韓怡靜, 劉 健

(合肥工業(yè)大學 生物與醫(yī)學工程學院,安徽 合肥 230009)

體外誘導脂肪組織巨噬細胞極化的模型

韓怡靜, 劉 健

(合肥工業(yè)大學 生物與醫(yī)學工程學院,安徽 合肥 230009)

肥胖進程中,脂肪組織中的巨噬細胞由抗炎性的M2(2型巨噬細胞)逐漸極化成促炎性的M1(1型巨噬細胞),M1分泌的促炎性細胞直接可以導致胰島素抵抗等肥胖相關代謝綜合癥。由于體外常用細菌脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)誘導的促炎性巨噬細胞來研究脂肪組織中巨噬細胞的極化,但其與脂肪組織中M1的表型相差甚遠;另外,粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor,GM-CSF)和巨噬細胞集落刺激因子(macrophage colony stimulating factor,M-CSF)可以誘導骨髓細胞分化為骨髓來源巨噬細胞(bone marrow-derived macrophage,BMDM)。文章發(fā)現(xiàn)GM-CSF誘導的巨噬細胞(GM-CSF-induced macrophages,GM-BMM)高表達脂肪組織M1型標志基因CD11c與NOS2和促炎性細胞因子IL6與TNFα;與此相反,M-CSF誘導的骨髓細胞分化的巨噬細胞(M-CSF-induced macrophages,M-BMM)高表達脂肪組織M2標志基因CD206和抗炎性細胞因子IL10。因此,GM-BMM和M-BMM更適合用于脂肪組織巨噬細胞極化的體外研究。

粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor,GM-CSF);巨噬細胞集落刺激因子(macrophage colony stimulating factor,M-CSF);巨噬細胞極化;炎性;肥胖

0 引 言

隨著全球經(jīng)濟的發(fā)展及人們物質水平的提高,肥胖已經(jīng)成為危害人類健康的重要疾病之一。世界衛(wèi)生組織在2014年統(tǒng)計出,全球已有19億的成年人處于超重狀態(tài),6億人患有肥胖?，F(xiàn)已公認肥胖是一種慢性低度的炎性狀態(tài)[1],肥胖狀態(tài)下有大量炎性細胞聚集至脂肪組織,并產(chǎn)生大量炎性因子。研究脂肪組織的炎性是解決肥胖的重要任務之一。

慢性炎性通常被認為是巨噬細胞浸潤到炎性組織中。巨噬細胞是一種免疫細胞,它的重要功能是保護機體免受感染。巨噬細胞分別通過吞噬作用和細胞因子來移除和殺死受感染的細胞[2]。此外,巨噬細胞也通過其產(chǎn)生細胞因子的功能在慢性炎癥中發(fā)揮重要作用[3]。

巨噬細胞是一個多樣化的細胞群,通常巨噬細胞被分為M1和M2。體外實驗中,M1巨噬細胞可通過細菌脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)或其他促炎因子處理產(chǎn)生。而M2型巨噬細胞在抗炎性中扮演重要角色[4]。對于骨髓來源巨噬細胞(bone marrow-derived macrophages,BMDM)的實驗是體外研究中的一項成熟技術。利用BMDM進行體外的誘導實驗是一項方便的方法。但是脂肪組織巨噬細胞與LPS等誘導出巨噬細胞有很大不同。在脂肪組織中,CD11c和NOS2等是促炎性M1巨噬細胞的標記基因,CD206和IL10等是抗炎性M2巨噬細胞的標記基因。因此檢測巨噬細胞的標記基因的表達對于研究巨噬細胞的分型有重要意義。

粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor,GM-CSF)和巨噬細胞集落刺激因子(macrophage colony stimulating factor,M-CSF)均屬于集落刺激因子(colony stimulating factor,CSF),它們對單核細胞到巨噬細胞的分化起到顯著的作用[5]。雖然GM-CSF和M-CSF誘導產(chǎn)生的GM-BMM(GM-CSF-induced macrophages)和M-BMM(M-CSF-induced macrophages)在某些模式上有一定程度的相似,但它們的功能以及產(chǎn)生的細胞因子卻有很大的不同[6]。對于GM-BMM和M-BMM是否可以用于脂肪組織巨噬細胞(adipose tissue macrophages,ATM)的體外研究仍是一個值得探討的問題。

ATM可促進肥胖相關的炎性和胰島素抵抗等代謝綜合癥[7]。為了更好地研究和解決肥胖這一流行病,體外誘導ATM可以更好地進行體外實驗研究。體外誘導M1和M2型巨噬細胞已經(jīng)是一個成熟的技術,但是對于誘導脂肪組織狀態(tài)下的巨噬細胞目前報道較少。本文使用GM-CSF及M-CSF處理巨噬細胞,分別得到GM-BMM和M-BMM 2種巨噬細胞。這對體外誘導ATM提供了一個可行的方法,在體外方便簡捷地研究巨噬細胞、炎性和肥胖成為一種可能。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料

