束紅梅，郭書(shū)巧，鞏元勇，蔣 璐，朱靜雯，倪萬(wàn)潮

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 經(jīng)濟(jì)作物研究所，農(nóng)業(yè)部長(zhǎng)江下游棉花與油菜重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210014)

陸地棉油菜素內(nèi)酯信號(hào)基因GhBES1家族的鑒定及表達(dá)分析

束紅梅，郭書(shū)巧，鞏元勇，蔣 璐，朱靜雯，倪萬(wàn)潮

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 經(jīng)濟(jì)作物研究所，農(nóng)業(yè)部長(zhǎng)江下游棉花與油菜重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210014)

BES1基因是植物激素油菜素內(nèi)酯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中的重要轉(zhuǎn)錄因子，為了解陸地棉油菜素內(nèi)酯信號(hào)基因GhBESI家族 ,通過(guò)對(duì)陸地棉異源四倍體標(biāo)準(zhǔn)系TM-1基因組數(shù)據(jù)庫(kù)的全面分析和鑒定，獲得21個(gè)GhBES1基因，這些基因分布在不同的亞基因組，有9對(duì)基因在A亞組和D亞組上存在對(duì)應(yīng)關(guān)系，AD亞組對(duì)應(yīng)基因序列一致性高于95%。根據(jù)進(jìn)化分析，21個(gè)GhBES1基因分為4個(gè)亞家族，除了亞家族Ⅲ，其他3個(gè)亞家族在擬南芥中均有對(duì)應(yīng)基因；除了亞家族Ⅳ基因和亞家族Ⅱ中GhBES1-1基因外，其他GhBES1基因均有2個(gè)外顯子。亞細(xì)胞定位結(jié)果表明，21個(gè)GhBES1蛋白主要定位到細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)等部位，其中7對(duì)基因的蛋白亞細(xì)胞定位完全一致。GhBES1基因在根、莖、葉、頂端分生組織中均有表達(dá)，但不同亞家族基因在不同組織中的表達(dá)水平存在差異。研究結(jié)果為棉花GhBES1基因家族功能的深入研究奠定了基礎(chǔ)。

陸地棉；GhBES1基因家族；系統(tǒng)進(jìn)化分析；基因表達(dá)

油菜素內(nèi)酯(Brassinosteroid，BR)是植物正常生長(zhǎng)發(fā)育所必需的重要植物激素，同時(shí)也參與了植物的逆境響應(yīng)[1-3]。近年來(lái)，關(guān)于油菜素內(nèi)酯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)研究已取得了突破性的進(jìn)展[4-5]，在模式植物擬南芥中已經(jīng)明確油菜素內(nèi)酯信號(hào)通路[6-9]。油菜素內(nèi)酯從受體BRI1傳遞信號(hào)給核靶基因依賴于BES1(BRI1 EMS SUPPRESSOR 1)家族的轉(zhuǎn)錄因子。

BES1是在功能增強(qiáng)型突變體BES1-D中發(fā)現(xiàn)的[10-11]，油菜素內(nèi)酯信號(hào)的傳遞最終使去磷酸化狀態(tài)的BES1/BZR1在細(xì)胞內(nèi)累積，激活油菜素內(nèi)酯信號(hào)通路下游的轉(zhuǎn)錄調(diào)控[10]。在植物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫(kù)中近80個(gè)物種存在BES1轉(zhuǎn)錄因子家族，但是每個(gè)物種BES1家族的基因數(shù)目存在差異，在模式植物擬南芥中BES1轉(zhuǎn)錄因子家族有8個(gè)成員[11-13]。研究人員通過(guò)ChIP-chip鑒定了BES1轉(zhuǎn)錄因子的靶基因，Yu等[14]鑒定的1 609個(gè)BES1靶基因中至少有250個(gè)是受油菜素內(nèi)酯調(diào)控的，這些基因參與調(diào)控生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、環(huán)境脅迫響應(yīng)以及與其他激素信號(hào)通路間的交互等過(guò)程。而且，元件序列分析證明BES1有非典型的螺旋-環(huán)-螺旋(bHLH)DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以綁定到E-盒(CANNTG)或BRRE(BR response element，CGTGT/CG)以調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)[15-16]，而B(niǎo)RRE和E-盒在油菜素內(nèi)酯誘導(dǎo)或抑制基因的啟動(dòng)子中都存在。因此，BES1轉(zhuǎn)錄因子在油菜素內(nèi)酯調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育和逆境響應(yīng)過(guò)程中起著重要作用。

