錢幫國，焦磊

（珀金埃爾默企業(yè)管理（上海）有限公司，上海 201203）

多標(biāo)記免疫熒光染色及多光譜成像技術(shù)在組織學(xué)研究中的應(yīng)用

錢幫國，焦磊*

（珀金埃爾默企業(yè)管理（上海）有限公司，上海 201203）

免疫組織化學(xué)染色及成像分析是研究組織形態(tài)和組織原位抗原表達(dá)不可或缺的檢測技術(shù)，廣泛應(yīng)用于臨床病理診斷和醫(yī)學(xué)及生物學(xué)研究的各個領(lǐng)域。組織切片樣本中蘊(yùn)含著豐富的信息，但是受制于傳統(tǒng)單標(biāo)記免疫組織化學(xué)染色方法的限制，通常只能對組織中的一到兩種抗原進(jìn)行染色分析，而且定量結(jié)果的判讀往往依賴于肉眼觀測，缺乏客觀標(biāo)準(zhǔn)。隨著蛋白組學(xué)的發(fā)展，對現(xiàn)代組織學(xué)分析提出了更高的要求，例如不同的蛋白共表達(dá)和共定位分析、低豐度分子的檢測、異質(zhì)性分析、細(xì)胞表型統(tǒng)計乃至復(fù)雜組織微環(huán)境的描繪等，都需要在同一張組織切片樣本上同時檢測多種靶標(biāo)分子。這對于理解組織微環(huán)境中各種細(xì)胞間的關(guān)系，推演信號通路上下游蛋白表達(dá)的關(guān)系，制定臨床診斷和治療方案都有著非常重要的意義。本文介紹一種基于酪胺信號放大（TSA）技術(shù)衍生而來的多標(biāo)記免疫熒光染色方法，能夠在同一組織切片樣本上復(fù)染7種以上抗原并進(jìn)行區(qū)別標(biāo)記，配合光譜成像技術(shù)和定量分析軟件，能夠?qū)⒔M織中蘊(yùn)含的豐富信息準(zhǔn)確的呈現(xiàn)出來。這套流程化的分析方案為臨床診斷和基礎(chǔ)科研提供了更高精度和更可靠的組織學(xué)數(shù)據(jù)，將免疫組織化學(xué)分析的技術(shù)水平提升到一個新的高度。

多色標(biāo)記免疫組織化學(xué)；多光譜成像；酪胺信號放大；定量病理學(xué)

隨著新型測序、基因和蛋白芯片以及流式分析技術(shù)的發(fā)展，已經(jīng)可以從正?；蚣膊〗M織中獲取越來越多的基因或細(xì)胞表型信息。這些基于均相樣本的分析方法因為缺少形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)，一般只能測定平均含量，而無法揭示特定表型在組織中的原位分布特點(diǎn)。組織中的蛋白或細(xì)胞往往表現(xiàn)為異質(zhì)性分布[1]，其空間定位以及與組織結(jié)構(gòu)的相互關(guān)系對于理解各組分在組織微環(huán)境中的角色和作用有著重要意義。免疫組織化學(xué)染色法是利用抗原和抗體間的特異性結(jié)合來檢測細(xì)胞或組織中特定目標(biāo)蛋白的實(shí)驗方法[2]，兼顧蛋白表達(dá)定量和形態(tài)定位檢測兩方面的要求。受益于抗體標(biāo)記和成像檢測技術(shù)的進(jìn)步，已經(jīng)有方法可以擺脫常規(guī)免疫組織化學(xué)染色和成像技術(shù)的限制，將過去局限于一到三種蛋白檢測的傳統(tǒng)免疫組織化學(xué)分析，提升為同時檢測多達(dá)7種分子靶標(biāo)的新型免疫組織化學(xué)分析方案（PerkinElmer PhenopticsTM），進(jìn)而滿足組織微環(huán)境中復(fù)雜表型分析的需求。本文從多標(biāo)記免疫組織化學(xué)染色、光譜成像和信號拆分以及組織形態(tài)學(xué)定量分析三個環(huán)節(jié)對新型免疫組織化學(xué)分析方法進(jìn)行介紹（圖1），并對該方法在生物醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用前景進(jìn)行了探討。

圖1 Phenoptics新型免疫組織化學(xué)分析方案的分析流程。A，多色免疫熒光染色；B，光譜成像和信號拆分；C，組織形態(tài)學(xué)定量軟件分析Fig. 1 Flowchart of Phenoptics analysis. A, multiplexed immunohistochemistry; B, multispectral imaging; C, tissue image quantitative analysis

