王嘉君， 劉 青， 馮施施， 馮志玲， 阮永明， 翁雪香

(浙江師范大學 化學與生命科學學院,浙江 金華 321004)

基于摻氮碳量子點與Fe3+納米開關的抗壞血酸熒光傳感器*

王嘉君， 劉 青， 馮施施， 馮志玲， 阮永明， 翁雪香

(浙江師范大學 化學與生命科學學院,浙江 金華 321004)

以殼聚糖為前驅體，在較低溫度下通過水熱法一步合成了摻氮碳量子點(N-FCDs)，合成得到的N-FCDs具有良好的水溶性、pH穩(wěn)定性及優(yōu)良的熒光特性.實驗表明：Fe3+能猝滅N-FCDs 溶液的熒光，靈敏度高且選擇性好；當還原性的抗壞血酸加入熒光猝滅的Fe3+-N-FCDs體系后，體系猝滅的熒光因Fe3+的還原反應又得以恢復.由此，可實現(xiàn)對抗壞血酸的靈敏檢測，檢測的線性范圍為1～200 μmol/L，檢出限為0.06 μmol/L.此外，F(xiàn)e3+-N-FCDs的抗干擾能力強，可實現(xiàn)維生素C藥片中抗壞血酸含量的檢測，檢測結果令人滿意.

傳感器；摻氮碳量子點；鐵離子；熒光開關；抗壞血酸

抗壞血酸(ascorbic acid，AA)，又名維生素C，是一種重要的抗氧化劑，在人類的飲食平衡中起著重要的作用，且廣泛使用于感冒、精神病、不孕、艾滋病和癌癥等疾病的預防和治療中[1].因此，在環(huán)境、醫(yī)藥、食品等行業(yè)中實現(xiàn)抗壞血酸的靈敏及選擇性地檢測具有重要意義.目前，檢測抗壞血酸常用的方法有：酶分析法[2-4]、色譜分析法[5-7]、電化學分析法[8-13]及熒光分析法[14-15]等.其中，熒光分析法具有靈敏度高、響應線性范圍寬和檢測限低等優(yōu)點.

在熒光分析法中，合成熒光強及性能穩(wěn)定的熒光探針對實現(xiàn)高靈敏度的分析檢測尤為重要.近年來，碳家族中的新成員——碳量子點(carbon-based nanodots，CDs)在分析檢測領域引起了廣泛關注.CDs是2004年文獻[16]報道的在分離和純化單壁碳納米管時意外發(fā)現(xiàn)的一種光致發(fā)光的納米顆粒，由于它具有合成方法簡單、原材料來源豐富、成本低、發(fā)光穩(wěn)定、熒光壽命長及生物相容性好等優(yōu)異的特性，目前已廣泛應用于熒光識別探針和生物樣品檢測領域[17-20].文獻[21]發(fā)現(xiàn)，石墨烯量子點的熒光被銅離子猝滅后又能在抗壞血酸存在下恢復，從而建立了抗壞血酸的熒光開關分析方法.最近，科學家們發(fā)現(xiàn)化學摻雜能通過完善CDs的缺陷從而提高其各方面的性能[22].如文獻[23]采用海藻酸鈉和色氨酸為碳源合成了氮摻雜的碳顆粒，認為空間效應和氫鍵作用使抗壞血酸能直接猝滅碳顆粒的熒光，從而實現(xiàn)抗壞血酸的檢測.采用單一碳源合成摻氮碳量子點并采用熒光開關方式快速檢測抗壞血酸的方法尚未見報道.

本文采用無生物毒性且自帶氮源的殼聚糖,通過一步水熱法合成了摻氮碳量子點(N-FCDs),合成過程綠色環(huán)保、簡單易行，得到的N-FCDs生物相容性好、熒光性能穩(wěn)定.本文還考察了該材料對常見金屬離子的響應，發(fā)現(xiàn)Fe3+能選擇性地猝滅N-FCDs的熒光[24]；當還原劑抗壞血酸加入Fe3+-N-FCDs體系后，由于三價鐵離子的還原反應，使得體系的熒光恢復，從而可實現(xiàn)對抗壞血酸的選擇性檢測，線性范圍為1～200 μmol/L，檢測限為0.06 μmol/L.此外，F(xiàn)e3+-N-FCDs抗干擾能力強，可實現(xiàn)維生素C藥片中抗壞血酸含量的檢測，檢測結果令人滿意.