陸地棉(Gossypiumhirsutum)是當(dāng)今最重要的棉花栽培品種。二倍體D亞組雷蒙德氏棉和A亞組亞洲棉測(cè)序工作的完成[17-18]，以及陸地棉遺傳標(biāo)準(zhǔn)系TM-1全基因組序列的公布[19-20]，為棉花分子生物學(xué)研究奠定了良好的基礎(chǔ)。然而，目前在基因組水平上關(guān)于棉花BES1基因家族的研究較少。因此，本研究利用生物信息學(xué)方法，分析鑒定陸地棉全基因組序列中的BES1家族基因，從基因組水平上分析BES1基因在陸地棉中的數(shù)目、序列特征、進(jìn)化與組織表達(dá)特征，為進(jìn)一步研究BES1家族成員的生物學(xué)功能奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

陸地棉異源四倍體標(biāo)準(zhǔn)系TM-1基因組數(shù)據(jù)來(lái)自南京農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳與種質(zhì)作物創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(http：//mascotton.njau.edu.cn/html/Data/Genomefhsequence/2015/05/05/16ab0945-19e9-49f7-a09e-8e956866bf.html)。

1.2GhBES1家族成員鑒定及序列分析

用HMMER及Blast程序搜索鑒定陸地棉全基因組中GhBES1家族的所有成員。用Perl程序從基因組數(shù)據(jù)庫(kù)文件Gossypium_hirsutum_v1.1.cds.fa和Gossypium_hirsutum_v1.1.pep.fa中提取GhBES1基因的CDS序列和氨基酸序列。

利用ProtParam工具(http：//web.expasy.org/protparam/)在線分析獲得陸地棉GhBES1蛋白氨基酸序列的分子量、等電點(diǎn)等信息。

1.3BES1基因的進(jìn)化和結(jié)構(gòu)分析

用GSDS(Gene structure display server，http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/index.php)繪制BES1基因結(jié)構(gòu)圖。

用DNAMAN軟件，對(duì)陸地棉BES1基因家族成員進(jìn)行序列同源性的比對(duì)，在氨基酸水平上分析他們的遺傳多樣性；使用ClustalX(1.83)軟件對(duì)氨基酸序列進(jìn)行多序列聯(lián)配，將多序列聯(lián)配的結(jié)果通過(guò)Mega 5.0軟件進(jìn)行分析，構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，采用鄰近法(Neighbor-joining，NJ)并利用Bootstrap方法進(jìn)行評(píng)估，數(shù)值設(shè)置為1 000。

1.4 亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)

利用WoLF PSORT軟件(http：//www.genscript.com/wolf-psort.html)分析氨基酸序列，進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)。

1.5GhBES1基因家族成員的表達(dá)分析

用OMIGA公司植物RNA提取試劑盒提取陸地棉根、莖、葉、頂端分生組織的總RNA。以梯度總RNA量及梯度循環(huán)數(shù)確定可區(qū)分表達(dá)強(qiáng)度差異的最佳PCR循環(huán)數(shù)。以等量總RNA進(jìn)行RT-PCR，所用引物見(jiàn)表1，擴(kuò)增產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳分離。反轉(zhuǎn)錄所用生化酶等購(gòu)自Promega公司，PCR所用酶等購(gòu)自TaKaRa公司，RNA提取過(guò)程中所需槍頭、離心管等購(gòu)自Axygen公司。