1 多標(biāo)記免疫組織化學(xué)染色

1.1 傳統(tǒng)方法在多標(biāo)記免疫組織化學(xué)染色中的局限性

抗體種屬限制：自19世紀(jì)60年代起，酶標(biāo)抗體就被用在免疫組織化學(xué)染色中顯示特定目標(biāo)抗原在組織中的定量表達(dá)和定位分布，后來拓展到熒光標(biāo)記。免疫組織化學(xué)染色按報告蛋白的結(jié)合方式可以分為一抗直接標(biāo)記和二抗間接標(biāo)記兩種類型[3]。一抗直標(biāo)的方法操作簡單，但是標(biāo)記信號微弱，一般難以滿足弱信號檢測及精細(xì)的成像要求。為了達(dá)到足夠的染色強(qiáng)度，通常采用二抗標(biāo)記的方式。在多標(biāo)記免疫組織化學(xué)染色中，為了保證抗原標(biāo)記的特異性，必須要求在染色中針對不同抗原使用不同種屬來源的一抗抗體，借此保證二抗對目標(biāo)一抗種屬的特異性識別。但是實(shí)際科研工作中，抗體種屬來源的選擇非常少，很難積累到足夠多種類的優(yōu)質(zhì)抗體，因此常規(guī)免疫組織化學(xué)方法一般只能在同一樣本上同時標(biāo)記一到3種標(biāo)記物。

染料顏色重疊：限制多標(biāo)記免疫組織化學(xué)染色的另一個因素是染料重疊帶來的信號識別問題。由于組織中不同靶標(biāo)分子會在空間上出現(xiàn)位置重疊（即使沒有生物學(xué)意義上的相互作用），在成像檢測時不同染料信號在同一像素上的疊加就在所難免?；诿鲌龀上竦拿庖呓M織化學(xué)檢測一般采用酶標(biāo)記染色，在同一組織切片上進(jìn)行3種不同的酶鏈抗體顯色是非常困難的[4]。另外相近色染料如DAB（棕色）、AEC（紅色）、PermaRed（紅色）、Eosin（紅色）的組合使用，或者深色染料對淺色染料的遮蓋，都會使顏色混合在一起時變得難以區(qū)分；而且明場光學(xué)信號的非線性分布和較窄的動態(tài)范圍，密集的染料沉積也無法進(jìn)行有效的定量比較。另一種光學(xué)檢測方法是免疫熒光成像。熒光標(biāo)記具備更高的信噪比和強(qiáng)度線性相關(guān)性而在多標(biāo)記染色中獲得更廣泛的使用。借助窄帶通的濾光片可以對熒光信號進(jìn)行有效的區(qū)分，但是當(dāng)標(biāo)記染料達(dá)到4種或以上時，潛在的信號串色風(fēng)險同樣成為不容忽視的問題，加之較強(qiáng)的組織自發(fā)熒光背景干擾，使得高精度的光譜成像檢測成為多標(biāo)記免疫熒光檢測的必備方案[4-5]。除了光學(xué)檢測，質(zhì)譜技術(shù)因其較高的信號分辨率，也被用于免疫組織化學(xué)成像分析[6-7]。但是金屬標(biāo)記、燒蝕樣本的一次性檢測方式以及昂貴的質(zhì)譜設(shè)備都限制了這種方法的廣泛使用。

連續(xù)切片和順次染色法：為了擺脫抗體種屬來源沖突的限制，有研究者采用連續(xù)切片或多次洗脫復(fù)染的方式來實(shí)現(xiàn)多種抗原的關(guān)聯(lián)檢測[8]。連續(xù)切片樣品要求樣本數(shù)量要足夠，對于較小的組織樣本或珍貴的臨床標(biāo)本并不適合。而且由于切片厚度的限制和損耗，即使連續(xù)的兩張切片之間也難以做到微米級的精準(zhǔn)對齊，無法保持細(xì)胞的連貫性，也不能進(jìn)行單細(xì)胞級別的共定位分析。另一種嘗試是循環(huán)洗脫復(fù)染（SⅠMPLE技術(shù)），即對同一張組織切片進(jìn)行單標(biāo)記染色，采集圖像，然后洗脫染料和抗體后，再次進(jìn)行染色和成像，如此循環(huán)多次后再將每輪染色的圖像結(jié)果重疊起來以此實(shí)現(xiàn)多標(biāo)記檢測[9-10]。這種方法的缺點(diǎn)是多輪洗脫造成的樣本損傷（特別是抗原丟失）。因為是多輪成像，后期不同批次圖像的對齊分析，尤其是單細(xì)胞和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的對齊定位也是一個巨大的挑戰(zhàn)。而且每一輪染色之后信號會被徹底洗脫，因此無法對染色結(jié)果進(jìn)行二次檢測驗證（比如更換不同物鏡倍率進(jìn)行觀察），這也限制了該方法的應(yīng)用范圍[11]。

