許慧嬌

（烏蘭察布職業(yè)學(xué)院，內(nèi)蒙古烏蘭察布012000）

DSPE-LC-MS/MS法測定海紅果中9種殺菌劑殘留量

許慧嬌

（烏蘭察布職業(yè)學(xué)院，內(nèi)蒙古烏蘭察布012000）

建立分散固相萃?。―SPE）-液相色譜-質(zhì)譜法（LC-MS/MS）測定海紅果中9種殺菌劑（嘧霉胺、百菌清、稻豐散、甲霜靈、三唑酮、五氯硝基苯、烯酰嗎啉、咪鮮胺、苯醚甲環(huán)唑）殘留量的檢測方法。樣品勻漿粉碎后經(jīng)乙腈提取、氧化鋁萃取劑凈化后，采用Atlantis T3色譜柱分離，LC-MS/MS測定。結(jié)果表明：9種殺菌劑在5.0 μg/L～500 μg/L范圍內(nèi)，呈良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù) R2≥0.999 3；檢出限為 0.03 μg/kg～1.0 μg/kg，定量限為 0.1 μg/kg～3.0 μg/kg；回收率在80.4%～102.3%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）在1.1%～5.8%之間。

殺菌劑；分散固相萃取；液相色譜-質(zhì)譜；海紅果

殺菌劑，又稱殺生劑、殺菌滅藻劑、殺微生物劑等，是作為防治各種病原微生物的一類農(nóng)藥[1-2]。它在果蔬生產(chǎn)中發(fā)揮了防治病蟲害、保證果蔬生長、穩(wěn)定產(chǎn)量等作用，但其農(nóng)藥殘留問題也日益突出，可對人體、環(huán)境造成危險或破壞。因此有必要對果蔬中殺菌劑殘留量進(jìn)行監(jiān)督檢測。目前關(guān)于果蔬中殺菌劑的檢測方法有氣相色譜法[3-4]、氣相色譜-質(zhì)譜法[4-7]、液相色譜-質(zhì)譜法[8-9]，常用液液萃取、固相萃?。⊿PE）、固相微萃?。⊿PME），但其存在操作繁瑣、費時、費用較高等問題。

分散固相萃取（DSPE）是將固相萃取吸附劑分散在樣品提取液中，提高比表面積，促進(jìn)吸附干擾組分，該方法較SPE具有更簡便、快捷、成本小、萃取效果好等特點[10-13]，近年來已廣泛應(yīng)用到果蔬等作物中農(nóng)藥殘留檢測[10-14]。但是，采用分散固相萃取同時檢測水果中殺菌劑的報道較少。

海紅果，是我國特色果品，海紅果營養(yǎng)豐富，藥食同源，果實含可溶性糖、維生素C，還含有人體所需的多種微量元素，其中鈣含量居水果之首，素有“果中鈣王”之美稱。本研究以海紅果為研究對象，針對9種殺菌劑（嘧霉胺、百菌清、稻豐散、甲霜靈、三唑酮、五氯硝基苯、烯酰嗎啉、咪鮮胺、苯醚甲環(huán)唑），采用DSPE進(jìn)行樣品前處理，研究不同提取溶劑及萃取吸附劑對提取凈化效果的影響，建立了DSPE-液相色譜-質(zhì)譜法（LC-MS/MS）測定水果中9種殺菌劑的檢測方法，可為果蔬中殺菌劑的檢測提供方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

6460 Triple Quad型液質(zhì)聯(lián)用儀：美國Agilent公司；3K15型冷凍高速離心機(jī)：Sigma公司；KQ-500E型超聲波清洗機(jī)：昆山市超聲儀器有限公司；Mix II型漩渦震蕩器：賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

嘧霉胺、百菌清、稻豐散、甲霜靈、三唑酮、五氯硝基苯、烯酰嗎啉、咪鮮胺、苯醚甲環(huán)唑標(biāo)準(zhǔn)品（1000mg/mL，純度均≥99%）：農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所；乙腈和甲醇（色譜純）：美國天地有限公司；乙酸銨（色譜純）：Sigma公司；N-丙基乙二胺吸附劑（PSA）、石墨化碳黑（GCB）：天津博納艾杰爾科技有限公司；十八烷基鍵合硅膠吸附劑（C18）：安捷倫科技（中國）有限公司；中性氧化鋁（純度99.5%）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 LC-MS/MS條件