用于取骨髓巨噬細胞的C57BL6小鼠購買于北京維通利華實驗動物技術有限公司。無限制供應正常食物和水進行飼養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑

Trizol 試劑盒和逆轉錄試劑盒購于日本TaKaRa公司;DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)和青霉素/鏈霉素溶液購于GIBCO公司;實時定量熒光聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)試劑(SYBR?Green mix)購于美國Bio-Rad公司;M-CSF和GM-CSF購于美國PEPROTECH公司;快速瑞姬式染液試劑購于南京建成科技有限公司;氯仿、乙醇等常規(guī)試劑購于國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠骨髓巨噬細胞的分離純化

8周齡小鼠置于充滿CO2的容器中窒息處死,解剖其兩只后腿。將紙巾用75%酒精噴濕,在無菌的超凈臺里用濕紙巾剝去小鼠后腿的肌肉,留下腿骨。用無菌的剪刀和鑷子剪去腿骨的兩端,無菌注射器吸取DMEM空培養(yǎng)基,沖出腿骨中的骨髓至無菌的培養(yǎng)皿中,沖至腿骨呈無色為止。將含有骨髓的培養(yǎng)基轉移至50 mL無菌離心管中,1 500 r/min 4 ℃,離心5 min。棄上清,加入DMEM培養(yǎng)基(其中含10% FBS和1%青霉素/鏈霉素),吹散細胞后轉移到培養(yǎng)皿中,接著用M-CSF和GM-CSF進行處理。放入5% CO2、37 ℃細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。培養(yǎng)至第4天進行細胞換液。7 d即可得到純化的小鼠骨髓巨噬細胞。

1.2.2 細胞總RNA的提取及反轉錄

細胞總RNA的提取。小心吸去細胞培養(yǎng)基,PBS清洗1遍,向孔板中每孔加入300 μL RNAiso Plus。加入60 μL氯仿,劇烈震蕩。室溫靜置 5 min。12 000 g,4 ℃離心15 min。離心后溶液分3層,吸取上層水相轉移至新離心管中。加入等體積的異丙醇,混勻,室溫靜置10 min。12 000 g,4 ℃離心10 min。棄上清,加入1 mL 75%的乙醇。12 000 g,4 ℃離心 5 min。棄乙醇。室溫干燥沉淀5～15 min,加入適量的DEPC處理的無RNAse的水溶解沉淀。將RNA放于-80 ℃保存。

反轉錄。利用核酸蛋白測定儀測定RNA濃度。20 μL逆轉錄反應體系:2 μg總RNA加入無RNase離心管,再加入1 μL oligo(dT) 18(500 ng/mL)和1 μL 10 mmol/L dNTP混合物,然后加入DEPC處理的雙蒸水至12 μL。將含上述體系的離心管置于65 ℃加熱5 min,再加入5×第一鏈合成緩沖液4 μL,0.1 mol/L DTT 2 μL和RNAse 抑制劑1 μL。將上述體系混勻,加入1 μL M-MLV 逆轉錄酶,混勻。37 ℃孵育50 min。70 ℃加熱15 min以終止反應。cDNA于-20 ℃儲存。

1.2.3 定量PCR

建立20 μL的定量PCR反應體系。SYBR?Green mix 10 μL;上游引物 0.4 μL;下游引物 0.4 μL;雙蒸水 8.2 μL;cDNA 1 μL?；靹虿㈦x心后于Bio-rad IQ2定量PCR儀上進行反應。采用ΔΔCt法,以GAPDH為內參計算比較樣本間基因表達水平差異。定量PCR引物詳細序列如下所示。

GAPDH:5’-CGTGTTCCTACCCCCAATGT-3’(正向)， 5’-TGTCATACTTGGCAGGTTTCT-3’(反向);

NOS2:5’-CCAAGCCCTCACCTACTTCC-3’(正向)， 5’-CTCTGAGGGCTGACACAAGG-3’(反向);

CD206:5’-TGATTACGAGCAGTGGAAGC-3’(正向)， 5’-GTTCACCGTAAGCCCAATTT-3’(反向);

IL10:ACTGCACCCACTTCCCAGT(正向)， TGTCCAGCTGGTCCTTTGTT(反向);

IL6:5’-CCTTCCTACCCCAATTTCCAA-3’(正向)， 5’-AGATGAATTGGATGGTCTTGGTC-3’(反向);

