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        芩麻方對慢性阻塞性肺疾病大鼠炎性細胞相關因子的影響

        2017-09-07 10:27:12丁亞杰陳曉俞仲毅鄒純樸
        中國中醫(yī)藥信息雜志 2017年9期
        關鍵詞:肺泡白細胞炎性

        丁亞杰 陳曉 俞仲毅 鄒純樸

        摘要:目的 觀察芩麻方對慢性阻塞性肺疾?。–OPD)大鼠內(nèi)源性抗炎系統(tǒng)的影響,探討其作用機制。方法 采用改良煙熏聯(lián)合脂多糖方法制作COPD大鼠模型。將70只SPF級大鼠隨機分為正常組、模型組、西藥對照組(氨茶堿組)、中藥對照組(六君子湯組)和芩麻方低、中、高劑量組,每組10只,各給藥組給予相應藥物灌胃。光鏡下觀察大鼠肺組織病理切片;收集大鼠肺泡灌洗液(BALF)和靜脈血,對相關指標進行檢測;ELISA檢測血清白細胞介素(IL)-1β、IL-6、IL-10含量。結(jié)果 與正常組比較,模型組大鼠BALF和血白細胞、中性粒細胞、巨噬細胞、淋巴細胞、血紅蛋白和血小板壓積顯著增加(P<0.05);與模型組比較,芩麻方中、高劑量組和六君子湯組大鼠BALF白細胞、中性粒細胞、巨噬細胞顯著減少(P<0.05),芩麻方中、高劑量組和氨茶堿組大鼠血白細胞、血紅蛋白和血小板壓積顯著減少(P<0.05),血清IL-1β、IL-6含量顯著降低(P<0.05),IL-10含量顯著升高(P<0.05)。結(jié)論 芩麻方通過調(diào)節(jié)炎癥反應相關細胞因子從而抑制炎癥反應。

        關鍵詞:芩麻方;慢性阻塞性肺疾?。话准毎樗?1β;白細胞介素-6;白細胞介素-10;大鼠

        DOI:10.3969/j.issn.1005-5304.2017.09.014

        中圖分類號:R285.5 文獻標識碼:A 文章編號:1005-5304(2017)09-0055-04

        Effects of Qinma Formula on Inflammatory Cell Related Factors in Rats with Chronic Obstructive Pulmonary Disease DING Ya-jie1, CHEN Xiao2, YU Zhong-yi2, ZOU Chun-pu1 (1. Basic Medicine College, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China; 2. Scientific Experimental Center, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China)

        Abstract: Objective To investigate the effects of Qinma Formula on endogenous anti-inflammatory system in rats with chronic obstructive pulmonary disease (COPD); To discuss its mechanism of action. Methods Rat models of COPD were made by modified smoked lipopolysaccharide method. 70 healthy SPF male Wistar rats were randomly divided into normal group, model group, Western medicine control group (aminophylline group), TCM medicine control group (Liujunzi Decoction group) and Qinma Formula high-, medium-, and low-dose groups, with 10 rats in each group. Each medication group was given relevant medicine for gavage. The pathological changes of lung tissue were observed under light microscope; the alveolar lavage fluid (BALF) and venous blood were collected and the related indexes were tested; the levels of serum IL-1β, IL-6 and IL-10 were detected by ELISA. Results Compared with normal group, BALF white blood cells, neutrophils, macrophages, lymphocyte, hemoglobin and platelet count in rats of model group increased significantly (P<0.05). Compared with the model group, BALF white blood cells, neutrophils, and macrophages in rats of Qinma medium- and high-dose groups and Liujunzi Decoction group decreased significantly (P<0.05); white blood cells, hemoglobin, and platelet count in rats of Qinma medium-, high-dose groups and aminophylline group decreased significantly (P<0.05); levels of IL-1β and IL-6 in serum decreased significantly (P<0.05); level of IL-10 in serum increased significantly (P<0.05). Conclusion Qinma Formula can effectively inhibit the inflammatory response through the regulation of inflammatory response-related cytokines.

