鄧永東，李靜紅，陳小舉，顧永忠，呂西軍，吳學鳳，鄭 志，姜紹通，李興江

（1.合肥工業(yè)大學農產品精深加工安徽省重點實驗室，安徽合肥230009；2.中國農村技術開發(fā)中心，北京100045；3.巢湖學院，安徽巢湖238000）

熱帶假絲酵母五六碳糖共發(fā)酵產酒精研究

鄧永東1，李靜紅2，陳小舉3，顧永忠1，呂西軍1，吳學鳳1，鄭 志1，姜紹通1，*李興江1

（1.合肥工業(yè)大學農產品精深加工安徽省重點實驗室，安徽合肥230009；2.中國農村技術開發(fā)中心，北京100045；3.巢湖學院，安徽巢湖238000）

為提高酵母菌代謝木糖和葡萄糖產乙醇的效率，以木糖為底物對熱帶假絲酵母菌進行馴化培養(yǎng)。經過木糖質量濃度由20～70 g/L的遞進馴化培養(yǎng)后，對木糖的利用率提高了21.02%，混合糖的利用率達到94.21%，乙醇質量濃度為22.21 g/L，木糖醇轉化率為0.39 g/g（酵母代謝木糖的理論得率為0.46 g乙醇/g木糖，葡萄糖乙醇發(fā)酵理論得率0.51 g乙醇/g葡萄糖），其對木糖利用率效果顯著提高。木糖還原酶活性對NADPH的親和力由≤1.3 U增加到11.0 U，NADH也由≤0.2 U增長到1.4 U，木糖醇脫氫酶的活性也由322 U增長到1 534 U。同時，對馴化后的酵母菌發(fā)酵工藝進行單因素試驗和正交試驗，研究發(fā)酵時間、轉速、發(fā)酵溫度、初始pH值對發(fā)酵的影響，結果表明發(fā)酵最佳條件為發(fā)酵時間72 h，轉速140 r/min，發(fā)酵溫度36℃，初始pH值4。

酵母菌；木糖；馴化；酶活

纖維質原料是地球上最豐富的可再生資源，主要由纖維素、半纖維素和木質素構成。利用木質纖維素生物轉化生產乙醇是目前研究的熱點，而對木糖和葡萄糖的有效利用又是關鍵環(huán)節(jié)之一。我國每年可利用的纖維質原料大約為7×108t，主要來自農業(yè)、林業(yè)、工業(yè)及城市的廢棄物，這些都是酒精生產的豐富原料。隨著世界能源危機日趨惡化，利用成本低廉的纖維質原料發(fā)酵生產燃料酒精已經引起人們極大的興趣[1]。纖維素水解主要產物是六碳糖（如葡萄糖等），而半纖維素水解產物主要是五碳糖（如木糖等）。傳統(tǒng)用于酒精發(fā)酵的微生物只能利用六碳糖進行發(fā)酵，研究所用的熱帶假絲酵母CICC1779能很容易地利用葡萄糖進行酒精發(fā)酵，但不能利用木糖。充分利用纖維質原料中的木糖，可使酒精的產量在原有基礎上增加25%[2-3]。因此，對該菌株進行馴化，使其能利用五碳糖，從而能共發(fā)酵五碳糖和六碳糖生產酒精，對于實現(xiàn)纖維質原料酒精工業(yè)化生產具有重要意義。對熱帶假絲酵母進行馴化，然后對其五碳糖利用的酶活進行測定[4]，對比馴化前后的相關酶活，從而判定馴化的效果，使其能較好地利用五碳糖進行發(fā)酵，最終具有五、六碳糖共發(fā)酵的能力[5]。