色譜條件：色譜柱為Waters Atlantis T3（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相 A 為 0.05%甲酸溶液，流動相B為純乙腈；流速為1.0 mL/min；進(jìn)樣量為10 μL；柱溫為 30℃。梯度洗脫程序為：0.0～1.0min，80%A；1.0 min～3.0 min，60%A；3.0 min～5.0 min，10%A；5.0 min～6.5 min，20%A；6.5 min～8.0 min，80%A。

質(zhì)譜條件：電離方式為ESI（+）；氣流溫度為350℃；氣流速度為6 L/min；霧化氣為45 psi（1 psi=6.895 kPa）；鞘氣為N2，溫度為350℃，流速為10 L/min；毛細(xì)管電壓為4 000 V；噴霧電壓為1 000 V，電子倍增電壓為400 V；測定方式為選擇反應(yīng)監(jiān)測方式（MRM）；其它質(zhì)譜條件見表1。

表1 9種殺菌劑質(zhì)譜條件Table 1 Mass condition of nine fungicides

續(xù)表1 9種殺菌劑質(zhì)譜條件Continue table 1 Mass condition of nine fungicides

1.3 樣品前處理

將待測樣品粉碎，稱取樣品5 g（精度0.1 mg）于50 mL離心管中，加入10 mL乙腈，加入1 g氯化鈉，渦旋1 min，超聲萃取10 min，加入4 g無水硫酸鎂，渦旋震蕩2 min，10 000 r/min離心5 min，取5.0 mL上層清液，加入1 g氧化鋁渦旋1 min，10 000 r/min離心5 min，取上層清液，過0.22 μm微孔濾膜，濾液供LCMS/MS測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 DSPE提取溶劑的選擇

考察了乙腈、甲醇、丙酮作為DSPE提取溶劑對9種殺菌劑的提取效果，結(jié)果見圖1。

圖1 提取溶劑的選擇Fig.1 Selection of extraction solvent

從圖1中可知：以乙腈作為提取溶劑時，提取率在80.1%～93.7%，提取率平均值為88.1%，高于甲醇（72.2%）和丙酮（69.3%），這可能是由于乙腈對不同極性的農(nóng)藥均有一定程度的溶解能力，適合于多種類農(nóng)藥殘留的提取[12-16]；甲醇和丙酮作為提取溶劑時，提取液較為渾濁，而乙腈作為提取溶劑時，提取液較為澄清透明，這可能是由于乙腈極性較強(qiáng)，可使蛋白質(zhì)變性，從而凈化效果較好。因此提取溶劑選擇乙腈。

2.2 DSPE吸附劑的選擇

考察了N-丙基乙二胺吸附劑（PSA）、十八烷基鍵合硅膠吸附劑（C18）、石墨化碳黑（GCB）和中性氧化鋁4種分散固相萃取吸附劑對海紅果中9種殺菌劑的凈化回收效果，結(jié)果見圖2。

圖2 DSPE吸附劑種類的選擇Fig.2 Selection of the adsorbent of DSPE

從圖2中可知：以PSA為吸附劑時，可有效去除樣品中的糖類、脂肪、色素，9種殺菌劑回收率在65.7%～92.8%之間；以C18為吸附劑時，可有效去除糖類、親脂型雜質(zhì)，但對苯醚甲環(huán)唑的保留作用較強(qiáng)，從而造成苯醚甲環(huán)唑回收率低，殺菌劑回收率在62.1%～91.7%之間；以GCB為吸附劑時，可有效去除各種色素，但對含有苯環(huán)官能團(tuán)的目標(biāo)物（五氯硝基苯、烯酰嗎啉、咪鮮胺、苯醚甲環(huán)唑）有很強(qiáng)的吸附，回收率小于50%；以中性氧化鋁為吸附劑時，可有效去除芳香族和脂肪族的化合物，殺菌劑回收率在78.1%～98.6%之間?？紤]回收率和凈化效果，本研究DSPE吸附劑的選擇中性氧化鋁。

2.3 線性范圍、檢出限與定量限

將9種殺菌劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液分別配制為2.5、5.0、10.0、50.0、100.0、500.0 μg/L 系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液，以9種殺菌劑標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)、定量離子的峰面積（y）為縱坐標(biāo)，繪制線性關(guān)系曲線，對測定結(jié)果進(jìn)行線性相關(guān)分析見表2。

結(jié)果表明：9 種殺菌劑在 5.0 μg/L～500.0 μg/L 濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好（R2≥0.999 3），可以滿足定量分析的要求。根據(jù)3倍信噪比計算9種殺菌劑的方法檢出限（S/N=3）為 0.03 μg/kg～1.0 μg/kg；根據(jù)10倍信噪比計算9種殺菌劑的方法定量限（S/N=10）為0.1 μg/kg～3.0 μg/kg，滿足果蔬中痕量農(nóng)藥的檢測要求。

