潘 正，高運玲，江 生，范 剛，張 藝，曹緯國（.重慶醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，重慶 0006；.重慶郵電大學(xué)生物學(xué)院，重慶 00065；.重慶市食品藥品檢驗所，重慶 0；.成都中醫(yī)藥大學(xué)民族藥學(xué)院，成都60）

HPLC法同時測定云連藥材中6種生物堿的含量Δ

潘 正1＊，高運玲2，江 生3，范 剛4，張 藝4，曹緯國1（1.重慶醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，重慶 400016；2.重慶郵電大學(xué)生物學(xué)院，重慶 400065；3.重慶市食品藥品檢驗所，重慶 401121；4.成都中醫(yī)藥大學(xué)民族藥學(xué)院，成都611130）

目的：建立同時測定云連藥材中6種生物堿含量的方法。方法：色譜柱為XtimateTMC18，流動相為30 mmol/L碳酸氫銨溶液（含0.1%三乙胺和0.7%氨水）-乙腈（梯度洗脫），流速為1.0 mL/min，檢測波長為270 nm，柱溫為30℃，進樣量為10 μL。結(jié)果：藥根堿、非洲防己堿、表小檗堿、黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿的檢測質(zhì)量濃度線性范圍分別為0.85～16.96 mg/L（r＝0.999 9）、1.25～24.96 mg/L（r＝0.999 8）、2.05～40.96 mg/L（r＝0.999 9）、3.65～72.96 mg/L（r＝0.999 9）、2.88～57.60 mg/L（r＝0.999 9）、13.25～264.96 mg/L（r＝0.999 9）；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗的RSD＜3.0%；加樣回收率分別為97.14%～102.14%（RSD＝1.93%，n＝6）、97.00%～102.00%（RSD＝2.06%，n＝6）、98.18%～101.82%（RSD＝1.79%，n＝6）、96.15%～101.28%（RSD＝2.06%，n＝6）、96.88%～101.88%（RSD＝1.87%，n＝6）、99.31%～103.76%（RSD＝1.89%，n＝6）。結(jié)論：該方法操作簡便，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性好，可用于云連藥材中6種生物堿含量的同時測定。

云連；生物堿；含量測定；高效液相色譜法

黃連是中醫(yī)臨床常用藥物，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，藥用歷史悠久。黃連味苦，性寒，歸心、肝、胃、膽、大腸經(jīng)，具有清熱燥濕、瀉火解毒的功效，臨床上常用于治療濕熱痞滿、嘔吐、心火亢盛、黃疸、消渴、牙痛、癰腫療瘡等癥[1]?，F(xiàn)代藥理研究表明，黃連具有抗病原微生物、抗炎、抗癌、抗?jié)儭⒔笛?、解熱和保肝等作用[2]。2015年版《中國藥典》（一部）記載黃連為毛茛科植物黃連Coptis chinensis Franch.、三角葉黃連C.deltoidea C.Y. Cheng et Hsiao或云連C.teeta Wall.的干燥根莖，藥材依次習(xí)稱為“味連”“雅連”和“云連”。

有文獻檢測了不同產(chǎn)地和品種黃連藥材中的總生物堿，發(fā)現(xiàn)云連中的總生物堿高于味連和雅連[3]；有研究檢測了不同產(chǎn)地和品種黃連中鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀和藥根堿的含量，卻發(fā)現(xiàn)云連中上述3種生物堿含量低于味連，由于該研究收集云連樣品均未超過3批，樣品量較少[4]；同時，云連中除了上述3種生物堿外，黃連堿、表小檗堿和非洲防己堿也是其主要成分。鑒于上述原因，筆者采用高效液相色譜法（HPLC）同時測定了8批云連藥材中上述6種生物堿的含量，以期為云連藥材的質(zhì)量控制與評價及其臨床合理利用提供一定借鑒。

1 材料

1.1 儀器

1200型HPLC儀，包括DAD檢測器（美國Agilent公司）；CPX8800H-C型超聲波清洗器（上海必能信有限公司）；BP121S型電子分析天平（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 試劑

鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀對照品（批號分別為110713-200609、110732-200506）均購自中國食品藥品檢定研究院；黃連堿、非洲防己堿、表小檗堿、藥根堿對照品（批號分別為 20100501、20100502、20100701、20110406）均由重慶市中藥研究院提供，以上對照品純度均＞98%；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

