滅菌手術(shù)刀從MSAP膠上切取特異性的條帶，放入1.5 mL離心管中，加入100 μL ddH2O，用滅菌的槍頭搗爛后沸水煮10 min，12 000 r/min離心2 min，取6 μL上清液作為PCR的模板，擴增的引物及程序與原選擇性擴增中的保持一致。所得的PCR產(chǎn)物進行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，如果是一條明亮的條帶并且大小和變性聚丙烯酰胺凝膠電泳的結(jié)果一致，則使用凝膠回收試劑盒回收并純化目的條帶，用于后續(xù)試驗。

1.5 甲基化特異片段的半定量RT-PCR表達分析

分別以提取的不同材料的總RNA為模板進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，再進行PCR擴增，引物見表2。反應(yīng)體系與擴增程序同1.3.3。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 雜種F1葉片和小穗基因組DNA甲基化水平的變化

用16對引物組合對親本及其雜種F1不同發(fā)育時期的葉片和小穗基因組DNA MSAP分析，得到親本及雜種F1不同時期的甲基化水平如圖2和表3所示。對葉片組織而言，遼粳944、藥用野生稻及雜種F1分別檢測到2 672，3 479和3 702個雙酶切條帶，觀察到全甲基化和半甲基化2種甲基化類型。而總甲基化率、全甲基化率和半甲基化率在各材料表現(xiàn)出相同的變化趨勢，即隨著生長發(fā)育的進行，從分蘗期、減數(shù)分裂期到開花期葉片基因組DNA甲基化水平呈下降趨勢(圖2-A、C、E)，且各材料全甲基化率均顯著高于半甲基化率(P=0.000)，說明雙親及雜種F1葉片基因組DNA的甲基化以全甲基化為主要形式；3個材料的總甲基化率、全甲基化率和半甲基化率的大小表現(xiàn)為雜種F1>藥用野生稻>遼粳944，但材料間差異不顯著，盡管如此，雜種F1葉片基因組DNA平均總甲基化率、全甲基化率和半甲基化率分別比栽培稻親本遼粳944高11.02%，8.56%和21.71%，比藥用野生稻分別高2.16%，1.75%和3.77%，說明雜種F1較遼粳944親本發(fā)生了更大的基因組甲基化變異，尤其表現(xiàn)在半甲基化水平。相關(guān)分析表明(表4)，雜種F1總甲基化率、全甲基化率和半甲基化率與2個親本的相應(yīng)結(jié)果呈正相關(guān)關(guān)系，其中雜種F1全甲基化率與親本遼粳944和藥用野生稻的相關(guān)系數(shù)分別為0.998和1.000，達極顯著相關(guān)水平，預(yù)示著甲基化水平具有明顯的遺傳決定趨勢。

表2 用于甲基化特異片段RT-PCR的引物Tab.2 Primers used in RT-PCR of specific MSAP segments

注：TL.分蘗期葉片；ML.減數(shù)分裂期葉片；FL.開花期葉片；MT.減數(shù)分裂期小穗；XT.小孢子時期小穗；FT.花粉成熟期小穗。表5-6、圖6同。

Note：TL.Leaf at tillering stage;ML.Leaf at meiosis stage;FL.Leaf at flowering stage;MT.Spikelet at meiosis stage；XT.Spikelet at microspore stage;FT.Spikelet at pollen matured stage. The same as Tab.5-6，F(xiàn)ig.6.

對小穗組織而言，遼粳944、藥用野生稻及雜種F1小穗DNA的MSAP分析中分別檢測到3 621，4 218，4 501個雙酶切條帶，觀察到全甲基化和半甲基化2種甲基化類型。3個材料總甲基化率、全甲基化率和半甲基化率表現(xiàn)出相同的變化趨勢，即從減數(shù)分裂期、小孢子發(fā)育期到花粉成熟期的小穗基因組DNA甲基化水平隨著發(fā)育時期的推移逐漸降低(圖2-B、D、F)，且雜種F1的甲基化水平總是介于雙親之間，表現(xiàn)為藥用野生稻>雜種F1>遼粳944的變化趨勢，其中雜種F1的平均總甲基化率、全甲基化率和半甲基化率分別為17.38%，13.67%及3.71%，相應(yīng)比栽培稻親本遼粳944分別高4.43%，1.49%和16.88%，比藥用野生稻低2.23%，0.75%和7.32%(表3)。方差分析表明，總甲基化率和全甲基化率在材料之間差異不顯著，只有半甲基化率在材料間差異顯著(P=0.015)，即雜種F1和藥用野生稻的小穗半甲基化率無顯著差異，但均顯著高于遼粳944。以上結(jié)果說明雜種F1小穗半甲基化水平較栽培稻親本遼粳944發(fā)生了更大的變異。相關(guān)分析表明(表4)，雜種F1總甲基化率、全甲基化率與2個親本呈正相關(guān)關(guān)系，其中葉片的全甲基化率與2個親本均呈顯著相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.998和1.000；而雜種小穗總甲基化率、全甲基化率和半甲基化率僅與親本遼粳944相關(guān)顯著，相關(guān)系數(shù)均為1.000。