1.2 TSA信號放大技術(shù)及Opal多色標(biāo)記染色技術(shù)

近期一種新的基于酪胺信號放大（tyramine signal amplification，TSA） 技術(shù)衍生而來的多標(biāo)記免疫組織化學(xué)染色方法（PerkinElmer OpalTMKit）在研究報道中被廣泛使用[12-14]。酪胺信號放大技術(shù)已有20多年的歷史，是一類利用辣根過氧化酶（HRP）對靶抗原進(jìn)行高密度原位標(biāo)記的檢測方法，被廣泛應(yīng)用于ELⅠSA、ⅠSH、ⅠHC等技術(shù)中進(jìn)行生物學(xué)抗原的檢測，大幅提高被檢測信號的靈敏度（圖2A，圖2B）[15]。帶有染料標(biāo)記的底物酪胺（T）分子在過氧化氫氧化環(huán)境下，被抗體或探針固定的HRP轉(zhuǎn)化為具有短暫活性的中間狀態(tài)（T*），然后被激活的中間態(tài)分子（T*）迅速與相接蛋白分子的富含電子區(qū)域（酪氨酸殘基）進(jìn)行穩(wěn)定的共價結(jié)合，未被標(biāo)記的酪胺分子將被洗脫，借此實(shí)現(xiàn)對抗原的特異性染色。由于相接的蛋白（包括HRP，抗體，目標(biāo)抗原）都含有大量的酪氨酸結(jié)合位點(diǎn)，所以目標(biāo)抗原處會富集大量標(biāo)記分子，使信號被有效放大[16]（圖2C）。Opal技術(shù)利用TSA染色中酪胺分子與其結(jié)合的抗原蛋白之間共價鍵的穩(wěn)定性，其鍵能遠(yuǎn)高于抗原、抗體間的非共價鍵結(jié)合力，通過微波加熱法就可以在保留抗原標(biāo)記信號的同時去除結(jié)合在抗原上的一抗和二抗分子，借此實(shí)現(xiàn)抗原的直接標(biāo)記（圖2D）。后續(xù)可以再次使用同一種屬來源的抗體標(biāo)記其他抗原靶點(diǎn)，只需更換不同的標(biāo)記顏色，而不必考慮上一輪抗體的交叉干擾。Opal技術(shù)徹底解決了多標(biāo)記免疫組織化學(xué)染色中抗體種屬選擇的限制，在設(shè)計抗體組合時只需根據(jù)各抗體的效價來為各個靶點(diǎn)選擇最優(yōu)的抗體即可。

Opal技術(shù)的染色流程與普通免疫組織化學(xué)染色相近，只是在每一輪染色過程中增加了一個抗體洗脫步驟（圖3）?？贵w洗脫一般采用微波加熱的方式，與抗原修復(fù)過程近似，所以不會對樣本及抗原造成過分的損傷。通過微波洗脫處理可以將以非共價鍵結(jié)合在抗原上的抗體去除，但是保留以共價鍵結(jié)合在抗原表面的TSA熒光信號，從而實(shí)現(xiàn)無抗體干擾的抗原直接標(biāo)記，再經(jīng)過多輪染色循環(huán)實(shí)現(xiàn)多色標(biāo)記。

圖2 酪胺信號放大（TSA）染色與傳統(tǒng)組織化學(xué)染色比較。A，Hela細(xì)胞細(xì)胞色素C經(jīng)常規(guī)二抗標(biāo)記的免疫熒光染色的結(jié)果；B，相同濃度下經(jīng)TSA信號放大的結(jié)果；C，TSA染色過程；D，TSA/Opal與傳統(tǒng)免疫染色標(biāo)記方法的比較Fig. 2 Comparison between TSA and conventional immunostaining. A, conventional detection of cytochrome C in Hela cell with fluorescence labeled secondary antibody; B, TSA detection of cytochrome C in Hela cell where the deposition of fluorescence labels was amplified proximal to the target antigens; C, TSA staining process; D, comparison between different staining methods