表1 引物Tab.1 PCR primers

2 結(jié)果與分析

2.1 陸地棉GhBES1基因家族鑒定及序列分析

根據(jù)已公布的BES1基因的結(jié)構(gòu)域DUF822，從陸地棉異源四倍體標(biāo)準(zhǔn)系TM-1基因組數(shù)據(jù)中共鑒定出21個(gè)GhBES1基因，根據(jù)這些基因在染色體出現(xiàn)的先后順序分別命名為GhBES1-1～GhBES1-21 (表1)。對(duì)鑒定出來(lái)的基因進(jìn)行分析，在A亞組共有10個(gè)GhBES1基因，在D亞組共有11個(gè)GhBES1基因，其中A亞組中9個(gè)基因在D亞組有對(duì)應(yīng)基因。并且在A05和D05、A11和D11這2對(duì)亞基因組中有2對(duì)GhBES1基因，其他成對(duì)的亞基因組只有1對(duì)平行同源進(jìn)化基因(表2、圖1)。基因序列一致性分析發(fā)現(xiàn)(圖1)，A、D亞組相對(duì)應(yīng)的9對(duì)基因的序列一致性高于95%。但其他GhBES1基因序列的一致性差異較大，有些基因的序列一致性只有38%。

表2 陸地棉GhBES1基因家族基本信息Tab.2 Basic information of GhBES1 gene family of upland cotton

這21個(gè)GhBES1基因的編碼區(qū)和CDS最長(zhǎng)的是GhBES1-19，最短的是GhBES1-13。除了GhBES1-3和GhBES1-13、GhBES1-9和GhBES1-19這2對(duì)基因外，其余8對(duì)基因的CDS序列長(zhǎng)度完全一致。蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析表明，21個(gè)GhBES1蛋白的氨基酸序列個(gè)數(shù)從176(GhBES1-13)～737(GhBES1-19) 不等，其中有15個(gè)蛋白的氨基酸序列集中在320個(gè)氨基酸左右；分子量最大的是83.036 kDa (GhBES1-19)，最小的是19.740 kDa(GhBES1-13)；理論等電點(diǎn)最大的是9.26(GhBES1-13)，最小的是5.39(GhBES1-17)(表2)。

2.2 陸地棉GhBES1家族基因結(jié)構(gòu)及系統(tǒng)進(jìn)化分析

基于陸地棉GhBES1基因的蛋白全長(zhǎng)序列構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖2)。對(duì)陸地棉中21個(gè)GhBES1基因和擬南芥中8個(gè)AtBES1基因進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果表明：BES1基因家族成員之間同源性變異幅度較大。按照進(jìn)化情況陸地棉中21個(gè)GhBES1基因分為4個(gè)亞家族，除了亞家族Ⅲ外，每個(gè)陸地棉GhBES1亞家族在擬南芥中均有對(duì)應(yīng)基因。亞家族Ⅰ中有6個(gè)GhBES1基因，對(duì)應(yīng)擬南芥中的AtBES1、AtBZR1、AtBEH1、AtBEH2；亞家族Ⅱ中有8個(gè)GhBES1基因，對(duì)應(yīng)擬南芥中的AtBEH3、AtBEH4；亞家族Ⅳ中有5個(gè)GhBES1基因，對(duì)應(yīng)擬南芥中的AtBMY2、AtBMY7。

對(duì)陸地棉GhBES1家族成員的基因結(jié)構(gòu)分析表明(圖2)，GhBES1基因家族大多數(shù)成員的結(jié)構(gòu)比較簡(jiǎn)單，其中亞家族Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中基因除GhBES1-1外均含有2個(gè)外顯子，亞家族Ⅳ的5個(gè)GhBES1基因含有5～12個(gè)外顯子。從基因的外顯子長(zhǎng)度(圖2、表3)看出：在10對(duì)基因中，有7對(duì)A、D亞基因組對(duì)應(yīng)的基因外顯子個(gè)數(shù)及片段大小完全一致。GhBES1-1和GhBES1-11外顯子個(gè)數(shù)相差1個(gè)，但長(zhǎng)度相同；GhBES1-3和GhBES1-13外顯子個(gè)數(shù)相同，但長(zhǎng)度存在差異；GhBES1-9和GhBES1-19的差異較大，分別含有5，12個(gè)外顯子，后者的外顯子序列長(zhǎng)度明顯長(zhǎng)于前者，而且后者的內(nèi)含子序列長(zhǎng)度達(dá)到6 842 bp。