MCP1:5’-CCCCAAGAAGGAATGGGTCC-3’(正向)， 5’-GGTTGTGGAAAAGGTAGTGG-3’(反向);

CD11c:5’-CTGGATAGCCTTTCTTCTGCTG-3’(正向), 5’-GCACACTGTGTCCGAACTC-3’(反向)。

1.2.4 小鼠骨髓巨噬細胞墨汁吞噬實驗

將包被好的細胞爬片經(jīng)無菌PBS浸洗后置于無菌培養(yǎng)皿中,每個中盤可放置3～5張細胞爬片。提前放置好細胞爬片的培養(yǎng)皿中分離純化小鼠骨髓巨噬細胞。培養(yǎng)至第6天,將印度墨汁5 000 r/min離心3 min,按每1 mL培養(yǎng)體系100 μL墨汁的量將離心后的墨汁加入培養(yǎng)皿中,混勻。3 h后用PBS洗去多余墨汁,甲醛固定40 min,雙蒸水洗2遍。瑞姬染色,1試劑4 mL/盤2 min,2試劑8 mL/盤混勻8 min,雙蒸水洗去多余染液,晾干蓋玻片,甘油明膠封片。油鏡下觀察巨噬細胞的吞噬情況。

1.2.5 實驗數(shù)據(jù)處理

所有的實驗均重復6次以上。實驗數(shù)據(jù)使用OriginPro 9.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析。利用t檢驗進行細胞實驗的統(tǒng)計學分析。當P< 0.05視為具有顯著性差異。*表示P<0.05;**表示P<0.01。

2 結果與分析

2.1 小鼠骨髓巨噬細胞墨汁吞噬實驗結果

取小鼠后腿,將其骨髓取出,添加M-CSF及GM-CSF誘導1周。巨噬細胞對顆粒性異物具有較強的吞噬功能。為了證明所誘導巨噬細胞的成功性,使用墨汁吞噬實驗對骨髓誘導的巨噬細胞進行拍照觀察[8]。一方面觀察巨噬細胞的形態(tài),另一方面通過吞噬實驗驗證巨噬細胞的狀態(tài)。

巨噬細胞體積較大、形狀不規(guī)則,含空泡和異物顆粒。使用20倍的顯微鏡進行拍照。從吞噬實驗的顯微鏡觀察情況來看,可以明顯看出GM-CSF和M-CSF誘導的這些細胞都是巨噬細胞的形態(tài),如圖1所示?？梢宰C明此誘導小鼠骨髓巨噬細胞的方法較為成功。由圖1也可看出,巨噬細胞因吞噬了大量的墨汁而呈墨黑色,證明巨噬細胞的狀態(tài)良好,吞噬功能較好。但是,GM-CSF和M-CSF誘導的巨噬細胞在形態(tài)上并無顯著差異。

圖1 M-CSF和GM-CSF誘導BMDM的墨汁吞噬實驗

2.2 M-BMM和GM-BMM的M1標記物表達

將小鼠骨髓誘導的巨噬細胞分別用 M-CSF和GM-CSF誘導1周,接下來進行RNA提取及反轉錄。得到的cDNA進行熒光定量PCR,檢測脂肪組織M1巨噬細胞標記基因的表達,如圖2所示。

觀察圖2中NOS2和CD11c基因的表達發(fā)現(xiàn),在GM-CSF的誘導下,CD11c和NOS2 這2個M1巨噬細胞的標記物的相對mRNA的表達比M-CSF誘導下有明顯的升高。尤其是CD11c,在GM-CSF的誘導下,其表達比M-CSF的要高18倍,如圖2b所示。NOS2和CD11c這2個M1巨噬細胞的標記物的表達,證明了GM-CSF誘導的巨噬細胞,即GM-BMM更傾向于M1巨噬細胞。

(a) NOS2 (b) CD11c

2.3 M-BMM和GM-BMM的M2標記物表達

分別用M-CSF和GM-CSF誘導的小鼠骨髓巨噬細胞1周,檢測M2標記基因的表達。

CD206和IL10作為M2巨噬細胞的標記基因,在GM-CSF的誘導中與M-CSF相比相對mRNA的表達明顯降低,如圖3所示。這表明,M-CSF誘導的巨噬細胞,即M-BMM更傾向于M2巨噬細胞。

(a) CD206 (b) IL10

2.4 M-BMM和GM-BMM的炎性因子表達

本文檢測了M-CSF和GM-CSF的誘導下,M1和M2巨噬細胞的標記基因的表達,證明了M-CSF和GM-CSF對巨噬細胞極化的不同影響。在此又檢測了炎性因子的表達。