1 實驗過程

1.1 N-FCDs的合成

首先，將0.075 g殼聚糖溶于20 mL 2.5%乙酸溶液中[25].隨后，將溶液轉入體積為50 mL聚四氟乙烯內(nèi)膽的不銹鋼反應釜中，于烘箱中200 ℃加熱4 h后冷卻至室溫.最后，將反應得到的黃色溶液用0.22 μm濾膜過濾除去較大的顆粒后，用分子量為1 000 Da的透析袋透析24 h以除去未反應的反應物.

1.2 產(chǎn)物的表征

產(chǎn)物的形貌采用JEM-2100F型透射電子顯微鏡(TEM)測定，加速電壓為200 kV.產(chǎn)物的構成性能采用Kratos Axis型X射線光電子能譜儀(XPS)測定，以Al Kα X射線作為激發(fā)光源.熒光檢測由Perkin Elmer公司的LS-55型熒光儀完成.紫外可見吸收采用Perkin Elmer公司的Lambda 950光譜儀測定.pH值由PHS-3C pH計測得.

1.3 抗壞血酸對Fe3+-N-FCDs的熒光響應

將20 μL N-FCDs溶液和10 mL含有200 μmol/L Fe3+的醋酸鈉-醋酸緩沖溶液(pH=4.0)在室溫下混合，再加入不同濃度的抗壞血酸.放置5 min后，以325 nm為激發(fā)波長記錄各物質(zhì)的熒光發(fā)射光譜.在抗壞血酸的選擇性測量中，將抗壞血酸替換成可能的干擾物質(zhì)，所有可能的干擾物質(zhì)的濃度均為50 μmol/L，測量條件同上.

1.4 維生素C片中抗壞血酸的檢測

研磨0.1 g維生素C片(浙江瑞新藥業(yè)股份有限公司)于20 mL去離子水中，得到維生素C分散液，10 000 r/min離心20 min后，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，收集上清液.將制得的上清液用醋酸鈉-醋酸緩沖溶液(pH=4.0)稀釋10倍后備用.檢測時，將20 μL N-FCDs分散液和10 mL含有200 μmol/L Fe3+和100 μL稀釋后的抗壞血酸樣品的醋酸鈉緩沖液混合，室溫下反應5 min后，測量并記錄溶液的熒光光譜.

2 實驗結果及分析

2.1 N-FCDs的光譜性質(zhì)和表征

圖1為N-FCDs形成及其檢測抗壞血酸的示意圖.由圖1可知:溶解于乙酸溶液的殼聚糖，在高溫高壓過程中殼聚糖斷裂、脫水、碳化及成核，從而形成發(fā)藍色熒光的N-FCDs(以硫酸奎寧為標準，熒光量子產(chǎn)率為24.5%，λex=325 nm);由于Fe3+與N-FCDs的親和作用，使得N-FCDs的熒光猝滅;當加入還原性的抗壞血酸時，F(xiàn)e3+被還原，使體系的熒光恢復.

圖1 N-FCDs的制備過程及抗壞血酸檢測的示意圖

圖2是N-FCDs的透射電子顯微照片，可見所制備的N-FCDs在水中具有良好的分散性.圖3為N-FCDs的粒徑分布直方圖，其主要粒徑分布在20 nm附近.

圖2 N-FCDs的透射電子顯微圖

圖3 N-FCDs的粒徑分布圖

(a)紫外吸收、激發(fā)和發(fā)射光譜 (b)不同激發(fā)波長下的熒光發(fā)射光譜圖4 N-FCDs的紫外-可見吸收光譜和熒光光譜圖

發(fā)射峰；當激發(fā)波長從315 nm變化到365 nm時，N-FCDs的最大發(fā)射峰從400 nm紅移到434 nm.這種依賴激發(fā)波長的熒光性能，可能與N-FCDs表面所帶的基團有關.水熱碳化過程中，大量的官能團，如羧基和氨基，在N-FCDs表面上形成不同的缺陷，這些缺陷作為激發(fā)能量陷阱，從而形成不同的熒光性質(zhì).也可能與碳量子點的尺寸有關.這種激發(fā)波長依賴的熒光特征也是目前報道的多數(shù)碳量子點的熒光特征[28-29].