總體來看，雜種與親本的葉片、小穗DNA甲基化水平都隨著生長發(fā)育的進行呈降低趨勢，葉片的平均甲基化水平高于小穗。與親本比較而言，雜種F1葉片和小穗甲基化水平都發(fā)生了變異，但只有小穗半甲基化水平較母本遼粳944顯著增高。所有供試材料小穗和葉片的平均總甲基化率、全甲基化率和半甲基化率之間呈顯著正相關(guān)(P≤0.001)，相關(guān)系數(shù)分別為0.930，0.970和0.857。

其中A、C、E圖分別表示葉片DNA總甲基化率、全甲基化率和半甲基化率，B、D、F圖分別表示小穗DNA總甲基化率、全甲基化率和半甲基化率。

組織Tissue材料Material檢測總位點數(shù)Locidetected總甲基化位點數(shù)No.oftotalmethylatedloci全甲基化位點數(shù)No.offullmethylatedloci半甲基化位點數(shù)No.ofhemi-methylatedloci葉片P12672482(18.18%±0.02)392(14.79%±0.02)a90(3.39%±0.00)LeafP23479654(19.76%±0.02)522(15.78%±0.02)a132(3.98%±0.00)F13702735(20.19%±0.03)584(16.06%±0.02)a151(4.13%±0.00)小穗P13621602(16.64%±0.01)487(13.47%±0.00)b115(3.18%±0.00)dSpikeletP24218749(17.78%±0.01)580(13.77%±0.01)b169(4.01%±0.00)cF14501781(17.38%±0.01)614(13.67%±0.01)b167(3.71%±0.00)c

注：P1.遼粳944;P2.藥用野生稻。表4，5、圖6同。括號外數(shù)字為甲基化位點數(shù)，括號內(nèi)數(shù)值為甲基化率±標準誤；a 表示同一材料葉片組織全甲基化水平顯著高于半甲基化水平(P=0.000)；b 表示同一材料小穗組織全甲基化水平顯著高于半甲基化水平(P=0.000)；c表示雜種F1與藥用野生稻的小穗DNA半甲基化率差異不顯著，但均顯著高于遼粳944小穗(P=0.015)。

Note：P1.Liaojing 944，P2.O.officinalis. The same as Tab.4，5,Fig.6. The figures outside the brackets were number of methylated loci，values in brackets were methylation level±standard error；a means that the full methylation level in leaf tissue of the same material was significantly higher than the hemi-methylation level(P=0.000)；b means that the full methylation level in spikelet tissue of the same material was significantly higher than the hemi-methylation level(P=0.000)；c means that there was no significant difference of hemi-methylation level between the spikelets of hybrid F1andO.officinalis，but they were significantly higher than those of the Liaojing 944 spikelet (P=0.015).

2.2 雜種F1葉片和小穗基因組DNA甲基化模式的遺傳與變異

通過與親本甲基化位點的帶型比較，雜種F1有A型、B型、C型、D型和和H型5種不同類型的甲基化位點模式(圖3，4、表5 )。其中A型為單線態(tài)甲基化模式，即父本、母本和雜種F1在相同位點出現(xiàn)相同的甲基化條帶。與單線態(tài)甲基化模式對應(yīng)的為多線態(tài)甲基化模式，包括B型、C型、D型和H型4種類型，其中在B類型中，雜種F1在親本甲基化位點的MSAP帶型與親本之一相同而與另一親本不同，稱為單親甲基化遺傳模式；在C類型中，親本之一的甲基化條帶在雜種F1中丟失，表明雜種F1在此位點發(fā)生了甲基化的變異，稱為單親甲基化變異模式；在D類型中，雜種F1的帶型與2個親本均不相同，表明雜種F1在此位點發(fā)生了甲基化變異，稱為雙親甲基化變異模式；在H類型中，雙親無CCGG位點(2種酶切組合均無帶)或其CCGG位點為非甲基化(2種酶切組合均有帶)，但雜種F1表現(xiàn)出了半甲基化或全甲基化模式，稱為超甲基化變異。

