曾文滔，周建麗，趙書琴，張亞男，梅 云

研究報告

C57BL/6J 小鼠凍融IVF原核胚用于Cas9 顯微注射探討

曾文滔*，周建麗，趙書琴，張亞男，梅 云

體外受精(Invitrofertilization，IVF)與胚胎冷凍技術(shù)已廣泛應(yīng)用于不孕不育醫(yī)學、種質(zhì)資源保存、物種運輸?shù)刃袠I(yè)[1-3]，大量文獻證明冷凍胚胎的發(fā)育時期、保存時間長短對復蘇存活率、附植及產(chǎn)仔率沒有明顯的影響[4,5]，凍融自然受精原核胚很早就被用于轉(zhuǎn)基因鼠制作[6-8]，IVF受精胚凍融后用于顯微注射還鮮有報道，對小鼠基因模型構(gòu)建將有重要的實用意義。

C57BL/6(B6)小鼠一直是基因模型鼠制作的主要品系，超數(shù)排卵后自然交配獲得原核胚或早期胚胎進行基因改造[9]。隨著B6小鼠體外受精技術(shù)的完善，采用凍精(鮮精)IVF技術(shù)批量生產(chǎn)胚胎可節(jié)約大量科研經(jīng)費和時間，大型基因編輯實驗室已經(jīng)實現(xiàn)無活體雄鼠化模式(或少量)。但使用IVF獲得雙原核胚胎至少需要8 h，對后續(xù)實驗的連續(xù)性影響很大，本文針對這一關(guān)鍵點，對B6小鼠原核胚凍融后的存活率、注射存活率及2細胞發(fā)育率做了相關(guān)實驗比較，探討IVF結(jié)合胚胎冷凍技術(shù)應(yīng)用于Cas9顯微注射的可行性。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級雄性C57BL/6J小鼠，5只，10周齡，體重25～28 g；SPF級雌性C57BL/6J小鼠，40只，3～4周齡，體重11～13 g，均購自南京醫(yī)科大學實驗動物中心[SCXK(蘇)2016-0002]。雄鼠單只飼養(yǎng)，雌鼠適應(yīng)光照周期1周，飼養(yǎng)與實驗均在南京醫(yī)科大學實驗動物中心屏障環(huán)境[SYXK(蘇)2016-0016]，環(huán)境溫度20℃～26℃，濕度40%～70%，光照周期12 L:12 D,光照時間08:00～20:00。動物實驗方案經(jīng)過南京醫(yī)科大學實驗動物使用與管理委員會(IACUC)批準，并按實驗動物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。

1.2 主要耗材與儀器

1.2.1 試劑耗材

獲能液(modified Krebs Ringer bicarbonate solution，TYH)[1]；受精液(human tubal fluid,HTF)[1]；培養(yǎng)液M16(Sigma， M7292)；促卵泡液(equine chorionic gonadotr-opin，eCG；Syntex)；促排卵液(human chorionic gonad-otropin，HCG；Syntex)；石蠟油(Sigma，M8410)；35 mm培養(yǎng)皿(Corning，430165)；胚胎測試水(Water；Sigma，W1503)；注射稀釋物(Injection buffer)，溶液配制試劑全部購置于Sigma。

1.2.2 主要儀器

CO2培養(yǎng)箱(Binder);生物安全柜(Esco，class II type A2);體視顯微鏡(Olympus);冷光源(Olympus);顯微操作儀(Olympus);電動氣壓注射泵(Eppendorf);拉針儀(Sutter，P-2000);煅針儀(Narishige，MF-900);液氮罐(CBS);手術(shù)器械1套;口吸管(自制)。

1.2.3 注射物

Cas9表達質(zhì)粒(Addgene No.44758) PCR擴增獲得線性化產(chǎn)物，在體外由試劑盒T7 UltraKit (Ambion，AM1345)完成轉(zhuǎn)錄。SgRNA 的表達載體PCR擴增獲得線性化產(chǎn)物，sgRNA由試劑盒MEGAshortscript Kit (Ambion,AM1354) 在體外利用T7 RNA 聚合酶完成轉(zhuǎn)錄。Cas9 mRNA 和sgRNA 分裝，保存于-80℃冰箱[10]。

1.3 實驗方法

1.3.1 原核胚獲得

按董婉維等[1,11]方法進行超數(shù)排卵和取卵，HCG注射14 h后進行IVF，按Takeo等[1]方法進行精子采集、獲能和體外受精。

1.3.2 胚胎冷凍

1 mL凍存管加入50 μL EFS40凍存液待用，30～60枚/批移入EFS20預處理并洗滌3遍，2 min后轉(zhuǎn)入凍存管EFS40中，1 min 后投入液氮儲存，冷凍液參照梁洋等[12]方法。