雖然都是采用順次單標(biāo)、多輪復(fù)染的方式，但是Opal與SⅠMPLE等染色洗色、多輪拍照的方法存在著本質(zhì)的不同。Opal在每輪染色中間的洗脫環(huán)節(jié)只需去除抗體，不需要對抗原上的標(biāo)記進(jìn)行徹底洗脫，所以對樣本的損傷會更??；經(jīng)由Opal染色的多種抗原標(biāo)記物可以在樣本上同時存在，同時拍攝檢測記錄在同一張圖像畫面上，而無需后期對不同畫面進(jìn)行加工對齊，這樣就保證了標(biāo)記物間定位的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性；并且樣本可以保存長達(dá)一年的時間，隨時可以根據(jù)需要進(jìn)行再次采圖拍攝查驗[4]。三色以下的Opal復(fù)染樣本對成像檢測設(shè)備的要求不高，可以用普通熒光顯微鏡或共聚焦設(shè)備來采集圖像。但是對更多色標(biāo)記的復(fù)染樣本，尤其是獲得無組織自發(fā)熒光干擾的高信噪比圖像，就需要借用專業(yè)的光譜成像設(shè)備來進(jìn)行檢測。

2 光譜成像和信號拆分

經(jīng)由多色免疫熒光染色的樣本包含多維的生物學(xué)信息，包括組織結(jié)構(gòu)信息、不同細(xì)胞型的空間分布信息、不同信號通路蛋白或細(xì)胞功能標(biāo)識物的共表達(dá)信息等。對這些信息的完整記錄和充分解讀，對于研究疾病發(fā)生發(fā)展的機(jī)制，探討診斷和治療疾病的有效方法有著重要意義。然而如上文所述，連續(xù)切片成像和普通濾光片成像的方式都難以完整記錄或準(zhǔn)確識別混雜重疊的多標(biāo)記信號，需要專業(yè)的檢測方法才能對多標(biāo)記染色樣本中的信息進(jìn)行有效的記錄和解讀。

圖3 Opal多色免疫熒光染色流程圖Fig. 3 The Opal multiplex IHC workflow

多光譜成像是檢測復(fù)雜染色樣品信號的有效手段，不僅能對混雜的各色信號進(jìn)行識別，而且能夠去除自發(fā)熒光的干擾。實(shí)現(xiàn)光譜成像的設(shè)備包括光譜型共聚焦顯微鏡（如Zeiss LSM880，Leica SP8等等）和多光譜組織成像系統(tǒng)（PerkinElmer Vectra?）。前者主要用于亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的細(xì)微成像或厚樣本的深層觀察，對于普通的組織切片（3～5μm），在20×物鏡的解析度下，共聚焦提供的光學(xué)層切功能并不是一個必要的選項。而點(diǎn)掃描共聚焦較慢的掃描速度、高強(qiáng)度的光漂白以及缺少配套的組織分析軟件，都使其難以成為組織切片多色成像及定量分析的首選方案。

多光譜組織成像系統(tǒng)是專為組織切片定量分析設(shè)計的專業(yè)成像系統(tǒng)，其最大的特色在于圖像光譜信息的采集，同時提供生物組織樣本的形態(tài)結(jié)構(gòu)和光學(xué)圖譜兩方面的信息。傳統(tǒng)的光學(xué)成像只記錄樣本二維畫面中的灰度或者色彩信息，而光譜圖像是由不同波段二維圖像構(gòu)成的三維圖組（Cube）[4,5]。在Vectra成像系統(tǒng)中，采用液晶可調(diào)諧濾波器（LCTF）以20nm的步進(jìn)在420～720nm可見光范圍內(nèi)的進(jìn)行光譜掃描，各波段采集的高分辨率圖像被相機(jī)完整的記錄并合為一體。因此光譜圖像中的任何一個像素點(diǎn)都包含著一段完整的光譜曲線，每一種染料（包括自發(fā)熒光）也都有其對應(yīng)的特征光譜（圖4）。利用樣品標(biāo)記中的已知染料光譜，就可以將各色信號從多光譜圖像中拆分出來，變成富含光密度信息的獨(dú)立單通道圖像[5]。