表4 雜種F1與親本甲基化率的相關(guān)系數(shù)Tab.4 Correlation coefficient of methylation levels between hybrid F1 and parents

注：TML.總甲基化率；FML.全甲基化 ；HML.半甲基化率。R指的是3個供試材料葉片和小穗甲基化率的相關(guān)系數(shù)。*和**分別表示在0.05和0.01 水平上顯著相關(guān)。

Note:TML.Total methylation level;FML.Full methylation levl;HML.Hemi-methyation level.Rmeans the correlation coefficient of methylation levels between leaf and spikelet of all experimental materials.*and**present the significant correlation at 0.05 and 0.01 levels, respectively.

其中左圖中引物組合為表1中primer3+primer8，右圖中引物組合為primer3+primer7；M表示EcoRⅠ+MspⅠ酶切組合，H表示EcoR Ⅰ+HpaⅡ組合。

The primer combination in left and right figures are primer3+primer8 and primer3+primer7，respectively; M and H represent enzyme combinations ofEcoR Ⅰ+MspI andEcoR Ⅰ+HpaⅡ，respectively.

圖3 親本及雜種F1開花期旗葉在不同引物組合的甲基化電泳條帶示例

Fig.3 A representative gel image of MSAP band of flag leaf at flowering stage

圖4 雜種F1甲基化模式的類型與比率

結(jié)果表明，雜種F1葉片和小穗基因組DNA的甲基化模式均有以上5種類型，各時期5種甲基化類型的位點總數(shù)分別為911，1 053個，且各類型所占比率在2個組織中表現(xiàn)趨勢相似，即均以B型為主要模式，占葉片和小穗甲基化位點總數(shù)的66.96% 和73.60%；其次是A型，即單線態(tài)甲基化模式，占葉片和小穗甲基化位點總數(shù)的20.20%和19.09%；C型、D型和H型只占葉片和小穗甲基化位點總數(shù)的1%～5%(表5、圖4)。在A型和B型中，雜種F1葉片和小穗組織均以全甲基化模式為主要類型 (即表5中的A1、B1和B4亞類)，與表3所示雜種的全甲基化水平顯著高于半甲基化水平的結(jié)果一致。此外，雜種F1葉片在分蘗期、減數(shù)分裂期和開花期的基因組DNA甲基化模式的位點數(shù)分別為313，298和300個，分別占葉片DNA甲基化位點總數(shù)的34.36%，32.71%和32.93%；小穗在減數(shù)分裂期、小孢子發(fā)育期和花粉成熟期的甲基化位點數(shù)分別為343，349和361個，分別占小穗DNA甲基化位點總數(shù)的32.57%，33.14%和34.28%。以上結(jié)果表明，雜種F1DNA甲基化模式受組織器官和發(fā)育時期的影響非常小。

表5 親本及雜種F1甲基化模式與檢測的位點數(shù)

注：+.在相應(yīng)酶切組合中有帶;-.在相應(yīng)酶切組合中無帶。

Note：+.There is a band in the enzyme combination；-.No band in the enzyme combination.

由圖5可見，在雜種F1DNA甲基化模式的遺傳中，A型是雜種與雙親均相同的甲基化模式，即親本單態(tài)型甲基化模式，在葉片和小穗DNA甲基化位點中分別占到20.20%和19.09%。B型、C型和D型的不同亞類分別是遺傳自雙親之一的甲基化模式，即雙親多態(tài)型甲基化模式，其中遺傳自栽培稻親本遼粳944的亞類有B1、B2、B3、C3和C4，在葉片和小穗DNA甲基化位點中分別占33.26%和32.76%，B3亞類為母本遼粳944與雜種F1均表現(xiàn)為非甲基化的位點，父本則表現(xiàn)為全甲基化或半甲基化，而C3和C4亞類中在父本藥用野生稻表現(xiàn)為全甲基化(C3)或半甲基化(C4)的位點，則在母本遼粳944和雜種F1均無CCGG位點，表明雜種F1在B3和C型的狀態(tài)為去甲基化。此外，雜種F1遺傳自父本藥用野生稻的甲基化模式有B4、B5、B6、C1和C2亞類，分別在葉片和小穗DNA甲基化位點總數(shù)中占到38.64%和44.54%，這表明在親本甲基化位點向F1的遺傳中，雜種F1更多的是遺傳了藥用野生稻親本的甲基化位點。