1.3.3 胚胎復蘇

37℃ 預熱0.25 mol/L 與0.75 mol/L 蔗糖解凍液，凍存管取出后迅速擰開蓋子倒出液氮并靜置10 s，加入1 mL 0.75 mol/L 蔗糖解凍液輕輕吹吸，撿取胚胎后移入0.25 mol/L 蔗糖解凍液平衡3～5 min，待卵裂球恢復擴展后移入M16培養(yǎng)。

1.3.4 胞質(zhì)注射

將25 ng /μL Cas9 mRNA 和10 ng /μL sgRNA(注射稀釋物稀釋)混合，空白對照為注射稀釋物，置于冰盒上備用。室溫下50枚/批移入M2 操作液，顯微操作儀輔以電動氣壓注射泵胞質(zhì)注射Cas9樣品，目測針尖前輕微膨脹即可停止，以此反復。

1.3.5 胚胎培養(yǎng)

所有操作后的胚胎需在M16培養(yǎng)液(每滴30 μL)中洗滌3遍，再30枚/滴培養(yǎng)，14 h 后統(tǒng)計2細胞發(fā)育率。

1.3.6 形態(tài)觀察

復蘇后胚胎出現(xiàn)透明帶脫落、撕裂、胞質(zhì)溶解、萎縮、碎裂視為死亡，注射后30 min 胚胎胞質(zhì)出現(xiàn)溶解萎縮視為死亡，受精卵未發(fā)育、卵裂球不均勻計入發(fā)育率。

1.4 統(tǒng)計學方法

應(yīng)用IBM SPSS Statistics 19.0統(tǒng)計軟件進行分析，兩樣本率的比較采用χ2獨立性檢驗，以P< 0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 原核胚與2細胞胚的冷凍與復蘇效果比較

原核胚冷凍回收率為92.5%(111/120)，培養(yǎng)30 min 后存活率92.8%(100/111)。2 細胞冷凍冷凍回收率為90.5%(96/106)，培養(yǎng)30 min 后存活率為95.8%(92/96)。結(jié)果表明, 原核胚冷凍的回收率、存活率達到90.5%和95.8%。與2 細胞對照組(92.5%、92.8%)差異無顯著性(P> 0.05)。

2.2 胞質(zhì)顯微注射對凍融原核胚的影響

在室溫(23℃)下顯微注射Cas9，新鮮胚胎組存活率、發(fā)育率分別為93.6%(103/110)和98.0%(101/103)；凍融組分別為82.6%(133/161)和98.4%(62/63)；空白新鮮組分別為97.5%(39/40)和100%(39/39)；空白凍融組分別為92%(46/50)和97.8%(45/46)。新鮮組發(fā)育率為100%(44/44)，冷凍組發(fā)育率為97.3%(37/38)。凍融原核胚注射存活率與各組差異有顯著性(P< 0.05)，發(fā)育率各組差異無顯著性(P> 0.05)(表1)。

3 討論

小鼠IVF技術(shù)在小鼠擴繁，種資源保存、品系恢復等生產(chǎn)實驗中廣泛應(yīng)用，較自然交配具有受精時間統(tǒng)一、受精率高等優(yōu)點，IVF受精卵正在被越來越多的基因編輯實驗用于顯微注射。但長時間的受精過程對顯微注射及胚胎移植工作影響很大，造成工作效率低下，且原核胚的雌雄原核非常小，無法達到原核注射類的實驗要求，而原核胚復蘇后2 h雌雄原核非常接近，核腔膨大。利用胚胎冷凍技術(shù)可以自由切換原核胚的發(fā)育起始時間，根據(jù)實驗量調(diào)整復蘇數(shù)量有效的避免實驗資源的浪費。

原核胚復蘇存活率雖然與2 細胞復蘇率無顯著差異，但原核胚個體較大，完全套用2 細胞冷凍程序容易造成脫水不徹底，形成的冰晶會對胚胎造成傷害，復蘇時也無法快速恢復形態(tài)[13,14]，移入培養(yǎng)液后的滲透壓差會造成急速膨脹而死亡，原核胚冷凍復蘇過程的相關(guān)參數(shù)還需要進一步的摸索。此外，每管冷凍數(shù)目以及復蘇時槍頭口的形態(tài)、吹吸力度等操作因素對冷凍效果也有很大的影響。

近年來，基因編輯技術(shù)發(fā)展迅速，隨著Cas9技術(shù)的誕生，基因編輯技術(shù)也變得簡單易行，多數(shù)實驗經(jīng)胞質(zhì)注射就能完成基因編輯工作[15]，對胚胎的機械損傷也小。在本實驗中，冷凍后的原核胚注射質(zhì)感要差于新鮮組，分析認為可能是透明帶韌性降低，需增加穿刺力度，對胚胎造成一定擠壓，導致成活率顯著差異，另外，在本實驗中，注射樣品的不同對存活率也有一定的影響，但無顯著性差異(P>0.05)，且注射存活率均在60%以上，存活率正常[3]，注射后發(fā)育率無顯著差異。本實驗凍存組注射成活率雖然略低于新鮮組，但整體數(shù)據(jù)證明冷凍原核胚可以作為IVF胚胎顯微注射的優(yōu)化步驟，將有助于調(diào)整工作時間，促進實現(xiàn)無雄鼠化(配種籠)，減少動物飼養(yǎng)量。

表1 顯微注射后原核胚的存活率與發(fā)育率對比

注：與新鮮空白注射組相比，*P< 0.05。

Note. Compared with the injected blank fresh embryo group，*P< 0.05.