圖5 N-FCDs的紅外光譜圖

明,N-FCDs表面存在大量的羥基和氨基.這也是N-FCDs在水中具有良好的分散性的原因[30].

圖6 N-FCDs的X射線光電子能譜圖

2.2 反應條件對熒光強度的影響

本實驗對制備N-FCDs的反應條件如殼聚糖的濃度、反應溫度和反應時間等做了優(yōu)化.如圖7(a)所示:殼聚糖的濃度增加到3.75 mg/mL時，合成的N-FCDs的熒光強度最大；但進一步增加殼聚糖的濃度，其熒光強度反而下降，這可能是由于高濃度的殼聚糖使生成的N-FCDs顆粒團聚從而導致其熒光強度降低[32].將殼聚糖溶液在不同溫度(140～220 ℃)下加熱4 h，得到不同溫度下的N-FCDs.如圖7(b)所示：隨著反應溫度的不斷上升，合成的N-FCDs熒光強度明顯增大；當溫度高于190 ℃時，其熒光強度增加緩慢；當溫度達到200 ℃時，N-FCDs的熒光強度達到最大值并相對穩(wěn)定.因此，200 ℃是最佳的反應溫度.反應時間的優(yōu)化是提高N-FCDs熒光強度的關鍵.如圖7(c)所示：當反應時間為240 min時，N-FCDs的熒光強度最大；隨著反應時間的延長，導致N-FCDs聚集，從而導致其熒光強度減弱.因此，優(yōu)化后合成N-FCDs的反應時間為4 h.

(a)殼聚糖濃度 (b)反應溫度 (c)反應時間 圖7 制備N-FCDs的反應條件優(yōu)化

在熒光傳感器中，復雜環(huán)境條件下的熒光納米粒子的穩(wěn)定性是一個關系到該納米粒子能否進一步在實際檢測中應用的重要問題.因此，本實驗考察了溶液的pH及鹽度等環(huán)境條件對N-FCDs熒光強度的影響.實驗發(fā)現(xiàn)，當溶液pH值從2變化到10時(見圖8(a))，N-FCDs的熒光強度基本保持不變.此外，在不同濃度的NaCl溶液中，N-FCDs 的熒光強度也幾乎保持不變(見圖8(b)).表明制備的N-FCDs可適用于復雜條件下的傳感器分析.

為了考察N-FCDs對不同金屬離子的響應，本實驗在熒光強度較高的N-FCDs溶液中加入相同濃度的不同的金屬離子，如Fe3+,Fe2+,Cu2+,Hg2+,Al3+,Cd2+,Na+,K+,Mn2+,Ba2+,Ni2+,Mg2+,Co2+,Ca2+,Pb2+和Zn2+等，在激發(fā)波長為325 nm時，這些常見金屬離子對N-FCDs熒光強度的響應如圖9所示.可見，與空白對照及其他離子相比，F(xiàn)e3+可高效猝滅N-FCDs的熒光.該熒光淬滅可歸因于N-FCDs表面的N和O對Fe3+有很強的親和力，致使N-FCDs團聚，進而發(fā)生熒光猝滅.另外，該猝滅過程也可能是Fe3+與N-FCDs

(a)pH的影響 (b)NaCl濃度的影響圖8 溶液的pH及鹽度對N-FCDs熒光強度的影響

cB=200 μmol/L;醋酸鈉-醋酸緩沖液，pH=4圖9 不同金屬離子對N-FCDs熒光強度的響應

之間發(fā)生了非輻射電子轉移[27].

合適的Fe3+濃度對建立高靈敏度的抗壞血酸傳感器至關重要.過高濃度的Fe3+影響抗壞血酸的檢測限，而過低濃度的Fe3+又直接影響抗壞血酸的檢測范圍.如圖10(a)所示，隨著Fe3+濃度的增加，N-FCDs的熒光強度逐漸減弱.當熒光淬滅程度達到94.8%時，F(xiàn)e3+濃度為200 μmol/L(見圖10(b)).因此，后續(xù)實驗中Fe3+濃度定為200 μmol/L.