圖5 雜種F1甲基化模式遺傳與變異的類型及比率

雜種F1DNA甲基化模式的變異指的是在相同酶切位點雜種F1的MSAP帶型與2個親本均不相同，即D型和H型(圖5)。雜種F1葉片和小穗DNA甲基化變異的平均概率分別為7.90%和3.61%，其中D型只在極個別發(fā)育時期的葉片或小穗DNA中發(fā)生，占雜種葉片和小穗DNA總甲基化位點數(shù)的2.63%和1.71%，表現(xiàn)為無CCGG位點(表5中的D1、D5、D6、D8和D15)或去甲基化(表5中的D2、D4、D7、D9和D11)或全甲基化(D10和D12)或半甲基化(表5中的D3、D13和D14)等；而H型變異則是雜種F1在雙親非甲基化位點發(fā)生了甲基化，為新增加的甲基化位點，其甲基化狀態(tài)表現(xiàn)為全甲基化或半甲基化，在葉片和小穗組織DNA甲基化位點發(fā)生的平均概率分別為5.27%和1.90%。

2.3 甲基化特異片段序列分析與RT-PCR表達分析

從不同發(fā)育時期葉片和小穗的MSAP條帶中挑選了94個DNA甲基化特異片段用于克隆和測序，并將得到的序列在NCBI網(wǎng)站利用Blast對nr數(shù)據(jù)庫進行同源性比對，結(jié)果表明，在94個甲基化特異片段中，有38個片段的序列與已知或假定功能的基因具有同源性(表6)，這些基因的功能涉及多個方面，包括植物生長發(fā)育、生化代謝及物質(zhì)轉(zhuǎn)運相關(guān)基因(表達的蛋白如類似胚胎發(fā)生跨膜蛋白、假定β-葡萄糖苷酶、假定五肽重復(fù)包含蛋白質(zhì)、假定ABC轉(zhuǎn)運蛋白、假定蔗糖磷酸酶等)、信號傳導(dǎo)基因(表達的蛋白如鋅指蛋白)、抗非生物脅迫及生物脅迫相關(guān)基因(表達的蛋白如PHD指轉(zhuǎn)錄因子樣蛋白、假定熱休克蛋白、假定枯草桿菌蛋白酶類絲氨酸蛋白酶、假定蔗糖磷酸酶、假定植物螯合肽合成酶、絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶 PP2A-3 催化亞基等)、轉(zhuǎn)座子、反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子或反轉(zhuǎn)座子有關(guān)基因(表達的蛋白如假定轉(zhuǎn)座子蛋白、假定反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子蛋白、反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子 p-SINE1-r606等)，其中多達11個片段與轉(zhuǎn)座相關(guān)的基因具有同源性，表明轉(zhuǎn)座子相關(guān)位點是甲基化的熱點區(qū)域。

根據(jù)同源性比對的結(jié)果，挑選部分與已知或假定功能的基因具有同源性的甲基化特異片段、以其序列設(shè)計引物，并以親本及雜種相應(yīng)組織的cDNA為模板，進行甲基化特異片段的RT-PCR表達分析。結(jié)果如圖6所示，在對21個甲基化特異片段的RT-PCR表達分析中，有6個片段的同源基因表現(xiàn)出了表達的特異性。其中在葉片中，雜種F1在片段FL2的基因表達量介于雙親之間；片段FL12只在母本遼粳944中有表達，在父本和F1中未表達；片段FL14只在父本藥用野生稻中表達，在母本和F1中未表達。在小穗中，雜種F1在片段MT5、MT14、XT14的基因表達量相對于親本則明顯上調(diào)，涉及的相關(guān)同源性基因包括蔗糖磷酸酶、反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子蛋白和鋅指蛋白家族基因等。根據(jù)這些特異片段的來源情況看，F(xiàn)L2及FL14的甲基化特異片段來自藥用野生稻，RT-PCR的基因表達量在材料間趨勢不一，而且在FL2和FL14中藥用野生稻的基因表達量明顯高于栽培稻和雜種F1。盡管MT5、MT14和XT14片段的甲基化發(fā)生在雜種F1，親本在相應(yīng)位點表現(xiàn)為非甲基化或無CCGG位點，但雜種的基因表達水平卻明顯高于親本。推測藥用野生稻FL2和FL14位點、雜種F1MT5、MT14和XT14位點的甲基化可能發(fā)生在基因的非結(jié)構(gòu)區(qū)域或內(nèi)含子區(qū)，或者該位點基因的甲基化與基因表達水平關(guān)系不密切。