圖1 GhBES1基因序列的一致性分析Fig.1 Analysis of sequence identities among GhBES1 genes

2.3 陸地棉GhBES1蛋白的亞細(xì)胞定位

陸地棉TM-1基因組中21個(gè)GhBES1蛋白成員的亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果表明(表2)，亞家族Ⅱ中8個(gè)GhBES1蛋白均只有1個(gè)亞細(xì)胞定位，定位到細(xì)胞核；亞家族Ⅰ中的6個(gè)蛋白和GhBES1-3、GhBES1-7、GhBES1-17共9個(gè)成員具有2個(gè)亞細(xì)胞定位，定位到細(xì)胞核、線粒體或細(xì)胞質(zhì)；亞家族Ⅳ中GhBES1-9、GhBES1-19、GhBES1-21和亞家族Ⅲ中GhBES1-13 4個(gè)成員具有3個(gè)或3個(gè)以上亞細(xì)胞定位，定位到細(xì)胞核、葉綠體、細(xì)胞質(zhì)等。9對(duì)A、D亞組對(duì)應(yīng)基因中，有7對(duì)基因具有相同的亞細(xì)胞定位。

2.4 陸地棉GhBES1基因的組織表達(dá)分析

從陸地棉GhBES1基因的4個(gè)亞家族選擇代表基因(表3中加粗的基因)進(jìn)行組織表達(dá)分析(圖3)。所選的5個(gè)代表基因在根、莖、葉、頂端分生組織中均有表達(dá)，其中GhBES1-1(亞家族Ⅱ)在根中表達(dá)量較高，GhBES1-2(亞家族Ⅰ)在葉中的表達(dá)量略低，GhBES1-3(亞家族Ⅲ)在根中的表達(dá)量較低，GhBES1-7和GhBES1-21同屬于亞家族Ⅳ，兩者在各個(gè)組織中的表達(dá)水平差異不明顯?？梢钥闯霾煌瑏喖易錑hBES1基因在各個(gè)器官中的表達(dá)有差異，推測(cè)這些GhBES1基因在各個(gè)器官中的功能可能也存在差異。

圖2 BES1基因家族的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)和基因結(jié)構(gòu)Fig.2 The phylogenetic tree and gene structure of BES1 genes

表3 陸地棉21個(gè)GhBES1基因外顯子的比較Tab.3 Comparison of exon of 21 GhBES1 genes of cotton bp

D.頂端分生組織；Y.葉片；J.莖；G.根。D.Apical meristem.Y.Leaf;J.Stem;G.Root.

3 討論

BES1基因是油菜素內(nèi)酯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中的重要基因[14-16]，但關(guān)于其在陸地棉中的情況研究較少。本研究在陸地棉異源四倍體標(biāo)準(zhǔn)系TM-1基因組數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)有21條GhBES1基因的家族成員，其中9對(duì)為A亞組和D亞組對(duì)應(yīng)基因，這與前人相關(guān)研究認(rèn)為二倍體A 組亞洲棉和D組雷蒙德氏棉基因組之間存在很強(qiáng)的共線性的結(jié)論相吻合[20-21]；9對(duì)共線性基因中，7對(duì)共線性基因的氨基酸長(zhǎng)度、結(jié)構(gòu)完全相同，并且這7對(duì)基因具有完全相同的亞細(xì)胞定位。但是除了共線性基因，其他GhBES1基因的序列相似度較低。說(shuō)明陸地棉21個(gè)GhBES1基因中有共線性基因的存在，但也有部分基因序列差異明顯。