2.3 抗壞血酸的檢測

(a)Fe3+濃度對N-FCDs熒光強度的影響(λ激發(fā)=325 nm) (b)熒光強度與Fe3+濃度的響應關系 圖10 Fe3+濃度對抗壞血酸傳感器靈敏度的影響

圖11(a)顯示了抗壞血酸的開關熒光響應，由此可知：不含F(xiàn)e3+的N-FCDs溶液在404 nm波長處展現(xiàn)出較強的熒光發(fā)射性能；當在該溶液中加入200 μmol/L Fe3+時，溶液的熒光強度明顯減弱；而當還原性的抗壞血酸(500 μmol/L)加入到混合液中時，由于Fe3+與抗壞血酸發(fā)生氧化還原反應，使Fe3+轉化為Fe2+而從N-FCDs表面脫離，從而使體系的熒光恢復到最大值的93%.

圖11(b)是Fe3+(200 μmol/L)-N-FCDs體系中加入不同濃度的抗壞血酸(0～500 μmol/L)后溶液的熒光強度變化.如圖11(b)所示，隨著抗壞血酸濃度的增加，體系的熒光強度不斷增大.當抗壞血酸濃度為1～200 μmol/L時，與F/F0呈線性關系(見圖11(c))，線性方程為

Y=0.052 81x+1.136 87(R=0.997 7).

在信噪比為3的條件下，抗壞血酸的檢測限為0.06 μmol/L.

為了考察其他干擾物對Fe3+-N-FCDs體系檢測抗壞血酸的影響，在相同的實驗條件下，分別測試了牛血清白蛋白(BSA)、賴氨酸(Lys)、谷胱甘肽(GSH)、葡萄糖(Glu)、甘氨酸(Gly)、半胱氨酸(Cys)、多巴胺(DA)、尿酸(UA)和過氧化氫等物質(zhì)對Fe3+-N-FCDs體系熒光強度的影響，實驗結果如圖11(d)所示.可以看出，與空白樣品相比，加入抗壞血酸的樣品熒光恢復程度遠超出加入其他物質(zhì)的熒光恢復程度.表明Fe3+-N-FCDs體系對抗壞血酸的檢測有良好的選擇性.

圖11 Fe3+-N-FCDs體系檢測抗壞血酸

2.4 維生素C片中抗壞血酸的檢測

為了評估此方法是否可用于實際樣品中抗壞血酸的檢測，本實驗用醋酸緩沖液將維生素C片中的抗壞血酸稀釋10倍后，在樣品液中加入標準抗壞血酸溶液(50，100，150 μmol/L)測定其回收率，結果如表1所示，樣品的加標回收率為96.9%～106%，表明該傳感器適合于實際樣品的分析.

表2從線性范圍和檢測限方面比較了本文制作的傳感器與文獻已報道的其他傳感器的性能，可知本文傳感器對抗壞血酸的分析性能相當或略優(yōu)于其他傳感器.

表1 維生素C藥片中抗壞血酸的加標回收率

注：回收率=100%×(加標后濃度-加標前濃度)/加標量.

表2 不同方法檢測抗壞血酸的檢出限比較

3 結 論

本文以殼聚糖為前驅體一步合成了N-FCDs，采用Fe3+-N-FCDs體系，將熒光納米材料獨特的光學性質(zhì)和其對金屬離子的選擇性及抗壞血酸的還原性結合起來，從而實現(xiàn)了對抗壞血酸的快速、簡單檢測，檢測的靈敏度高、選擇性好.另外，F(xiàn)e3+-N-FCDs體系還可應用于實際樣品維生素C藥片中抗壞血酸的檢測，檢測結果令人滿意，在臨床中具有潛在的應用價值.

[1]Du J,Cullen J J,Buettner G R.Ascorbic acid:Chemistry,biology and the treatment of cancer[J].Biochim Biophys Acta,2012,1826(2):443-457.

[2]Melino V J,Soole K L,Ford C M.A method for determination of fruit derived ascorbic,tartaric,oxalic and malic acids and its application to the study of ascorbic acid catabolism in grapevines[J].Aust J Grape Wine R,2009,15(3):293-302.

[3]Shekhovtsova T N,Muginova S V,Luchinina J A,et al.Enzymatic methods in food analysis:Determination of ascorbic acid[J].Anal Chim Acta,2006,573:125-132.