圖6 部分甲基化特異片段的RT-PCR結(jié)果Fig.6 RT-PCR results of some specific methylated fragments in hybrid F1 and parents

3 討論

基因組DNA甲基化現(xiàn)象在植物中普遍存在，而且有明顯的時空特異性。本研究經(jīng)過對亞洲栽培稻品種遼粳944(母本)、藥用野生稻(父本)及其雜種F1不同發(fā)育時期葉片和小穗基因組DNA甲基化遺傳與變異特性的系統(tǒng)研究，結(jié)果表明遼粳944、藥用野生稻及其雜種F1的葉片DNA平均總甲基化水平分別為18.18%，19.76%和20.19%，其小穗DNA平均總甲基化水平分別為16.64%，17.78%和17.38%，葉片DNA甲基化水平略高于小穗；各供試材料葉片和小穗基因組DNA甲基化水平的時空變化趨勢相同，即隨著生長發(fā)育的進行，總甲基化率、全甲基化率和半甲基化率均呈下降趨勢，且全甲基化率均顯著高于半甲基化率(P=0.000)，雜種小穗的半甲基化率顯著高于母本遼粳944(P=0.015)。這與前人在擬南芥[22]、水稻[16，18，23]等植物葉片在發(fā)育過程的甲基化水平的變化趨勢一致。此外，本研究中DNA甲基化水平在葉片和小穗間的組織差異性，在前人研究中也有類似表現(xiàn)，如在玉米中苞葉的甲基化水平最高、雄花穗最低，成熟葉片的甲基化水平高于種子[24]；又如高粱的雜種F1和親本胚乳的甲基化程度均顯著低于葉片[25]。推測可能是幼嫩組織處于旺盛的生長過程中，需要啟動更多基因的表達參與代謝活動，因此去甲基化程度加大，甲基化水平降低；而相對于葉片等體細胞組織，與生殖有關(guān)的組織(小穗、雌雄蕊等)表現(xiàn)較低的甲基化程度也與生殖器官的特殊功能及活躍基因表達的需要有關(guān)。

不同植物及不同交配方式產(chǎn)生后代的甲基化遺傳變異研究表明，植物DNA甲基化的遺傳與變異現(xiàn)象復(fù)雜，但具有一定的穩(wěn)定性，同時在一些雜種中甲基化受到RNA的介導(dǎo)[26]。Takamiya 等[17]利用限制性標記基因組掃描(RLGS)方法、對水稻品種Nipponbare× Kasalath 雜種F1的DNA甲基化遺傳性的研究中，親本的大多數(shù)甲基化位點能夠遺傳給雜種F1，同時存在約4%的異常傳遞，即親本甲基化位點在F1丟失即去甲基化或F1產(chǎn)生了新的甲基化位點。在外源染色體片段滲入系的研究中，Dong等[27]發(fā)現(xiàn)含有野生稻 (Zizanialatifolia) DNA 片段的栽培稻滲入系在反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子Tos17的5′-LTR區(qū)和逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)都發(fā)生了甲基化，包括親本條帶的缺失和新條帶的形成，而且這種甲基化變異穩(wěn)定遺傳到了下一代。此外，Nakamura等[28]發(fā)現(xiàn)馬鈴薯自交系(S1～S5代)的甲基化遺傳率較高。本研究中雜種F1葉片和小穗DNA的甲基化模式中遺傳自雙親的模式類型分別占20.20%和19.09%，遺傳自栽培稻親本的甲基化模式類型分別占33.26%和32.76%，遺傳自藥用野生稻的占38.64%和44.54%，雜種葉片和小穗DNA在親本甲基化位點發(fā)生變異的比率分別為7.90%和3.61%，主要表現(xiàn)為超甲基化，且半甲基化率顯著提高?？梢?，雜種葉片和小穗甲基化模式以遺傳為主，而且更多的是遺傳了藥用野生稻的甲基化位點。Jin等[19]的研究表明，栽培稻與藥用野生稻種間雜種F1開花期旗葉DNA的甲基化變異率接近7.6%，其中F190.9% 的甲基化位點變異在BC1F1得到保持。這與本研究中雜種葉片3個發(fā)育時期平均甲基化率變異率(7.90%)非常接近，可以認為栽培稻和藥用野生稻的基因組DNA甲基化具有相對較高的穩(wěn)定性，也證明了MSAP技術(shù)用于研究植物DNA甲基化的可靠性。