        Key words: Qinma Formula; chronic obstructive pulmonary disease; IL-1β; IL-6; IL-10; rats

        基金項目:全國名老中醫(yī)藥專家傳承工作室建設項目(201035);上海進一步加快中醫(yī)藥事業(yè)發(fā)展三年行動計劃(ZY3-CCCX-1-1001)

        通訊作者:鄒純樸,E-mail:chunpuzou@shutcm.gov.cn

        慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease,COPD)主要是慢性吸煙和暴露于各種有害氣體和顆粒的結(jié)果所致,其特征是可逆的氣流受限和進行性氣道炎癥。芩麻方是上海中醫(yī)藥大學終身教授、國醫(yī)大師裘沛然教授的臨床經(jīng)驗用方,由麻黃、黃芩、細辛、訶子等組成,具有辛開苦降、寒熱并用和散斂相合的功效,為治療咳喘病之效方。本課題前期臨床研究顯示,芩麻方能顯著緩解COPD的癥狀,改善患者肺功能[1]。本實驗采用改良煙熏聯(lián)合脂多糖方法制作COPD大鼠模型,觀察芩麻方對COPD大鼠內(nèi)源性抗炎系統(tǒng)的影響,探討其作用機制。

        1 實驗材料

        1.1 動物

        健康雄性SPF級Wistar大鼠,鼠齡10~12周,體質(zhì)量180~220 g,上海必凱實驗動物公司,動物合格證號2008001655632。飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學動物實驗中心,12 h/12 h明暗周期,溫度(20±2)℃、相對濕度(50±5)%,自由攝食飲水。

        1.2 藥物

        芩麻方(麻黃、細辛、黃芩、訶子等),藥物浸膏粉由上海中醫(yī)藥大學中藥工程實驗室提供,每貼相當于浸膏6.5 g;氨茶堿片,山西云鵬制藥有限公司,批號B141104,0.1 g/片;六君子湯(人參、茯苓、白術(shù)、炙甘草、陳皮、法半夏、生姜、大棗),由上海中醫(yī)藥大學曙光醫(yī)院藥劑科提供飲片并煎煮。

        1.3 主要試劑與儀器

        脂多糖(美國Sigma公司),胃蛋白酶(上海威奧生物技術(shù)有限公司)。光學顯微鏡(Nikon YS IOO型),木質(zhì)半透明煙熏箱(52 cm×40 cm×28 cm,自制),BY210型生物機能實驗分析系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司),酶標儀(Therme DENLEY DRAGON Well-scan MK3),細胞計數(shù)儀分析(邁瑞bc5800),Image-ProPlus 6.0圖像分析軟件(Media Cybernetics),香煙(黃果樹牌香煙,焦油含量11 mg),白細胞介素(IL)-1β、IL-6和IL-10 ELISA試劑盒(上海威奧科技有限公司)。

        2 實驗方法

        2.1 分組

        將70只大鼠隨機分為正常組、模型組、西藥對照組(氨茶堿組)、中藥對照組(六君子湯組)和芩麻方低、中、高劑量組,每組10只。

        2.2 造模

        參照文獻[2]方法造模。造模第1日,微量注射器氣管內(nèi)注入1 μL二硫酰氯溶液(遇空氣分解為二氧化硫),吸入二氧化硫。造模第2、15日,造模組大鼠3%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉,大鼠仰臥固定,使用自制帶探燈注射器,將注射器探入到大鼠聲門,找到氣管部位,注入50 μL溶液(PBS配制,含脂多糖和胃蛋白酶各200 μg),注入后大鼠出現(xiàn)明顯嗆咳,迅速旋轉(zhuǎn)固定,使脂多糖和胃蛋白酶均勻分布于兩肺。吸入二氧化硫第3日開始,將大鼠置于自制的半透明熏吸箱,每次放入15只大鼠,使用7支香煙,煙熏30 min,每日上午1次,連續(xù)30 d。

        2.3 給藥

        造模后給藥3周,按人與大鼠體表面積折算,芩麻方低、中、高劑量組分別為0.29 g原藥材/kg(臨床半量)、0.58 g原藥材/kg(臨床用量)、1.17 g原藥材/kg(臨床倍量),六君子湯給藥量為4.9 g原藥材/kg(臨床用量),氨茶堿組為45 mg/kg藥液(臨床用量)。