五碳糖發(fā)酵機理：木糖在不同微生物細胞中主要有2種途徑被異構成木酮糖，絕大多數(shù)細菌和放線菌是通過木糖異構酶1步生成木酮糖；而在真菌和酵母菌中，木糖則通過2步氧化還原反應生成木酮糖，即木糖首先在木糖還原酶（Xylose reductase）的作用下，被還原成木糖醇，木糖醇再在木糖醇脫氫酶（Xylitol dehydrogenase）的作用下，再轉化成木酮糖。這2步反應需要輔酶I（NAD+，NADH）或輔酶II（NADP+，NADPH）的參與，然后在木酮糖激酶（Xylulose kinase）的作用下轉變成磷酸木酮糖，再經過磷酸戊糖途徑，生成中間產物3-磷酸甘油醛和6-磷酸果糖。6-磷酸果糖可以加入磷酸戊糖途徑，而3-磷酸甘油醛則經過脫羧、還原等步驟，最后轉化成乙醇[6]。

酵母菌發(fā)酵木糖生產乙醇的主要代謝過程見圖1。

圖1 酵母菌發(fā)酵木糖生產乙醇的主要代謝過程

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

熱帶假絲酵母CICC1779，合肥工業(yè)大學保藏。

1.1.2 試劑

葡萄糖（AR）、木糖（AR）、硫酸銨（AR）、KH2PO4（AR）、MgSO4·7H2O（AR）、瓊脂（BR）、蛋白胨、酵母粉、NaH2PO4（AR）、Na2HPO4（AR）。

1.1.3 培養(yǎng)基

YPD液體培養(yǎng)基（1 L）：葡萄糖20 g，蛋白胨20 g，酵母粉10 g。

葡萄糖-木糖發(fā)酵培養(yǎng)基（1 L）：葡萄糖-木糖60 g，硫酸銨5 g，磷酸二氫鉀1 g，七水合硫酸鎂0.5 g，酵母粉0.5 g。

混合糖發(fā)酵培養(yǎng)基（1 L）：葡萄糖30 g，木糖30 g，硫酸銨5 g，磷酸二氫鉀1 g，七水合硫酸鎂0.5 g，酵母粉0.5 g。

酵母馴化用固體培養(yǎng)基（1 L）：木糖20～70 g，硫酸銨5 g，尿素5 g，酵母膏2 g，牛肉粉2 g，磷酸二氫鉀2 g，七水合硫酸鎂1 g，瓊脂14 g。

1.2 儀器與設備

LY-B0.025型壓力蒸汽滅菌器，武漢市鴻雁醫(yī)療器械制造有限公司產品；AR1140/C型電子分析天平，奧豪斯（上海）公司產品；SWO-CJ-IP型超凈工作臺，蘇靜集團安泰公司產品；756MC紫外分光光度計，上海第三分析儀器廠產品；ZHP-Y2102L型智能恒溫搖床培養(yǎng)箱，上海三發(fā)科學儀器有限公司產品；FE20型實驗室pH計，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司產品；MC型酒精計，上海長城儀器廠產品；WYT-4型手持糖量計，泉州中友光學儀器有限公司產品；RE-85Z型旋轉蒸發(fā)儀，上海五相儀器儀表有限公司產品；溫度計，鄭州澤銘科技有限公司產品。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌種的活化

菌種復水活化：將保存在冰箱的熱帶假絲酵母CICC1779接種到YPD液體培養(yǎng)液中，然后將活化后的菌液接種到YPD固體培養(yǎng)基，放置在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h（溫度為30℃）；挑選培養(yǎng)基茁壯的菌落接種到新的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，重復2～3次，從而得到生長良好的菌落。

1.3.2 菌種的馴化

通過五、六碳糖分別發(fā)酵可知，該酵母菌具備對六碳糖的發(fā)酵能力，可是對五碳糖發(fā)酵效率極低。因此，需將酵母馴化為可以利用木糖發(fā)酵產酒精的酵母菌，使其成為五、六碳糖共發(fā)酵型菌株。

配制木糖固體馴化培養(yǎng)基，將菌株接入酵母木糖馴化培養(yǎng)基馴化培養(yǎng)數(shù)代，并逐步提高發(fā)酵液中的初始木糖含量，初始木糖質量濃度為20 g/L，培養(yǎng)72 h，挑選生長茁壯的菌落再接種到30 g/L的培養(yǎng)基，以此逐步增加到70 g/L。每次都挑選培養(yǎng)基中茁壯的菌落接種到新的馴化培養(yǎng)基中培養(yǎng)，不斷重復此步驟，直至得到能在木糖高質量濃度培養(yǎng)基中生長良好的菌種。