盡管植物DNA甲基化特異性與功能基因的關(guān)系以及對基因表達的影響是表觀遺傳研究中重要的研究領(lǐng)域之一，但目前在不同植物的研究中，主要是通過間接推測，認為基因甲基化與表型變異之間有密切關(guān)系。Akimoto等[29]則提供了直接證據(jù)，證明基因去甲基化后產(chǎn)生了表達效應(yīng)，形成了表型。他們利用氮雜脫氧胞苷處理水稻種子以去甲基，經(jīng)連續(xù)10年對處理種子后代進行種植，并接種水稻白葉枯病菌觀察發(fā)病情況及檢測基因組甲基化狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)其中1個株系Line-2表現(xiàn)了對白葉枯病的抗性，同時與野生型比較，株系Line-2的Xa21G基因啟動子發(fā)生了去甲基化，從而證明該株系的水稻白葉枯病抗性是Xa21G基因表達的結(jié)果。Zhang等[30]對不同倍性水稻的研究表明，基因啟動子區(qū)甲基化與基因表達有明確的關(guān)系，但基因結(jié)構(gòu)區(qū)甲基化與基因表達的負相關(guān)關(guān)系不明顯。Li等[31]研究表明，基因超甲基化并不一定使其基因表達水平下降。在本研究中，雜種F1甲基化特異片段MT5、MT14和XT14的RT-PCR基因表達量在3個材料間趨勢不一致，盡管MT5、MT14和XT14的甲基化發(fā)生在雜種F1，親本在相應(yīng)位點表現(xiàn)為非甲基化或無CCGG位點，但是這些位點雜種的基因表達水平卻明顯高于親本。綜合來看，基因甲基化可發(fā)生在基因特異位點，從而表現(xiàn)出與基因表達的復(fù)雜關(guān)系，需要開展不同物種及基因甲基化特點的更深入研究。

本研究對雜種及親本葉片和小穗的94個甲基化特異片段經(jīng)測序和同源性比對分析，有38個片段的序列與已知或假定功能的基因具有同源性，這些基因的功能種類涉及多個方面，包括植物生長發(fā)育、生化代謝及物質(zhì)轉(zhuǎn)運相關(guān)基因、信號傳導(dǎo)基因、抗非生物脅迫及生物脅迫相關(guān)基因、轉(zhuǎn)座子等，其中多達11個片段與轉(zhuǎn)座相關(guān)的基因具有同源性。但在小穗的甲基化特異片段序列分析中，未發(fā)現(xiàn)與育性密切相關(guān)的特異基因，可能本研究中的種間雜種F1敗育受基因組甲基化的影響較小。盡管前人在煙草、小麥、玉米等[11-12]的研究中，對花粉粒、或雄性不育系、或雄性可育雜種和雄性不育雜種的甲基化研究表明，與生殖發(fā)育及育性有關(guān)組織的DNA甲基化有一定的特異性，而且在一定程度上與基因的表達調(diào)節(jié)變化有關(guān)，但也未能明確具體的調(diào)控基因及其機理。因此，今后需要進一步開展包括水稻遠緣雜交及雜種敗育的表觀遺傳規(guī)律的研究，而且在深入開展基因組DNA甲基化研究的同時，有必要開展非編碼RNA調(diào)控和染色質(zhì)重塑等表觀遺傳機制的研究，這不僅有助于深入了解遠緣雜交引起的基因組沖突與表觀遺傳的關(guān)系，更有助于多方位了解遠緣雜種不育的形成機制，對探索克服遠緣雜種不育的有效途徑和野生種質(zhì)資源的高效利用都具有十分重要的意義。

[1] Brar D S，Khush G S. Alien introgression in rice[J]. Plant Molecular Biology，1997，35(1/2)：35-47.

[2] 何光存. 野生稻有利基因的挖掘與轉(zhuǎn)移[M].//羅利軍,應(yīng)存山,湯圣祥.稻種資源學(xué). 武漢：湖北科學(xué)技術(shù)出版社，2002：279.