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專家問答

問：對于活體成像的定量方式，現(xiàn)有的單位是否可以簡化？比如單位面積對應(yīng)的信號強度？如何計算腫瘤特異部位和正常對照部位的熒光強度比值？我們曾經(jīng)嘗試選出一個腫瘤區(qū)域和一個背景區(qū)域，用這兩個數(shù)值的比值去代替，不知道是否合理？

答：我們可以圈選兩個ROI值(region of interest)，如果這兩個ROI值信號采集的時間是一樣的，圈選范圍的面積、大小和形狀也是一致的，那就變得簡單多了，就只需要看光子數(shù)量，也就是說可以根據(jù)光子數(shù)量代表的信號強度來直接進行這樣的量化對比。

(感謝第四軍醫(yī)大學 師長宏 教授和冷泉港生物科技股份有限公司分子影像部門副總經(jīng)理 王志宇 先生的解答)

(南京醫(yī)科大學醫(yī)藥實驗動物中心，南京 211166)

目的 探討小鼠體外受精(IVF)凍融后用于Cas9注射的可行性。方法 新鮮C57BL/6J小鼠卵子IVF后采用凍存管法(EFS20/40)冷凍原核胚(單細胞胚)和2 細胞胚胎，次日復蘇后培養(yǎng)。比較凍融原核胚和2 細胞胚胎的回收率及成活率。選取部分凍融原核胚與新鮮原核胚同時進行Cas9和稀釋液胞質(zhì)注射并培養(yǎng)至2細胞，分別比較注射后的存活率及2細胞發(fā)育率。結(jié)果 凍融后的B6小鼠原核胚的回收率為92.5%、成活率為92.8%，2細胞胚的回收率為90.5%、成活率95.8%，兩組數(shù)據(jù)差異無顯著性(P> 0.05)。新鮮原核胚Cas9注射后的存活率為92.7%，空白組注射組為97.5%，凍融原核胚Cas9注射后的存活率為82.6%，空白組為92%，凍融組Cas9注射與各組差異有顯著性(P< 0.05)，其它各組差異無顯著性(P> 0.05)。注射后的2 細胞胚發(fā)育率差異無顯著性(P> 0.05)。結(jié)論 凍融原核胚可用于Cas9顯微注射。

體外受精；受精卵；胚胎冷凍；Cas9；顯微注射

Frozen-thawed pronuclear embryos byinvitrofertilization of C57BL/6J mice can be used for Cas9 microinjection

ZENG Wen-tao*，ZHOU Jian-li , ZHAO Shu-qin, ZHANG Ya-nan, MEI Yun
(Animal Core Facility of Nanjing Medical University，Nanjing 211166，China)

Objective To verify the feasibility of Cas9 microinjection in frozen-thawed pronuclear embryos, based on the model of pronuclear embryos of C57BL/6J mice by in vitro fertilization. Methods After fertilized mouse pronuclear embryos cultured in vitro, one-cell and 2-cell embryos were frozen using EFS20/40 cryopreservation tube. The next day recovered and then cultured. The recovery rate and survival rate of the one-cell and 2-cell embryos were compared. The frozen-thawed and fresh pronuclear embryos were injected with Cas9 mixture and injection buffer into the cytoplasm, and then cultivated to 2-cell embryos,and the survival rate and development rate of the 2-cell embryos were compared. Results The recovery rate of frozen-thawed one-cell embryos was 92.5%, the survival rate was 92.8%, the recovery rate of 2-cell embryos was 90.5% and the survival rate was 95.8%, showing no significant difference. Furthermore, the survival rate of fresh one-cell embryos after Cas9 injection was 92.7%, the survival rate of one-cell embryos of the blank group was 97.5%. While the survival rate of Cas9 injected frozen-thawed one-cell embryos was 82.6%, and that of the blank group was 92%,showing a significant difference between the frozen-thawed injected group and other groups(P< 0.05).The development rate of 2-cell embryos after Cas9 injection was not significantly different. Conclusions Frozen-thawed pronuclear embryos can be used for Cas9 microinjection.

IVF; Fertilized eggs; Frozen embryos; Cas9; Microinjection

周建麗(1985-)，女，實驗師，研究方向：實驗動物與基因編輯。E-mail： zhoujianli@njmu.edu.cn

曾文滔(1987-)，男，助理實驗師，研究方向：實驗動物與生殖生理。E-mail： wentaozeng@njmu.edu.cn

R-33

A

1671-7856(2017) 08-0066-04

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.08.013

2016-12-05