        2.4 檢測指標

        2.4.1 肺組織病理觀察 制備大鼠肺組織切片,組織脫水,二甲苯透明,浸蠟,包埋,切片,HE染色。20倍鏡下觀察病理學改變。

        2.4.2 肺泡灌洗液制備及檢測 參照文獻[3]方法制備。暴露氣管及肺臟,夾持右側(cè)主支氣管。在氣管上部做一T型切口,鈍性分離氣管,使用10號灌胃針,行氣管插管,用生理鹽水,進行灌洗液回收,回收后經(jīng)濾頭過濾,得肺泡灌洗液(BALF),1500 r/min離心10 min,吸取上清液,加37 ℃低滲液8 mL,37 ℃水浴20 min。再加1 mL現(xiàn)配的固定液,1500 r/min離心10 min。棄上清液,緩慢加入固定液至8 mL,離心8 min棄上清液,再加8 mL固定液,打勻,37 ℃水浴30 min,1000 r/min離心10 min再棄上清液。取0.1 mL BALF,離心后沉淀于血細胞計數(shù)板測定白細胞。沉淀以快速瑞氏-姬姆試劑盒方法染色。10倍鏡下選取細胞較集中區(qū)域拍片,再用圖像分析軟件對鏡下BALF進行細胞分類計數(shù)。

        2.4.3 血常規(guī)檢測 取大鼠靜脈血于抗凝管中,血常規(guī)試劑盒檢測大鼠白細胞、血紅蛋白、血小板壓積,嚴格按試劑盒說明書進行操作。

        2.4.4 血清細胞因子檢測 大鼠腹腔注射25%烏拉坦麻醉,腹主動脈采血,室溫自然凝固10~20 min,待血液出現(xiàn)分層后,3500 r/min離心20 min,收集上清液。ELISA檢測血清IL-1β、IL-6及IL-10含量,嚴格按試劑盒說明書進行操作。

        3 統(tǒng)計學方法

        采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行分析。實驗數(shù)據(jù)以—x±s表示,多組間比較采用方差分析,多組間兩兩比較采用LSD法。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

        4 結(jié)果

        4.1 芩麻方對模型大鼠肺組織形態(tài)的影響

        正常組肺泡結(jié)構(gòu)正常,無擴張;模型組肺泡擴張,肺泡結(jié)構(gòu)大量破壞,表現(xiàn)為肺泡融合成較大囊腔,間質(zhì)內(nèi)大量淋巴細胞和漿細胞浸潤,支氣管壁增厚;芩麻方低劑量組氣管仍有炎細胞浸潤,肺泡結(jié)構(gòu)仍有少量破壞;芩麻方中、高劑量組炎細胞浸潤明顯減少,肺泡結(jié)構(gòu)較少破壞;六君子湯組大鼠肺組織支氣管管腔和肺泡腔炎性細胞浸潤明顯,肺泡結(jié)構(gòu)破壞,小支氣管可見炎癥改變;氨茶堿組仍有炎細胞浸潤,肺泡結(jié)構(gòu)破壞減少,肺泡壁增厚。結(jié)果見圖1。

        4.2 芩麻方對模型大鼠肺泡灌洗液白細胞及其分類的影響

        與正常組比較,模型組白細胞、中性粒細胞、巨噬細胞和淋巴細胞顯著增加(P<0.05);與模型組比較,芩麻方中、高劑量組和六君子湯組白細胞、中性粒細胞、巨噬細胞顯著減少(P<0.05)。結(jié)果見表1。

        4.3 芩麻方對模型大鼠血常規(guī)的影響

        與正常組比較,模型組白細胞、血紅蛋白、血小板壓積顯著升高(P<0.05);與模型組比較,芩麻方中、高劑量組和氨茶堿組白細胞、血紅蛋白和血小板壓積顯著降低(P<0.05)。結(jié)果見表2。

        4.4 芩麻方對模型大鼠血清白細胞介素-1β、白細胞介素-6和白細胞介素-10含量的影響

        與正常組比較,模型組IL-1β、IL-6含量顯著升高,IL-10含量顯著降低(P<0.05);與模型組比較,芩麻方中、高劑量組和氨茶堿組IL-1β、IL-6含量顯著降低,IL-10含量顯著升高(P<0.05)。結(jié)果見表3。

        5 討論

        COPD病理因素復雜,痰濁、水飲和瘀血三者相互影響,辨證多為本虛標實[4]。國醫(yī)大師裘沛然教授根據(jù)臨證經(jīng)驗,總結(jié)出治療COPD的芩麻方。咳必治肺,麻黃宣肺解表、細辛解表平喘。外邪由表傳里,入而化熱,痰熱蘊肺,故予黃芩清上焦之熱。痰為濁陰之邪易凝滯,故予細辛等辛溫之藥以溫肺化痰。訶子性澀,功在斂肺止咳[5]。本方有開、有化、有降、有潤,宣斂并用,切中病機。