[3] Jena K K，Khush G S. Introgression of genes fromOryzaofficinalisWell ex Watt to cultivated rice，O.sativaL.[J]. Theoretical and Applied Genetics，1990，80(6)：737-745.

[4] Huang Z，He G，Shu L，et al. Identification and mapping of two brown planthopper resistance genes in rice[J]. Theoretical and Applied Genetics，2001，102(6/7)：929-934.

[5] Fu X L，Lu Y G，Liu X D，et al. Cytological behavior of hybridization barriers betweenOryzasativaandOryzaofficinalis[J]. Agricultural Sciences in China，2011，10(10)：1489-1500.

[6] Li G，Tang M，Hu W，et al. Characterization of an Alien chromosome ofOryzaofficinalistransferred the genomic and cytological environment ofOryzasativa[J]. Journal of Plant Biology，2010，53(4)：306-313.

[7] Mcclintock B. The significance of responses of the genome to challenge[J]. Science，1984，226(4676)：792-801.

[8] Dong Z Y，Wang Y M，Zhang Z J，et al. Extent and pattern of DNA methylation alteration in rice lines derived from introgressive hybridization of rice andZizanialatifoliaGriseb[J]. Theoretical and Applied Genetics，2006，113(2)：196-205.

[9] Ran L P，F(xiàn)ang T T，Rong H，et al. Analysis of cytosine methylation in early generations of resynthesizedBrassicanapus[J]. Journal of Integrative Agriculture，2016，15(6)：1228-1238.

[10] Baroux C，Raissig M T，Grossniklaus U. Epigenetic regulation and reprogramming during gamete formation in plants[J]. Current Opinion in Genetics & Development，2011，21(2)：124-133.

[11] Ba Q S，Zhang G S，Niu N，et al. Cytoplasmic effects on DNA methylation between male sterile lines and the maintainer in wheat (TriticumaestivumL.) [J]. Gene，2014，549(1)：192-197.

[12] Chen B，Zhang Y，Lu Y L，et al. DNA methylation analysis of sterile and fertile CMS-C hybrids and their parents in maize[J]. Journal of Plant Biochemistry and Biotechnology，2016，25(1)：3-11.

[13] Wang W，Huang F，Qin Q，et al. Comparative analysis of DNA methylation changes in two rice genotypes under salt stress and subsequent recovery[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications，2015，465(4)：790-796.

[14] Komiya R，Ikegami A，Tamaki S，et al. Hd3a and RFT1 are essential for flowering in rice[J]. Development，2008，135(4)：767-774.

[15] Fujino K，Sekiguchi H. Site specific cytosine methylation in rice nonautonomous transposable element nDart[J]. Plant Molecular Biology，2008，67(5)：511-518.

[16] Xiong L Z，Xu C G，Saghai Maroof M A，et al. Patterns of cytosine methylation in an elite rice hybrid and its parental lines，detected by a methylation-sensitive amplification polymorphism technique[J]. Molecular & General Genetics，1999，261(3)：439-446.

[17] Takamiya T，Hosobuchi S，Noguchi T，et al. Inheritance and alteration of genome methylation in F1hybrid rice[J]. Electrophoresis，2008，29(19)：4088-4095.

[18] Sakthivel K，Girishkumar K，Ramkumar G，et al. Alterations in inheritance pattern and level of cytosine DNA methylation，and their relationship with heterosis in rice[J]. Euphytica，2010，175(3)：303-314.

[19] Jin H，Hu W，Wei Z，et al. Alterations in cytosine methylation and species-specific transcription induced by interspecific hybridization between OryzasativaandO.officinalis[J]. Theoretical and Applied Genetics，2008，117(8)：1271-1279.

[20] Murray M G，Thompson W F. Rapid isolation of high molecular weight plant DNA[J]. Nucleic Acids Research，1980，8(19)：4321-4325.

[21] Reyna-López G E，Simpson J，Ruiz-Herrera J. Differences in DNA methylation patterns are detectable during the dimorphic transition of fungi by amplification of restriction polymorphisms[J]. Molecular & General Genetics ,1997，253(6)：703-710.

[22] Finnegan E J，Peacock W J，Dennis E S. Reduced DNA methylation inArabidopsisthalianaresults in abnormal plant development[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1996，93(16)：8449-8454.

[23] 潘雅姣，傅彬英，王 迪，等. 水稻干旱脅迫誘導(dǎo)DNA甲基化時空變化特征分析[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，42(9)：3009-3018.