光譜成像在組織學(xué)分析中具有其獨(dú)特的技術(shù)優(yōu)勢。對于明場免疫組織化學(xué)染色樣品，借助多光譜成像可以對混雜的染料進(jìn)行有效的識別、拆分和定量，即使是顏色相近的DAB（棕色）或PermaRed（紅色）染料也能被拆分開來，并實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)的定量[17]。而且經(jīng)光譜記錄的明場圖像，可以把拆分得到的單通道圖像的顏色進(jìn)行任意調(diào)整，或者轉(zhuǎn)變?yōu)闊晒庑Ч▓D5A，圖5B）來呈現(xiàn)不同通道間的共定位效果[18]。對于熒光染色的樣品，特別是福爾馬林固定石蠟包埋的樣品，光譜成像可以通過去除組織自發(fā)熒光來提高圖像的信噪比達(dá)十倍以上[19]。多于多標(biāo)記免疫熒光染色的樣品，借助多光譜成像技術(shù)可以對多達(dá)十色復(fù)染的信號進(jìn)行準(zhǔn)確拆分，獲得清晰的、無串?dāng)_的、高清晰圖單通道圖像[12-14]。同樣經(jīng)光譜記錄的熒光染色樣品圖像，也可以轉(zhuǎn)變?yōu)閭鹘y(tǒng)HE或免疫組織化學(xué)樣式的明場效果圖（圖5C—圖5F）便于形態(tài)結(jié)構(gòu)的辨識和病理觀察[19]。

3 智能組織定量軟件分析

在傳統(tǒng)組織學(xué)研究中，對于免疫組織化學(xué)和免疫熒光圖像的評判多采用人工判讀的方式。通過人工計數(shù)來觀察陽性著色組織的面積比例和分布是一種常用的半定量分析方法，但是需要耗費(fèi)大量的人力和時間，而且其結(jié)果因為存在較大的判讀誤差和主觀傾向性而導(dǎo)致難以做到客觀準(zhǔn)確[20]。隨著信息技術(shù)的發(fā)展，很多圖像分析軟件如Ⅰmage Pro、Ⅰmage J等被用來輔助進(jìn)行組織學(xué)定量分析。但是對于復(fù)雜組織的自動化分析，因為組織樣本的形態(tài)結(jié)構(gòu)與組成極為復(fù)雜（如腫瘤組織、癌旁組織、血管、壞死組織等），造成普通軟件無法自動識別不同的組織類型，難以滿足研究者定量分析特定區(qū)域抗原表達(dá)的要求，極大的限制了自動化批量定量組織分析的應(yīng)用。

圖4 七色免疫熒光標(biāo)記的乳腺癌組織切片多光譜圖像的信號拆分。A，每種染料的特征光譜圖；B1-B8，經(jīng)光譜拆分所得的單通道圖像；C，原始圖像；D，多光譜合成圖像Fig. 4 Multispectral image unmixing of Opal seven-color multiplex staining of human breast cancer sample. A, spectral properties of each Opal dye; DAPI and autofluorescence were analyzed to generate a spectral library to support multispectral unmixing; B1 to B8, independent signal effectively extracted from the multiplex stain image; C, original image; D, multispectral composite image

新型的專業(yè)定量病理分析軟件（PerkinElmer inFormTM）將智能組織識別算法與光譜解讀和多標(biāo)記分析融為一體。利用光譜和多色標(biāo)記提供的豐富信息，軟件可以通過圈選—訓(xùn)練的方式，將研究者的判讀經(jīng)驗轉(zhuǎn)變?yōu)榭陀^算法，自動的將具有特異性結(jié)構(gòu)的目標(biāo)組織區(qū)域識別分割開來，從而實(shí)現(xiàn)只針對感興趣區(qū)域的定量統(tǒng)計分析，大大提高了數(shù)據(jù)分析的效率和精度。