在M-CSF和GM-CSF的誘導下,炎性因子IL6和MCP1相對mRNA的表達如圖4所示。由圖4可看出GM-CSF誘導的巨噬細胞比M-CSF的炎性因子的相對mRNA表達要高。也說明了GM-CSF誘導的巨噬細胞是促炎性的M1巨噬細胞表型。

(a) IL6 (b) MCP1

3 結 論

肥胖個體ATM的炎性極化是引發(fā)肥胖相關代謝綜合癥的重要原因。研究其極化的機制為該綜合癥的預防和治療具有相當?shù)闹匾饬x。本文發(fā)現(xiàn)M-CSF和GM-CSF誘導巨噬細胞的表型分別相似于體內ATM的M2和M1。因此,M-CSF和GM-CSF誘導的巨噬細胞可以用于體外巨噬細胞極化的研究。

本文首先提取了小鼠的骨髓進行巨噬細胞的誘導。通過對細胞的顯微鏡觀察及墨汁吞噬實驗,證明了誘導巨噬細胞的可靠性。巨噬細胞基本上可分為促炎性的M1和抗炎性的M2這2個表型。為了證明M-CSF和GM-CSF誘導出的不同的脂肪組織巨噬細胞表型,文中檢測了脂肪組織M1、M2及某些炎性因子的相對mRNA水平的表達。

結果表明,GM-CSF誘導的巨噬細胞GM-BMM是趨于M1的表型,而M-CSF誘導的M-BMM是M2的表型。本文找出了一個體外研究脂肪組織巨噬細胞的誘導模型,對肥胖和炎性的進一步研究奠定了基礎。

[1] GREGOR M F,HOTAMISLIGIL G S.Inflammatory mechanisms in obesity [J].Annual Review of Immunology,2011,29:415-445.

[2] GORDON S,TAYLOR P R.Monocyte and macrophage heterogeneity[J].Nature Review Immunology,2005,5(12):953-964.

[3] OLEFSKY J M,GLASS C K.Macrophages,inflammation,and insulin resistance [J].Annual Review Physiology,2010,72:219-246.

[4] XU J M,SHI G P.Emerging role of mast cells and macrophages in cardiovascular and metabolic diseases [J].Endocrine Reviews,2012,33(1):71-108.

[5] KITOH Y,SAIO M,GOTOH N,et al.Combined GM-CSF treatment and M-CSF inhibition of tumor-associated macrophages induces dendritic cell-like signaling in vitro [J].Internatimal Journal of Oncology,2011,38(5):1409-1419.

[6] JAGUIN M,HOULBERT N,FARDEL O,et al.Polarization profiles of human M-CSF-generated macrophages and comparison of M1-markers in classically activated macrophages from GM-CSF and M-CSF origin [J].Cell Immunology,2013,281(1):51-61.

[7] STRISSEL K J,STANCHEVA Z,MIYOSHI H,et al.Adipocyte death,adipose tissue remodeling,and obesity complications [J].Diabetes,2007,56(12):2910-2918.

(責任編輯 閆杏麗)

Model of inducing adipose tissue macrophages polarization in vitro

HAN Yijing, LIU Jian

(School of Biological and Medical Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China)

In the process of obesity, macrophages polarize from anti-inflammatory M2 to pro-inflammatory M1 in adipose tissues. Inflammatory cells secreted from M1 can induce insulin resistance and obesity related metabolic syndrome directly. Lipopolysaccharide(LPS) is often used to induce pro-inflammatory macrophages to study macrophages polarization in adipose tissues in vitro. However, LPS-induced macrophages are drastically different from M1 in adipose tissues. Furthermore, granulocyte-macrophage colony stimulating factor(GM-CSF) and macrophage colony stimulating factor(M-CSF) can induce bone marrow into bone marrow-derived macrophage(BMDM). It was found that GM-CSF-induced macrophages(GM-BMM) could strongly express adipose tissues related M1 markers genesCD11candNOS2 and inflammatory cytokinesIL6 andTNFα. On the contrary, M-CSF-induced macrophages(M-BMM) could highly express adipose tissues related M2 markers genesCD206 and anti-inflammatory cytokinesIL10. Consequently, GM-BMM and M-BMM are more suitable for adipose tissues related macrophages polarization in vitro.

granulocyte-macrophage colony stimulating factor(GM-CSF); macrophage colony stimulating factor(M-CSF); macrophages polarization; inflammation; obesity

2016-02-26；

2016-03-22

國家自然科學基金資助項目(31171315)

韓怡靜(1990-),女,山東煙臺人,合肥工業(yè)大學碩士生; 劉 健(1970-),男,安徽合肥人,博士,合肥工業(yè)大學教授,博士生導師.

10.3969/j.issn.1003-5060.2017.08.025

Q343

A

1003-5060(2017)08-1139-05