[24] Lu Y，Rong T，Cao M. Analysis of DNA methylation in different maize tissues[J]. Journal of Genetics and Genomics，2008，35(1)：41-48.

[25] Zhang M S，Yan H Y，Zhao N，et al. Endosperm-specific hypomethylation，and meiotic inheritance and variation of DNA methylation level and pattern in sorghum (SorghumbicolorL.) inter-strain hybrids[J]. Theoretical and Applied Genetics，2007，115(2)：195-207.

[26] Zhang Q，Wang D，Lang Z，et al. Methylation interactions inArabidopsishybrids require RNA-directed DNA methylation and are influenced by genetic variation[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2016，113(29)：E4248-E4256.

[27] Dong Y Z，Liu Z L，Dong Y S，et al. Alien DNA introgression into rice causes heritable alterations in DNA methylation patterns in an active retrotransposon Tos17[J]. Acta Botanica Sinica，2004，46(1)：100-109.

[28] Nakamura S，Hosaka K. DNA methylation in diploid inbred lines of potatoes and its possible role in the regulation of heterosis[J]. Theoretical and Applied Genetics，2010，120(2)：205-214.

[29] Akimoto K,Katakami H,Kim H J,et al.Epigenetic inheritance in rice plants[J].Annals of Botuny,2007,100(2):205-217.

[30] Zhang H Y，Zhao H X，Wu S H，et al. Global methylation patterns and their relationship with gene expression and small RNA in rice lines with different ploidy[J]. Frontiers in Plant Science，2016，7：1002.

[31] Li S，Zhu Y，Zhi L，et al. DNA methylation variation trends during the embryonic development of chicken[J]. PLoS One，2016，11(7)：e0159230.

Inheritance and Variations of DNA Methylation in Interspecific Hybrid F1BetweenO.sativaandO.officinalis

HE Ping1，SHU Mian1，CAI Xiaodan1，F(xiàn)U Xuelin2

(1.College of Life Sciences,South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China；2. College of Agriculture，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China)

Aiming to analysis the characteristics of DNA methylation during the development processes of leaf and spikelet to explore the effect of genome shock in different tissues of hybrid F1betweenO.sativaandO.officinalis，moreover，the possibility of biological effects，in this study，using the methylation sensitive amplified polymorphism technology (MSAP)，patterns and levels of global genomic DNA methylation in leaf and spikelet from parents to interspecific hybrid F1were investigated. The results showed that，the similar change trends of DNA methylation level in tissues of leaf and spikelet were observed in all the experimental materials，that is，along with the plant growth and development the DNA methylation level was on a downward trend，and the full methylation level was significantly higher than hemi-methylation level in both leaf and spikelet(P=0.000). In hybrid leaf tissue at the tillering stage, meiosis stage of pollen mother cells and flowering stage,the average total methylation level，full methylation level and hemi-methylation level was 20.19%，16.06% and 4.13%，respectively，which was higher than that of the two parents；while in hybrid spikelet tissue at the meiosis stage of pollen mother cells, microspore development stage and matured pollen grain stage,the average level of total，full and hemi-methylation was 17.38%，13.67% and 3.71%，respectively，which was higher than that of Liaojing 944 and lower thanO.officinalis. However，only hemi-methylation level of hybrid was significantly higher than Liaojing 944(P=0.015). DNA methylation patterns in leaf and spikelet were very similar in parents and hybrid. Sequence analysis of 94 differentially methylated fragments showed that 38 fragments were sequence similarity in the NCBI database. The results would be helpful for further analysis of hybrid sterility betweenO.sativaandO.officinalis.

Oryzasativa；Oryzaofficinalis；Interspecific hybrid；DNA methylation；Methylation sensitive amplified polymorphism (MSAP)

2017-06-20

廣東省自然科學(xué)基金項目(9151063201000057)；廣東省教育廳“創(chuàng)新強校工程”自主創(chuàng)新能力提升類項目(2014KTSCX032)；廣東省科技廳省級科技計劃項目(2015A030302067)；公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項子項目(201003021)；國家自然科學(xué)基金項目(31671762)

何 平(1967-)，男，安徽樅陽人，副教授，博士，主要從事生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究。

傅雪琳(1967-)，女，陜西扶風(fēng)人，教授，博士，主要從事野生稻有利基因發(fā)掘與利用研究。

S511.03

A

1000-7091(2017)04-0019-13

10.7668/hbnxb.2017.04.004