多色標(biāo)記技術(shù)和光譜拆分技術(shù)帶來的另一個優(yōu)勢是識別不同的細(xì)胞表型，并對細(xì)胞中表達(dá)的特定蛋白進(jìn)行量化評分。借助特異的細(xì)胞標(biāo)記物可以對組織微環(huán)境中的不同細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)識，再通過光譜采集和信號拆分，得到不同細(xì)胞表型的圖像。軟件首先根據(jù)核標(biāo)記（DAPⅠ）信號對組織中的細(xì)胞進(jìn)行識別，并進(jìn)一步的對胞漿、胞膜進(jìn)行分割，然后根據(jù)不同細(xì)胞中相應(yīng)標(biāo)記物信號強(qiáng)度和形態(tài)特征以訓(xùn)練學(xué)習(xí)的方式將其歸屬為不同的細(xì)胞類群。還可以對不同蛋白在特定細(xì)胞、特定部位上的表達(dá)強(qiáng)度進(jìn)行定量測定，給出免疫組織化學(xué)評分結(jié)果，或者是共定位表達(dá)的比例（圖6）。由此就在組織原位完成了組織類別、細(xì)胞類別、細(xì)胞亞結(jié)構(gòu)乃至蛋白表達(dá)逐級細(xì)化的精準(zhǔn)識別，將過去在流式細(xì)胞儀上才能實(shí)現(xiàn)的細(xì)胞分型統(tǒng)計與組織形態(tài)學(xué)有機(jī)的結(jié)合在一起，實(shí)現(xiàn)了組織微環(huán)境的完整描繪。

圖5 光譜圖像的明場和熒光效果互換。A和B，乳腺癌組織，p21（DAB染色）和p27（LPR染色）和蘇木精復(fù)染的彩色圖像(A)及經(jīng)光譜拆分和色彩轉(zhuǎn)換得到對比度更高的明場（B左上）或熒光紅綠共定位顯示效果（B右下）；C，乳腺癌組織，ER（A488）/PR（A594）/HER2（A647）/DAPⅠ四色標(biāo)記圖像；D-F，經(jīng)光譜拆分后以DAB效果顯示的ER（D）、HER2（E）和PR（F）染色Fig. 5 Multispectral images can be shown with simulated composite images comprised of unmixed component images. A and B,breast cancer tissue was stained for p21 (DAB) and p27 (LPR) and counter stained with HE; color image of the sample through the oculars (A), simulated bright (upper left in B) or fluorescence composite images to show colocalization (lower right in B); C, breast cancer tissue was stained for ER(A488)/PR(A594)/HER2(A647)/ DAPⅠ; D to F, the multispectral image was unmixed and shown for simulated DAB image for ER(D), HER2(E) and PR(F) separately.

4 應(yīng)用領(lǐng)域

多標(biāo)記免疫熒光染色、多光譜成像以及定量病理分析技術(shù)三者融合為一個完整的流程方案，可以大幅提升組織形態(tài)學(xué)分析數(shù)據(jù)的精度，有助于從組織切片樣品中挖掘出更豐富、更可靠的關(guān)聯(lián)信息[4]。Mansfield對光譜技術(shù)在組織病理學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)行了系統(tǒng)的總結(jié)[5]，尤其在腫瘤、神經(jīng)、心血管等疾病研究領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。

新型組織分析技術(shù)可以大幅提高腫瘤組織研究的效率和精度。2011年美國賓夕法尼亞大學(xué)即在《Nature》上發(fā)文，借助光譜成像技術(shù)把通過雙色免疫組織化學(xué)標(biāo)記在一起的DAB標(biāo)記的CA ⅠX信號和Perma Red標(biāo)記的CCL28信號準(zhǔn)確的拆分開來，借此研究腫瘤缺氧與血管生成的關(guān)系[17]。加拿大Salk癌癥中心2013年利用光譜成像和軟件識別技術(shù)對小鼠組織的腫瘤區(qū)域面積進(jìn)行了自動劃分和測量統(tǒng)計；荷蘭學(xué)術(shù)醫(yī)學(xué)中心在研究腫瘤干細(xì)胞Wnt靶向蛋白的甲基化與直腸癌的預(yù)后相關(guān)性時，則借助光譜成像和分析軟件針對腫瘤組織（不含基質(zhì)區(qū)域）的βcatenin陽性染色結(jié)果進(jìn)行了準(zhǔn)確評定。在組織芯片（TMA）分析中，新技術(shù)帶來的優(yōu)勢更為明顯，因其是對大量組織樣本進(jìn)行平行染色和高通量分析，用傳統(tǒng)方法處理頗具挑戰(zhàn)性。而多色標(biāo)記的方法首先就可以大幅節(jié)省組織芯片樣本的制備成本，例如Schalper等人利用Opal多標(biāo)記染色的方法，在同一張組織芯片上復(fù)染了PD-L1、ⅠDO1和B7-H4 3種目標(biāo)蛋白，分析比較三者表達(dá)的相關(guān)性[21]。同時因為3種蛋白的數(shù)據(jù)均來自相同的樣本和批次，使得數(shù)據(jù)間的量化比較也更加可靠。而光譜成像可以獲得更準(zhǔn)確的信號定量結(jié)果，配合智能定量軟件可以實(shí)現(xiàn)大批量視野的全自動分析，大幅提高組織芯片分析的效率。例如美國Dana-Farber腫瘤研究所2011年在《Nature》上發(fā)文闡述SMAD4在前列腺癌發(fā)生過程中的作用，研究中就使用光譜成像和配套軟件來進(jìn)行組織芯片樣本的自動化分析，并在2015年進(jìn)一步使用該技術(shù)闡述了雄激素受體在前列腺癌腫瘤生成中的重要作用[28]；美國哈佛公共衛(wèi)生學(xué)院2011年也在研究前列腺腫瘤組織維生素D受體蛋白表達(dá)時，利用光譜成像對組織芯片樣本中的VDR蛋白進(jìn)行了自動定量統(tǒng)計分析[29]；