1.4 測定方法

1.4.1 粗酶液的制備

100 mL菌液30℃過夜培養(yǎng)，于4℃條件下以轉速8 000 r/min離心15 min，用pH值7.4的PBS緩沖液洗滌2次，采用20 mL pH值7.4的PBS緩沖液重懸，-20℃凍融后，超聲波破碎。破碎后離心20 min，上清液即為酶粗提液。

1.4.2 指標檢測

木糖還原酶和木糖脫氫酶活性測定參考文獻[7]，發(fā)酵液中乙醇含量測定方法參考文獻[8-9]，發(fā)酵液中殘?zhí)橇康臏y定方法參考文獻[10]。

1.5 計算方法

1.6 單因素試驗和正交試驗

選取發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、轉速、初始pH值為單因素進行各因素試驗，且在單因素的基礎上選擇發(fā)酵溫度、轉速、初始pH值進行正交試驗[11]。

正交試驗因素與水平設計見表1。

表1 正交試驗因素與水平設計

2 結果與討論

2.1 馴化后的細胞篩選

經過以木糖質量濃度20～70 g/L的遞進馴化，得到了能適應在較高木糖質量濃度的酵母菌。在70 g/L木糖質量濃度下生長茁壯的菌株挑選出來保存并進行增殖培養(yǎng)，然后進行試驗[12]。

2.2 酵母菌生長情況

2.2.1 酵母菌在葡萄糖環(huán)境下的生長情況

酵母菌在葡萄糖環(huán)境下的生長曲線見圖2。

圖2 酵母菌在葡萄糖環(huán)境下的生長曲線

由圖2可知，馴化前、后酵母菌在以葡萄糖為唯一碳源條件下生長曲線差別不大，前9 h菌體生長緩慢，處在滯后期，之后生物量急劇增加；9～14 h為對數(shù)生長期；11 h為對數(shù)生長中期，此時酵母菌代謝旺盛，活性最強；14 h之后進入穩(wěn)定期[13]。

2.2.2 酵母菌在木糖環(huán)境下的生長情況

酵母菌在木糖環(huán)境下的生長曲線見圖3。

圖3 酵母菌在木糖環(huán)境下的生長曲線

由圖3可知，馴化前、后酵母菌在以木糖為唯一碳源條件下生長曲線有明顯差異，馴化后酵母菌生長密度明顯增大，其OD值增速快、數(shù)值高，說明經過馴化后的酵母能以木糖為唯一碳源進行自身的生長繁殖[14-16]。

2.3 馴化后蛋白酶活性測定與分析

2.3.1 木糖還原酶活性

木糖還原酶的酶活力測定：取1 mL測定底物液I，加入0.1 mL酶提取液，保持30℃，于波長340 nm處掃描反應液OD值的變化速率，根據(jù)標準方程求出NADPH的氧化速率。以1 min氧化1 μmol NADPH所對應的酶量定義為1 U。

關鍵酶活見表2。

表2 關鍵酶活/U

由表2可以看出，所表達的木糖還原酶蛋白有活性，但活性較低，而且對輔酶NADPH的親和力比NADH要高。

2.3.2 木糖醇脫氫酶活性

取1 mL測定底物液Ⅱ，加入0.1 mL酶提取液，保持30℃，10 min，于波長340 nm處掃描反應液OD值的變化速率，根據(jù)標準方程求出NAD+的還原速率。以每1 min還原1 μmol NAD+所需的酶量定義為1 U。最終測得其結果為初始菌株約322 U，馴化后菌株約1 534 U。

2.4 酵母菌利用五、六碳糖發(fā)酵產酒精性能研究

2.4.1 馴化前、后酵母菌利用五碳糖發(fā)酵產酒精

初始酵母菌利用木糖生產酒精見圖4，馴化后酵母菌利用木糖生產酒精見圖5。

由圖4可以看出，初始酵母菌株對木糖的利用率很低。在48 h時，木糖利用率為41.01%，乙醇質量濃度為3.30 g/L，乙醇得率為29.81%；在96 h時，乙醇質量濃度達到最大值7.02 g/L，乙醇得率達到理論值的43.03%，木糖利用率為59.02%。