        COPD的發(fā)病機制雖然尚未清楚,但其表現(xiàn)為炎性細胞如T淋巴細胞、巨噬細胞、中性粒細胞在氣道和肺實質(zhì)作用的一種慢性氣道炎癥疾病。氣道和肺發(fā)生慢性炎癥時,產(chǎn)生氧化應激反應,對α1-抗胰蛋白酶進行氧化并致其失活,這一失活降低抗蛋白酶的活性,產(chǎn)生肺氣腫。此外,反復發(fā)生的氣道炎癥還進一步導致氣道壁的損傷,使氣道發(fā)生修復,最終導致氣道管壁增厚,造成管腔狹窄,引起氣道重塑及發(fā)生難以逆轉(zhuǎn)的進行性阻塞。氣道中各種炎性細胞如單核細胞、巨噬細胞,主要通過釋放多種細胞因子調(diào)節(jié)COPD病變中慢性氣道炎癥和氣道重塑的過程。

        本實驗結(jié)果顯示,模型組血常規(guī)、BALF中白細胞較正常組升高,表明造模成功,與實驗和臨床文獻報告結(jié)果相似[6-7]。與模型組比較,芩麻方中、高劑量組白細胞、中性粒細胞、淋巴細胞均降低,提示芩麻方通過降低中性粒細胞、淋巴細胞來降低白細胞,從而抑制炎癥反應。

        IL-1β是一種重要的前炎性介質(zhì)因子,主要功能在于刺激分泌炎性介質(zhì),通過激活凝血系統(tǒng),進一步抑制纖溶的發(fā)生,一方面增加炎性滲出,另一方面加大中性粒細胞溶體酶的釋放,產(chǎn)生氧自由基,進而促進炎性細胞如單核細胞、巨噬細胞釋放IL-1、IL-6等炎性介質(zhì),進一步促進炎癥反應的發(fā)生與發(fā)展。IL-6是由淋巴細胞和多種非淋巴分泌產(chǎn)生,其與肺部炎癥密切相關,能促進肝細胞合成C反應蛋白,同時刺激T淋巴細胞增殖,從而參與炎反應。IL-10主要由單核-巨噬細胞和輔助性T細胞合成。IL-10是一種炎性細胞因子合成抑制因子,可抑制T淋巴細胞、NK細胞釋放前炎性細胞因子IL-1、IL-6等。本實驗結(jié)果顯示,芩麻方中、高劑量組IL-1β、IL-6水平較模型組降低,提示芩麻方通過降低炎性因子水平抑制炎癥反應,芩麻方中、高劑量組IL-10含量顯著升高,提示芩麻方通過提高機體IL-10水平,發(fā)揮抗炎作用。

        本實驗建立的大鼠COPD模型,肺組織形態(tài)改變符合COPD的病理變化,評估本實驗造模方法成功可行。通過實驗推測,芩麻方主要通過增加抑炎反應因子的表達,降低促炎癥因子的數(shù)量達到抗炎的目的。芩麻方抗炎作用以高劑量作用明顯,中劑量作用次之。

        綜上,本實驗結(jié)果顯示,芩麻方抗炎主要通過作用于肺組織,調(diào)節(jié)炎癥反應相關細胞因子,從而發(fā)揮治療COPD的作用。本實驗主要從COPD的炎性機制進行初步探究,由于所測指標雖相對較少,后續(xù)實驗將通過炎性的機制通路相關因子、相關蛋白的表達來進一步驗證芩麻方的抗炎機理。

        參考文獻:

        [1] 鄒純樸,黃品賢,余小平,等.裘沛然教授咳喘病診療方案的臨床效果評價[J].中華中醫(yī)藥雜志,2013,13(7):2025-2028.

        [2] JOBSE B N, McCURRY C A, MORISSETTE M C, et al. Impact of inflammation, emphysema, and smoking cessation on V/Q in mouse models of lung obstruction[J]. Respiratory research,2014,15(1):42- 50.

        [3] 姜素麗,李亞,田燕歌,等.調(diào)補肺腎三法對COPD大鼠T淋巴細胞亞群及CD4+CD25+的影響及遠后效應[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志,2013,33(11):1538-1544.

        [4] 王慶其,李孝剛,鄒純樸,等.裘沛然治療咳喘病經(jīng)驗[J].上海中醫(yī)藥雜志,2010,44(1):1-3.

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        [6] 程羽,羊忠山,陶偉利,等.慢性阻塞性肺疾病氣道重塑與血常規(guī)、EPO相關性的實驗研究[J].中華中醫(yī)藥學刊,2016,34(4):807-809.

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        (收稿日期:2017-04-19)

        (修回日期:2017-05-04;編輯:華強)

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