圖6 智能組織定量軟件分析流程。A，原始圖像；B，光譜拆分后的圖像（黃色，CD8；綠色，PD-L1；紅色，panCK；藍(lán)色，DAPⅠ）；C，識別組織類型（紅色陰影，腫瘤；綠色陰影，間質(zhì)）和細(xì)胞；D，識別細(xì)胞表型（紅色，CD8+；綠色，panCK+；藍(lán)色，其他類型細(xì)胞）；E，腫瘤組織中PD-L1陽性細(xì)胞比例；F，腫瘤和間質(zhì)中CD8+和PD-L1+細(xì)胞的數(shù)目Fig. 6 (Process of intelligent quantitative tissue analysis software) Combined spectral, morphologic and cellular analysis of a tissue section. A, multiplexed fluorescence image; B, unmixed multispectral image (yellow, CD8; green, PD-L1; red, panCK; blue, DAPI); C, automated tissue segmentation (red shadow, tumor; green shadow, stroma); D, cell phenotype analysis (red, CD8+; green, pamCK+; blue, other cells); E, PD-L1 positive cell analysis in tumor; F, counts of CD8+ and PD-L1+ cells within tumor and stroma

借助多標(biāo)記組織成像的方法還可以對腫瘤組織微環(huán)境進(jìn)行全景描繪（Landscape），其在腫瘤免疫研究中的意義極為重要，能夠提供傳統(tǒng)組織病理分析方法不能發(fā)現(xiàn)的深層信息[13]。借助多標(biāo)記分析，Mlecnik等人發(fā)現(xiàn)腫瘤微環(huán)境和免疫評分是腫瘤轉(zhuǎn)移的重要決定因素[22]。Feng等的人的研究表明，在分離有活性的腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞時，多標(biāo)記分析同樣具有重要的預(yù)測價值。美國MD Anderson 腫瘤研究中心利用多標(biāo)記分析進(jìn)行了精細(xì)研究，認(rèn)為T細(xì)胞的空間分布與胰腺癌病人的預(yù)后緊密相關(guān)，其結(jié)果最近發(fā)表在《Nature Communication》上。研究中使用了Opal試劑對胰腺癌組織的多個免疫靶點(diǎn)（CD3/CD4/CD8/FoxP3）及腫瘤（CK8）進(jìn)行了標(biāo)記，隨后利用Vectra光譜成像系統(tǒng)和inForm軟件分析對腫瘤組織和癌旁組織進(jìn)行了區(qū)分，再分別對不同組織中的免疫細(xì)胞進(jìn)行表型鑒別和統(tǒng)計分析。inForm提供的精確數(shù)據(jù)使得檢測腫瘤細(xì)胞特定距離范圍內(nèi)的T細(xì)胞數(shù)量成為可能，借此來判斷T細(xì)胞的殺傷效率[8]。這是一種全新的組織微環(huán)境分析方法，提供了傳統(tǒng)方法無法實(shí)現(xiàn)的高精度細(xì)胞表型分布信息，為疾病的診斷和治療提供了重要的數(shù)據(jù)支持。除此之外，多標(biāo)記和光譜分析技術(shù)在肺癌[30]、前列腺癌[31]、黑色素瘤[32]、胰腺癌[33]、肝癌[34]、乳腺癌[35]、頭頸細(xì)胞癌[36]、腎小細(xì)胞癌[37]、腎纖維化[38]等的研究中都有大量的應(yīng)用，研究內(nèi)容涉及腫瘤標(biāo)志物、腫瘤干細(xì)胞、腫瘤免疫、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[39-40]等。