由圖5可知，馴化后酵母菌對木糖的利用情況相比馴化之前有所好轉，發(fā)酵效率大幅度提高。在48 h時，乙醇質量濃度7.02 g/L，木糖利用率62.03%，乙醇得率達到理論得率的41.01%；在96 h時，乙醇質量濃度12.96 g/L，木糖利用率80%，乙醇得率達到理論得率的58%。相比馴化之前，酵母菌對木糖的利用率提升了21.02%，乙醇質量濃度高出將近6.03 g/L。

2.5 馴化后酵母菌利用五、六碳糖發(fā)酵產酒精的最適發(fā)酵條件研究

2.5.1 發(fā)酵時間對酒精質量濃度的影響

發(fā)酵時間對酒精質量濃度的影響見圖6。

圖4 初始酵母菌利用木糖生產酒精

圖5 馴化后酵母菌利用木糖生產酒精

圖6 發(fā)酵時間對酒精質量濃度的影響

由圖6可以看出，隨著發(fā)酵時間增加，馴化前的酵母菌利用五、六碳糖共發(fā)酵產酒精的酒精質量濃度有明顯提高。在72 h時達到最高值，隨著發(fā)酵時間繼續(xù)增加，酒精質量濃度沒有明顯的變化。當發(fā)酵時間為48～72 h時，發(fā)酵時間越長，酒精質量濃度越大[17]；當發(fā)酵時間超過72 h時，發(fā)酵速度明顯降低，酒精質量濃度沒有明顯增加。因此，72 h是改良型酵母菌發(fā)酵產酒精的最佳發(fā)酵時間。此時，木糖利用率為85.01%，乙醇質量濃度為20.02 g/L，木糖醇轉化率為0.39 g/g。

2.5.2 發(fā)酵溫度對酒精質量濃度的影響

發(fā)酵溫度對酒精質量濃度的影響見圖7。

圖7 發(fā)酵溫度對酒精質量濃度的影響

由圖7可以看出，隨著發(fā)酵溫度升高，改良型酵母菌利用五、六碳糖共發(fā)酵產酒精的酒精質量濃度有明顯提高。在36℃時達到最高值，隨著發(fā)酵溫度繼續(xù)升高，酒精質量濃度有明顯降低。當發(fā)酵溫度低于36℃時，發(fā)酵溫度越高越有利于酒精發(fā)酵[18]；而發(fā)酵溫度高于36℃時，由于發(fā)酵溫度過高，會影響酒精質量濃度。因此，36℃是改良型酵母菌發(fā)酵產酒精的最適發(fā)酵溫度。此時，木糖利用率為90.02%，乙醇質量濃度為20.20 g/L，木糖醇轉化率為0.38 g/g，

2.5.3 轉速對酒精質量濃度的影響

轉速對酒精質量濃度的影響見圖8。

圖8 轉速對酒精質量濃度的影響

由圖8可以看出，隨著轉速升高，馴化前的酵母菌利用五、六碳糖共發(fā)酵產酒精的酒精質量濃度有明顯提高。在140 r/min時達到最高值，隨著發(fā)酵轉速繼續(xù)升高，酒精質量濃度明顯降低。當轉速為100～140 r/min時，轉速越高，酒精質量濃度越高；當轉速為140～180 r/min時，轉速越高越不利于酵母菌的生長，酒精質量濃度越低。因此，140 r/min是改良型酵母菌發(fā)酵產酒精的最適轉速。此時，木糖利用率為91%，乙醇質量濃度為20.30 g/L，木糖醇轉化率為0.372 g/g。