1.3 藥材

筆者共收集云連藥材8批（見表1），經(jīng)重慶醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院王剛副教授鑒定為真品。

表1 云連藥材來源Tab 1 Source of C.teeta

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱：XtimateTMC18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：30 mmol/L碳酸氫銨溶液（A，含0.1%三乙胺和0.7%氨水）-乙腈（B），梯度洗脫（0～15 min，10%→25% B；15～25 min，25%→30%B；25～40 min，30%→45% B）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：270 nm；柱溫：30℃；進樣量：10 μL。在上述色譜條件下，理論板數(shù)以藥根堿、非洲防己堿、表小檗堿、黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿峰計＞3 000；各成分基線分離良好，分離度＞1.5，詳見圖1。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 精密稱取待測成分對照品適量，加鹽酸-甲醇（1∶100，V/V）制成藥根堿、非洲防己堿、表小檗堿、黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿質(zhì)量濃度分別為16.96、24.96、40.96、72.96、57.60、264.96 mg/L的混合對照品溶液。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.2.2 供試品溶液 取藥材樣品粉末約0.1 g，精密稱定，置于100 mL具塞錐形瓶中，精密加入鹽酸-甲醇（1∶100，V/V）50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲（功率：240 W，頻率：45 kHz，下同）處理30 min，取出，放冷，再次稱定質(zhì)量，用鹽酸-甲醇（1∶100，V/V）補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 線性關(guān)系考察

分別精密量取“2.2.1”項下混合對照品溶液0.5、1、2、5、10 mL，分別置于10 mL量瓶中，加鹽酸-甲醇（1∶100，V/V）定容，制成系列混合對照品溶液。精密量取上述系列混合對照品溶液各10 μL，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以待測成分質(zhì)量濃度（x，mg/L）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進行線性回歸，得回歸方程與線性范圍，詳見表2。

表2 回歸方程與線性范圍Tab 2 Regression equations and linear ranges

2.4 精密度試驗

取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果，藥根堿、非洲防己堿、表小檗堿、黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿峰面積的RSD分別為1.52%、1.31%、1.47%、1.75%、1.63%、1.97%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗

取“2.2.2”項下供試品溶液（No.5）適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，藥根堿、非洲防己堿、表小檗堿、黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿峰面積的RSD分別為1.64%、1.22%、2.04%、1.46%、0.88%、1.74%（n＝6），表明供試品溶液室溫放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.6 重復(fù)性試驗

精密稱取同一批樣品（No.5）適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，藥根堿、非洲防己堿、表小檗堿、黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿峰面積的RSD分別為1.36%、1.72%、0.93%、2.16%、2.33%、1.61%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.7 加樣回收率試驗

取已知含量樣品（No.5）適量，共6份，分別加入一定質(zhì)量的待測成分對照品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結(jié)果見表3。

表3 加樣回收率試驗結(jié)果（n＝6）Tab 3 Results of recovery tests（n＝6）

續(xù)表3Continued tab 3

2.8 藥材樣品含量測定

取8批樣品各適量，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算樣品含量，結(jié)果見表4（表中“-”為含量＜0.01%而未檢出）。

表4 藥材樣品含量測定結(jié)果（n＝3，%）Tab 4 Result of contents determination of samples（n＝3，%）

3 討論

筆者參考有關(guān)文獻[4-6]，考察了50 mmol/L磷酸二氫鉀-甲醇、50 mmol/L磷酸二氫鉀（加入不同濃度的十二烷基磺酸鈉）-乙腈溶液、0.1%三氟乙酸-乙腈、30 mmol/L碳酸氫銨溶液-乙腈等流動相體系，結(jié)果表明，30 mmol/L碳酸氫銨溶液-乙腈能較好地分離6種生物堿，并在水相中加入一定濃度的三乙胺和氨水調(diào)pH后，能明顯改善色譜峰的對稱性。因此，最終確定最佳的流動相為30 mmol/L碳酸氫銨溶液（含0.1%三乙胺和0.7%氨水）-乙腈，進行梯度洗脫。此外，在供試品溶液的制備中，本研究對提取方法（超聲、回流）、提取溶劑（甲醇、乙醇、鹽酸-甲醇、鹽酸-乙醇）、提取時間（30、40、50 min）及提取溶劑用量（40、50、60 mL）等因素進行了考察，最終發(fā)現(xiàn)以鹽酸-甲醇（1∶100，V/V）50 mL超聲提取30 min的提取效果最佳。

筆者同時測定云連藥材中6種生物堿，結(jié)果云連藥材中6種生物堿的平均含量高低依次為：鹽酸小檗堿＞黃連堿＞藥根堿＞鹽酸巴馬?。痉侵薹兰簤A＞表小檗堿。本方法操作簡便，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性好，可用于云連藥材中6種生物堿含量的同時測定。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].2015年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：303-305.