[4]Li Fengxia,Wu Hongjuan,Cui Miao,et al.L-ascorbic acid biosensing assay from enzyme-immobilized pig bladder membrane as a novel platform[J].Anal Methods,2013,5(5):1253-1258.

[5]León-Ruiz V,Vera S,González-Porto A V,et al.Analysis of water-soluble vitamins in honey by isocratic RP-HPLC[J].Food Anal Methods,2013,6(2):488-496.

[6]Matei N,Radu G L,Truica G,et al.Rapid HPLC method for the determination of ascorbic acid in grape samples[J].Anal Methods,2013,5(18):4675-4679.

[7]Szultka M,Buszewska-Forajta M,Kaliszan R,et al.Determination of ascorbic acid and its degradation products by high-performance liquid chromatography-triple quadrupole mass spectrometry[J].Electrophoresis,2014,35(4):585-592.

[8]Lawal A.Synthesis and utilisation of graphene for fabrication of electrochemical sensors[J].Talanta,2015,131:424-443.

[9]Sanghavi B J,Wolfbeis O S,Hirsch T,et al.Nanomaterial-based electrochemical sensing of neurological drugs and neurotransmitters[J].Mikrochim Acta,2015,182(1/2):1-41.

[10]Mirzaei M,Sawan M.Microelectronics-based biosensors dedicated to the detection of neurotransmitters:A review[J].Sensors,2014,14(10):17981-18008.

[11]Zhang L,Wang J,Tian Y.Electrochemical in-vivo sensors using nanomaterials made from carbon species,noble metals,or semiconductors[J].Microchim Acta,2014,181(13):1471-1484.

[12]Wu S,He Q,Tan C,et al.Graphene-based electrochemical sensors[J].Small,2013,9(8):1160-1172.

[13]Chen A,Chatterjee S.Nanomaterials based electrochemical sensors for biomedical applications[J].Chem Soc Rev,2013,42(12):5425-5438.

[14]Zhai W,Wang C,Yu P,et al.Single-layer MnO2nanosheets suppressed fluorescence of 7- hydroxycoumarin:Mechanistic study and application for sensitive sensing of ascorbic acid in vivo[J].Anal Chem,2014,86:12206-12213.

[15]Ma Q,Li Y,Lin Z H,et al.A novel ascorbic acid sensor based on the Fe3+/Fe2+modulated photoluminescence of CdTe quantum dots@SiO2nanobeads[J].Nanoscale,2013,5(20):9726-9731.

[16]Xu X,Ray R,Gu Y,et al.Electrophoretic analysis and purification of fluorescent single-walled carbon nanotube fragments[J].J Am Chem Soc,2004,126(40):12736-12737.

[17]Lim S Y,Shen W,Gao Z.Carbon quantum dots and their applications[J].Chem Soc Rev,2015,44(1):362-381.

[18]Li H,Chen L,Wu H,et al.Ionic liquid-functionalized fluorescent carbon nanodots and their applications in electrocatalysis,biosensing,and cell imaging[J].Langmuir,2014,30(49):15016-15021.

[19]Guo Y,Zhang L,Zhang S,et al.Fluorescent carbon nanoparticles for the fluorescent detection of metal ions[J].Biosens Bioelectron,2015,63:61-71.

[20]Jahanbakhshi M,Habibi B.A novel and facile synthesis of carbon quantum dots via salep hydrothermal treatment as the silver nanoparticles support:Application to electroanalytical determination of H2O2in fetal bovine serum[J].Biosens Bioelectron,2016,81:143-150.

[21]Liu Jingjing,Chen Zhitao,Tang Duosi,et al.Graphene quantum dots-based fluorescent probe for turn-on sensing of ascorbic acid[J].Sens Actuators B:Chemical,2015,212:214-219.

[22]Jahan S,Mansoor F,Naz S,et al.Oxidative synthesis of highly fluorescent boron/nitrogen co-doped carbon nanodots enabling detection of photosensitizer and carcinogenic dye[J].Anal Chem,2013,85(21):10232-10239.

[23]Zhu X,Zhao T,Nie Z,et al.Non-redox modulated fluorescence strategy for sensitive and selective ascorbic acid detection with highly photoluminescent nitrogen-doped carbon nanoparticles via solid-state synthesis[J].Anal Chem,2015,87(16):8524-8530.