2.5.4 初始pH值對酒精質量濃度的影響

初始pH值對酒精質量濃度的影響見圖9。

圖9 初始pH值對酒精質量濃度的影響

由圖9可以看出，隨著初始pH值升高，改良型酵母菌利用五、六碳糖共發(fā)酵產酒精的酒精質量濃度有明顯提高。在初始pH值為4時達到最高值，隨著初始pH值繼續(xù)升高，酒精質量濃度明顯降低。當初始pH值低于4時，初始pH值越高越有利于酒精發(fā)酵；當初始pH值高于4時，初始pH值越高越不利于酵母菌的生長，酒精質量濃度越低。因此，初始pH值為4是改良型酵母菌發(fā)酵產酒精的最佳初始pH值。此時，木糖利用率為91.14%，乙醇質量濃度為21.20 g/L，木糖醇轉化率為0.387 g/g。

2.5.5 正交試驗

正交試驗設計與結果見表3。

表3 正交試驗設計與結果

由表3極差分析可知，3個因素對酒精質量濃度影響的主次順序為B＞A＞C，即初始pH值＞發(fā)酵溫度＞轉速。初始pH值對酒精質量濃度的影響最為顯著，pH值不僅影響細胞對營養(yǎng)物質的吸收，促進或抑制微生物的生長，還可影響環(huán)境中有害物質對微生物的毒性；影響培養(yǎng)基中某些營養(yǎng)物質的分解或中間代謝產物的解離，從而影響微生物對這些物質的利用。發(fā)酵溫度對酒精質量濃度的影響次之，發(fā)酵溫度影響了微生物細胞內生物大分子的活性。轉速對酒精質量濃度的影響最低，轉速影響了培養(yǎng)基中CO2的含量。通過極差分析得到的最佳條件為A2B2C2，即發(fā)酵溫度36℃，轉速140 r/min，初始pH值4。此時，乙醇質量濃度為22.21 g/L，木糖利用率達到94.21%，木糖醇轉化率為0.39 g/g。

3 結論

通過對馴化后的改良型酵母菌在不同環(huán)境下的生長曲線研究，在以五碳糖為唯一碳源的條件下，改良型菌株的生長情況良好，同時對馴化后的菌株進行發(fā)酵性能研究，發(fā)現(xiàn)其利用五碳糖進行發(fā)酵時，酒精產量能達到71%，木糖利用率也達到76%。研究表明，馴化后的酵母菌對五碳糖的利用率大幅度增長；并測定馴化前后木糖還原酶和木糖脫氫酶，結果木糖還原酶活性對NADPH的親和力由≤1.3 U增加到11.0 U，NADH也由≤0.2 U增長到1.4 U，木糖醇脫氫酶的活性也由322 U增長到1 534 U。通過對馴化后的改良型酵母菌五、六碳糖共發(fā)酵在不同條件下的發(fā)酵效率測定，進行單因素試驗和正交試驗。結果表明，最佳發(fā)酵條件為發(fā)酵時間72 h，發(fā)酵溫度36℃，轉速140 r/min，初始pH值4；對混合糖利用率達到94.21%，乙醇質量濃度為22.21 g/L，糖醇轉化率為0.39 g/g（酵母代謝木糖的理論得率為0.46 g乙醇/g木糖，葡萄糖乙醇發(fā)酵理論得率0.51 g乙醇/g葡萄糖）。

[1]Cai Z，Zhang B，Li Y.Engineering Saccharomyces cerevisiae for efficient anaerobic xylose fermentation：reflections and perspe ctive[J].Biotechnology Journal，2012，7（1）：34-46．

[2]張強，冀偉，王一東.五碳糖和六碳糖共發(fā)酵生產酒精菌株選育的研究進展[J].化工進展，2013（1）：151-155.

[3]高衛(wèi)華，張敏華，劉成，等.能利用五碳糖和六碳糖生產乙醇的基因工程菌菌株的構建[J].工業(yè)微生物，2004（1）：56-62.

[4]Aguilera A，Barrosj L.Surface roughness assessment on medium density fibreboard ripsawing using acoustic signals[J]. European Journal of Wood and Wood Products，2012，70（1/2/3）：369-372.

[5]Du Dai，Zhiyuan Hu，Gengqiang Pu，et al.Energy efficiency and potentials of cassava fuel ethanol in Guangxi region of China[J].Energy Conv Manag，2006，47：1 686-1 699.

[6]Arnado V.The Brazilian ethanol experiences fuelas fuel for transportation[R]．The Word Bank．Biomass Energy Workshop and Exhibition，2003.