[2] Tang J，F(xiàn)eng YB，Tsao S，et al.Berberine and Coptidis Rhizoma as novel antineoplastic agents：a review of traditional use and biomedical investigations[J].J Ethnopharmacol，2009，126（1）：5-17.

[3] 張德偉，封海霞，熊學(xué)慶，等.不同商品來源云南黃連中重金屬含量的測定與評價[J].中國藥業(yè)，2016，25（4）：79-81.

[4] 晁若冰，張浩，莊燕黎，等.高效液相色譜法測定黃連藥材中小檗堿型生物堿的含量[J].藥物分析雜志，2003，23（5）：354-357.

[5] 賴先榮，周邦華，杜明勝，等.6種黃連飲片中6種生物堿的RP-HPLC含量測定及與“治消渴”藥效學(xué)的譜-效關(guān)系分析[J].中國中藥雜志，2016，40（24）：4579-4586.

[6] 陽勇，李鐵，朱晶晶，等.HPLC法測定黃連藥材及其炮制品中主要生物堿的含量[J].中成藥，2010，32（9）：1540-1544.

Simultaneous Determination of 6 Alkaloids in Coptis teeta by HPLC

PAN Zheng1，GAO Yunling2，JIANG Sheng3，F(xiàn)AN Gang4，ZHANG Yi4，CAO Weiguo1（1.College of TCM，Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China；2.College of Biology，Chongqing University of Posts and Telecommunication，Chongqing 400065，China；3.Chongqing Institute for Food and Drug Control，Chongqing 401121，China；4.College of Ethnic Medicine，Chengdu University of TCM，Chengdu 611130，China）

Coptis teeta；Alkaloids；Content determination；HPLC

R917

A

1001-0408（2017）24-3408-04

2016-12-05

2017-01-14）

（編輯：張 靜）

重慶市基礎(chǔ)與前沿研究計劃項目（No.cstc2014jcyj A10004）；重慶市教委科學(xué)技術(shù)研究項目（No.KJ1400433）；重慶市衛(wèi)生計生委中醫(yī)藥科技項目（No.ZY201602066）

＊副教授，博士。研究方向：中藥化學(xué)成分分析。電話：023-65712062。E-mail：letter2013@sina.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.24.28

ABSTRACTOBJECTIVE：To develop a method for simultaneous determination of 6 alkaloids in Coptis teeta.METHODS：The determination was performed on XtimateTMC18with mobile phase consisted of 30 mmol/L ammonium bicarbonate[containing 0.1% triethylamine and 0.7%ammonia-acetonitrile（gradient elution）]at the flow rate of 1.0 mL/min.The detection wavelength was set at 270 nm，the column temperature was 30℃，and the sample size was 10 μL.RESULTS：The linear ranges of jateorrhizine，columbamine，epiberberine，coptisine，palmatine hydrochloride and berberine hydrochloride were 0.85-16.96 mg/L（r＝0.999 9），1.25-24.96 mg/L（r＝0.999 8），2.05-40.96 mg/L（r＝0.999 9），3.65-72.96 mg/L（r＝0.999 9），2.88-57.60 mg/L（r＝0.999 9）and 13.25-264.96 mg/L（r＝0.999 9），respectively.RSDs of precision，stability and reproducibility tests were all lower than 3.0%.Recoveries were 97.14%-102.14%（RSD＝1.93%，n＝6），97.00%-102.00%（RSD＝2.06%，n＝6），98.18%-101.82%（RSD＝1.79%，n＝6），96.15%-101.28%（RSD＝2.06%，n＝6），96.88%-101.88%（RSD＝1.87%，n＝6），99.31%-103.76%（RSD＝1.89%，n＝6），respectively.CONCLUSIONS：The method is simple，accurate，stability and reproducible，and can be used for simultaneous determination of 6 alkaloids in Coptis teeta.