[24]Lai T,Zheng E,Chen L,et al.Hybrid carbon source for producing nitrogen-doped polymer nanodots:One-pot hydrothermal synthesis,fluorescence enhancement and highly selective detection of Fe(Ⅲ)[J].Nanoscale,2013,5(17):8015-8021.

[25]Yang Y,Cui J,Zheng M,et al.One-step synthesis of amino-functionalized fluorescent carbon nanoparticles by hydrothermal carbonization of chitosan[J].Chem Commun,2012,48(3):380-382.

[26]Yang X,Zhuo Y,Zhu S,et al.Novel and green synthesis of high-fluorescent carbon dots originated from honey for sensing and imaging[J].Biosens Bioelectron,2014,60:292-298.

[27]Li W,Zhang Z,Kong B,et al.Simple and green synthesis of nitrogen-doped photoluminescent carbonaceous nanospheres for bioimaging[J].Angew Chem Int Ed,2013,52(31):8151-8155.

[28]Chen B,Li F,Li S,et al.Large scale synthesis of photoluminescent carbon nanodots and their application for bioimaging[J].Nanoscale,2013,5(5):1967-1971.

[29]Wang X,Qu K,Xu B,et al.Microwave assisted one-step green synthesis of cell-permeable multicolor photoluminescent carbon dots without surface passivation reagents[J].J Mater Chem,2011,21(8):2445-2450.

[30]Qu D,Zheng M,Du P,et al.Highly luminescent S,N co-doped graphene quantum dots with broad visible absorption bands for visible light photocatalysts[J].Nanoscale,2013,5(24):12272-12277.

[31]Zheng Y,Jiao Y,Ge L,et al.Two-step boron and nitrogen doping in graphene for enhanced synergistic catalysis[J].Angewandte Chemie International Edition,2013,52(11):3110-3116.

[32]Li H,Zhai J,Tian J,et al.Carbon nanoparticle for highly sensitive and selective fluorescent detection of mercury(Ⅱ) ion in aqueous solution[J].Biosens Bioelectron,2011,26(12):4656-4660.

[33]Wang X,Wu P,Hou X,et al.An ascorbic acid sensor based on protein-modified Au nanoclusters[J].Analyst,2013,138(1):229-233.

[34]Jirimali H D,Nagarale R K,Saravanakumar D,et al.Hydroquinone modified chitosan/carbon film electrode for the selective detection of ascorbic acid[J].Carbohydr Polym,2013,92(1):641-644.

(責任編輯 薛 榮)

A fluorescence sensor for ascorbic acid based on nanocomposite "switch" of Fe3+and nitrogen-doped carbon nanodots generated from chitosan

WANG Jiajun， LIU Qing, FENG Shishi, FENG Zhiling, RUAN Yongming, WENG Xuexiang

(CollegeofChemistryandLifeSciences,ZhejiangNormalUniversity,Jinhua321004,China)

Ascorbic acid (AA) was detected by using a nano-switch of ferric ions (Fe3+), the nitrogen-doped fluorescence carbon nanodots (N-FCDs) was synthesized by one-step hydrothermal carbonization of chitosan at a mild temperature. The as-obtained N-FCDs exhibited good water dispersibility, excellent pH stability, and strong fluorescence. The results showed that the fluorescence of the N-FCDs could be effectively quenched by Fe3+and then be sensitively turned on in the presence of AA via an "off-on" fluorescence response through the oxidation-reduction between Fe3+and AA. A wide detection linear range for AA was found to be from 1 μmol/L to 200 μmol/L with a detection limit of 0.06 μmol/L. The switch sensor was also successfully applied to detect vitamin C tablets with satisfactory recovery ranging from 96.9% to 106%, exhibited great opportunities for practical application in food and clinical system.

sensor; nitrogen-doped fluorescence carbon nanodots; ferric ions; off-on fluorescence switch; ascorbic acid

10.16218/j.issn.1001-5051.2017.03.009

?2016-10-25；

2017-03-03

浙江省自然科學基金資助項目(LY15C040002)

王嘉君(1993-)，女，安徽黃山人，碩士研究生.研究方向：納米材料在生化分析中的應用.

翁雪香.E-mail: xuexian@zjnu.cn>

O657

A

1001-5051(2017)03-0299-08