在神經(jīng)科學(xué)研究領(lǐng)域，多光譜成像也被用于神經(jīng)退行性疾病的研究，例如德國Darmstadt大學(xué)利用光譜技術(shù)評價新型探針在腦組織中對Tau蛋白纖維的檢測效果；荷蘭Amsterdam大學(xué)使用光譜技術(shù)研究腦皮質(zhì)發(fā)育畸形中的細(xì)胞損傷凋亡和神經(jīng)退行信號通路中的蛋白表達(dá)；美國Nebraska大學(xué)醫(yī)學(xué)中心在研究CCL2蛋白對小鼠神經(jīng)功能紊亂的影響時，利用光譜成像分析皮層和海馬區(qū)的Aβ/Iba1/ doublecortin蛋白的表達(dá)；荷蘭皇家科學(xué)院神經(jīng)研究所利用光譜成像扣除自發(fā)熒光，對不同Braak階段Aβ蛋白在胞內(nèi)和胞外的表達(dá)情況進(jìn)行清晰的分辨[23-25]。

在心血管疾病研究中，早在2008年美國斯坦福大學(xué)醫(yī)學(xué)院心胸外科就曾報道，在先天性心臟病嬰兒的活檢組織中使用多光譜成像技術(shù)檢測多種分子標(biāo)記，可以分析新生兒產(chǎn)后早期階段不同心肌祖細(xì)胞的數(shù)量以及各種診治手段下的細(xì)胞數(shù)量變化趨勢。美國曼徹斯特大學(xué)醫(yī)學(xué)院也曾借助多光譜技術(shù)來扣除了血管的自發(fā)熒光背景干擾，進(jìn)而觀察納米顆粒圍繞頸動脈的分布細(xì)節(jié)[26,27]。

5 展望

隨著轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)和精準(zhǔn)醫(yī)療研究的深入開展，研究者對于組織形態(tài)和病理學(xué)定量分析的要求將越來越高。多標(biāo)記染色、多光譜成像和智能分析軟件三者緊密結(jié)合，大幅提高了組織形態(tài)學(xué)分析的數(shù)據(jù)精度和準(zhǔn)確度，不僅滿足了現(xiàn)代組織學(xué)分析在數(shù)據(jù)客觀性、精確性方面的更高要求，更是從方法學(xué)角度為組織學(xué)研究帶來了革命性的變化，為描繪復(fù)雜的組織微環(huán)境提供了的全新的思路，必將為定量病理學(xué)的蓬勃發(fā)展提供新的契機(jī)。

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Application of multiplexed immunofluorescent staining and multi-spectral imaging in histological studies

Qian Bangguo, Jiao Lei*
(PerkinElmer China, Shanghai 201203)

Ⅰmmunohistochemical staining and imaging analysis technology is indispensable for the study of tissue morphology and in situ antigen expression. It is widely used in various fields of clinical pathology diagnosis and biological research. The tissue slice sample contains a lot of information, but due to the restriction of traditional single-labeled immunohistochemical staining method, only one or two target antigens can be detected at same time. The quantitative interpretation of the results is often dependent on naked eye observation and lacks objective criteria. With the development of proteomics, there are increasing demands on more sophisticated modern histological analysis, such as different protein co-expression and co-localization analysis, low abundance molecular detection, heterogeneity analysis, cell phenotype statistics, and complex tissue microenvironment description. These features are essential in detecting a variety of target molecules in the same tissue slice simultaneously so that researchers can understand the relationship among various cells in tissue microenvironment, predict the relationship between upstream and downstream protein expression, and develop clinical diagnosis and treatment regimen. This review presents a multi-labeled immunofluorescence staining method based on tyramine signal amplification (TSA) technology. It allows more than seven different markers on the same tissue slice using different colored dyes combined with spectral imaging and quantitative analysis software, therefore the abundant in situ tissue information can be accurately presented. This set of process-oriented analysis can provide more accurate and reliable histological data for clinical diagnosis and scientific research, and bring the immunohistochemical analysis to a higher level.

Multiplexed immunohistochemistry; multispectral imaging; tyramide signal amplification; quantitative pathology

R329-3

A DOⅠ：10.16705/ j. cnki. 1004-1850.04.010

2017-01-20

2017-07-30

錢幫國，男（1989年），漢族，碩士

*通訊作者(To whom correspondence should be addressed)：raymond.jiao@foxmail.com