表2 9種殺菌劑的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限Table 2 Regression equation，correlation coefficient，detection limit and quantitative limit of 9 fungicides

2.4 回收率與精密度

采用海紅果空白樣品，進(jìn)行 5.0、250.0、500.0 μg/kg 3種濃度加標(biāo)回收率和精密度試驗，按照上述所建方法進(jìn)行進(jìn)行測定，每個濃度重復(fù)6次，回收率和精密度數(shù)據(jù)見表3，空白海紅果9中殺菌劑加標(biāo)的總離子流色譜圖見圖3。

表3 空白樣品基質(zhì)加標(biāo)回收率Table 3 Recovery rate of blank sample

圖3 空白海紅果加標(biāo)總離子流色譜圖Fig.3 TIC chromatogram of Malus micromalus makino of added standard

結(jié)果表明：9種殺菌劑的加標(biāo)回收率在80.4%～102.3%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）在1.1%～5.8%之間，這說明該方法符合方法學(xué)的要求，且準(zhǔn)確度高、精密度好。

2.5 實際樣品的測定

采集市售海紅果30份，按照1.3樣品前處理進(jìn)行處理，按照1.2 LC-MS/MS條件進(jìn)行測定，結(jié)果表明：30份測試樣中，9種殺菌劑陽性檢出率3種，按照檢出率高低順序依次為：苯醚甲環(huán)唑（23.3%）＞咪鮮胺（13.3%）＞烯酰嗎啉（6.7%），其余6種殺菌劑均未檢出；市售海紅果中，苯醚甲環(huán)唑的殘留情況最為嚴(yán)重，7份海紅果樣品檢出苯醚甲環(huán)唑殘留，殘留量高達(dá)217.3 μg/kg。根據(jù)GB 2763-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中農(nóng)藥最大殘留限量》各類水果中殺菌劑最大殘留量要求，30份樣品中9種殺菌劑均未超標(biāo)，但存在一定的食品安全風(fēng)險，若長期食用殘留殺菌劑的果蔬可對人體產(chǎn)生危害。

3 結(jié)論

建立分散固相萃取（DSPE）-液相色譜-質(zhì)譜法（LC-MS/MS）測定海紅果中9種殺菌劑（嘧霉胺、百菌清、稻豐散、甲霜靈、三唑酮、五氯硝基苯、烯酰嗎啉、咪鮮胺、苯醚甲環(huán)唑）殘留量的檢測方法。結(jié)果表明：9種殺菌劑在5.0 μg/L～500 μg/L范圍內(nèi)，呈良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù) R2≥0.999 3；檢出限為 0.03 μg/kg～1.0 μg/kg，定量限為 0.1 μg/kg～3.0 μg/kg；回收率在80.4%～102.3%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）在 1.1%～5.8%之間。該方法可同時測定9種殺菌劑殘留量，且具有操作簡單、回收率高、精密度好、靈敏度好等特點，滿足果蔬中農(nóng)藥殘留量的分析要求，可為政府行政監(jiān)督提供檢測技術(shù)支持。

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Determination of Nine Fungicides Residues in Malus micromalus makino by Dispersive Solid Phase Extraction and Liquid Chromatography Mass Spectrometry

XU Hui-jiao
（Ulanqab Vocational College，Ulanqab 012000，Inner Mongolia，China）

A method were developed for determination of nine fungicides（pyrimethanil，chlorothalonil，phenthoate，metalaxyl，triadimefon，pentachloronitrobenzene，dimethomorph，prochloraz and difenoconazole）in Malus micromalus makino by dispersive solid phase extraction（DSPE）and liquid chromatography tandem mass spectrometry（LC-MS/MS）.The sample were homogenized and extracted by acetonitrile and purified by alumina extractant，and separated by Atlantis T3 column，and determined by LC-MS/MS.The results showed that the standard curves of nine fungicides showed good linear responses in the range of 5.0 μg/L-500.0 μg/L，and the linear correlation coefficient R2were no less than 0.999 3；the limits of detection were in the range of 0.03 μg/kg-1.0 μg/kg，and the limit of quantification were in the range of 0.1 μg/kg-3.0 μg/kg；the rate of recovery were in the range of 80.4%-102.3%，and the relative standard deviation（RSD）were in the range of 1.1%-5.8%.

fungicide；dispersive solid phase extraction；liquid chromatography tandem mass spectrometry（LC-MS/MS）；Malus micromalus makino

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.17.037

2017-01-12

許慧嬌（1985—），女（漢），講師，碩士，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程。