擬南芥BES1基因家族有8個(gè)成員，其中部分成員的功能都已研究得較為清楚[7，11，22-24]。對(duì)陸地棉和擬南芥中的所有BES1進(jìn)行進(jìn)化樹(shù)分析發(fā)現(xiàn)，在陸地棉標(biāo)準(zhǔn)系TM-1基因組中鑒定的21個(gè)GhBES1基因家族成員分為4個(gè)亞家族，除了亞家族Ⅲ，其余每個(gè)亞家族在擬南芥中有同源基因，由此推測(cè)，棉花和擬南芥BES1基因家族成員在功能上可能具有一定的相似性。因此，在研究棉花GhBES1基因家族成員功能時(shí)，在一定程度上可以參考擬南芥中BES1基因的研究結(jié)果。

組織表達(dá)分析表明，TM-1全基因組中的GhBES1基因家族的代表基因在根、莖、葉和頂端分生組織中均有表達(dá)，這在一定程度上暗示棉花GhBES1基因家族多數(shù)成員可能在多個(gè)組織的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起作用，但是不同亞家族的GhBES1基因在不同組織中的表達(dá)存在差異，說(shuō)明這些BES1基因的功能可能也存在差別。

前人研究表明，油菜素內(nèi)酯信號(hào)基因BES1通過(guò)介導(dǎo)調(diào)控下游基因的表達(dá)進(jìn)而調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育和逆境響應(yīng)[7，11，22-24]。在本研究中陸地棉21個(gè)GhBES1基因中部分基因的序列結(jié)構(gòu)、組織表達(dá)存在差異，那么它們?cè)谥参锷L(zhǎng)發(fā)育、逆境響應(yīng)中哪些途徑起作用、功能存在哪些差異，還有待深入研究。

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Identification and Expression Analysis of the Brassinosteroid Signal GeneGhBES1 Family in Upland Cotton

SHU Hongmei，GUO Shuqiao，GONG Yuanyong，JIANG Lu，ZHU Jingwen，NI Wanchao

(Institute of Industrial Crops，Jiangsu Academy of Agricultural Sciences，Key Laboratory of Cotton and Rapeseed (Nanjing)，Ministry of Agriculture，Nanjing 210014，China)

BES1 gene is a major transcription factor responsible for brassinosteroid-regulated gene expression and plant growth.In order to know the family ofGhBES1 gene in upland cotton,21GhBES1 genes were identified from the genome sequence database of upland cotton (GossypiumhirsutumL.acc.TM-1).TheseGhBES1 genes were found to be distributed on different subgenomes.There were 9 pairs ofGhBES1 genes in the A and D subgenomes with one-to-one correspondence relationship，and the gene sequence identity of the correspondence genes were higher than 95%.Based on the results of phylogenetic tree，the 21GhBES1 genes could be divided into four subfamilies，and there were homologous genes ofArabidopsisthalianaL.in each subfamily，except for subfamily Ⅲ；GhBES1 genes had two exons, except for genes in subfamily Ⅳ andGhBES1-1 in subfamily Ⅱ.The result of subcellular localization indicated that 21 GhBES1 proteins were primarily located in nuclear and cytoplasmic，and 7 pairs ofGhBES1 genes had the same location.The tissue expression analysis showed thatGhBES1 genes were expressed in the leaf，root，stem and shoot apical meristem，but the expression level ofGhBES1 genes in different subfamily were different.These results provide a theoretical basis on cloning and functional research ofGhBES1 genes.

Upland cotton；GhBES1 gene family； Phylogenetic analysis；Gene expression

2017-04-16

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31201139)；國(guó)家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育項(xiàng)目(2016ZX08005-001)

束紅梅(1982-)，女，江蘇射陽(yáng)人，副研究員，博士，主要從事農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究。

倪萬(wàn)潮(1962-)，男，江蘇盱眙人，研究員，碩士，主要從事農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究。

S562；Q78

A

1000-7091(2017)04-0007-06

10.7668/hbnxb.2017.04.002