[7]Chiotelli E，Le Meste M.Effect of small and large wheat starch granules on thermomechanical behavior of starch[J]. Cereal Chemistry，2002，79（2）：286-293.

[8]謝勇.氣相色譜法測定飲料中乙醇含量[J].分析測試技術與儀器，2002，8（1）：56-58.

[9]陳承.葡萄糖木糖混合發(fā)酵乙醇研究[D].北京：北京化工大學，2009.

[10]周穩(wěn)，付烈，王俊卿，等.重組運動發(fā)酵單胞菌發(fā)酵木糖產乙醇的研究[J].化學與生物工程，2011（5）：23-27.

[11]岳力.發(fā)酵木糖產乙醇菌株的篩選與鑒定[D].長沙：湖南農業(yè)大學，2014（6）：16-25.

[12]張倩雯，王春霞，楊麗蕓，等.影響釀酒酵母發(fā)酵過程的因素分析[J].中國釀造，2015（12）：14-19.

[13]蔡其海.小麥B、C淀粉發(fā)酵乙醇的培養(yǎng)基優(yōu)化[J].安徽化工，2013（4）：57-59.

[14]陸冬梅.酒精工業(yè)分析[M].北京：化學工業(yè)出版社，2012：15-20.

[15]張軍合，饒平凡，張利真，等.小麥B淀粉酒精發(fā)酵工藝研究[J].食品科技，2015（7）：268-272.

[16]袁麗婷.玉米秸稈發(fā)酵生產乙醇的工藝研究[J].安徽農業(yè)科學，2009（3）：922-925.

[17]李海明，李瑞美，潘世明，等.木薯淀粉生產酒精的發(fā)酵工藝研究[J].福建農業(yè)學報，2013（6）：593-596.

[18]趙銀峰.小麥酒精發(fā)酵新工藝的研究[D].鄭州：鄭州大學，2005.◇

Study of Candida Tropicalis Co-fermenting Ethanol Using Glucose and Xylose

DENG Yongdong1，LI Jinghong2，CHEN Xiaoju3，GU Yongzhong1，LV Xijun1，WU Xuefeng1，ZHENG Zhi1，JIANG Shaotong1，*LI Xingjiang1
（1.Key Laboratory of Intensive Processing of Agricultural Products in Anhui Province，Hefei University of Technology，Hefei，Anhui 230009，China；2.China Rural Technology Development Center，Beijing 100045，China；3.Chaohu College，Chaohu，Anhui 238000，China）

In order to improve the efficiency of xylose and glucose production by yeast，xylose is used as a substrate to cultivate Candida tropicalis.In the process of tame culture，the xylose concentration changed from 20～70 g/L，the xylose utilization rate increases by 21.02%，The utilization ratio of mixed sugar reach 94.21%，the ethanol content reach 22.21 g/L，and the sugar alcohol conversion rate reach 0.39 g/g（the theoretical yield of yeast xylose metabolism is 0.46 g ethanol/g xylose，glucose ethanol fermentation theoretical yield 0.51 g ethanol/g glucose）.The xylose reductase activity is also increased from≤1.3 U to 11.0 U affinity for NADPH，and NADH is increased from≤0.2 U to 1.4 U，and the activity of xylose dehydrogenase increased from 322 U to 1 534 U.The single factor and orthogonal experiments are carried out on the fermentation process of the domesticated yeast.The effects of fermentation time，rotational speed，fermentation temperature and nitial pH are studied.The results show that the optimum conditions are as follows：the fermentation time is 72 h，the rotational speed is 140 r/min，the fermentation temperature is 36℃，and the initial pH is 4.

yeast；xylose；domestication；enzyme activity

TQ223

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.08.001

1671-9646（2017）08a-0001-05

2017-06-14

安徽省重大科技專項“利用次淀粉漿廢液發(fā)酵酒精資源綜合利用的關鍵技術研究及產業(yè)化”（15CZZ03100）。

鄧永東（1992—），男，碩士，研究方向為發(fā)酵工程。

*通訊作者：李興江（1978—），男，博士，副教授，研究方向為發(fā)酵工程。