徐兵，尹瑞，王喆，冀宏

（常熟理工學院生物與食品工程學院，江蘇常熟215500）

響應面優(yōu)化微波輔助提取海鮮菇廢菌棒中多糖工藝

徐兵，尹瑞，王喆，冀宏*

（常熟理工學院生物與食品工程學院，江蘇常熟215500）

采用微波輔助提取工藝從海鮮菇廢菌棒中提取多糖，通過控制提取時間、微波功率以及液料比3個提取條件來優(yōu)化提取工藝。在單因素試驗基礎上，結合響應面法，得出優(yōu)化后的提取參數：提取時間10 min，微波功率420 W，液料比31∶1（mL/g）。在此條件下海鮮菇廢菌棒多糖的提取效果最佳，提取率為2.01%。

海鮮菇廢菌棒；微波輔助提??；響應曲面法

海鮮菇（Hypsizygusmarmoreus（Peck）H.E.Bigelow），又稱斑玉蕈或真姬菇，海鮮菇的質地極為爽脆，其味道也極為鮮美[1]。海鮮菇富含十余種氨基酸，其中谷氨酸和天冬氨酸兩種呈味氨基酸含量突出，同時其必需氨基酸組成和人體需求相近[2]。鄭義等[3]研究表明，海鮮菇多糖具有清除人體自由基的作用。此外，海鮮菇多糖還具有調節(jié)機體免疫力、延緩衰老、預防以及抵抗癌癥的生理活性的功效[4-5]。工業(yè)化生產海鮮菇留下的廢菌棒中仍含有大量的海鮮菇菌絲，現有草菇種植只能利用其中的一部分，大部分只能做焚燒處理，這是一種資源浪費[6-7]。通過從海鮮菇廢菌棒的菌絲中可以提取海鮮菇多糖，這在香菇廢菌棒中已有應用，從而使資源得到更有效的利用[8-9]。微波輔助提取作為高效節(jié)能的新興多糖提取方法應用廣泛[10-11]。目前，尚未有海鮮菇廢菌棒多糖提取的研究，故利用單因素及響應面優(yōu)化海鮮菇廢菌棒多糖的微波輔助提取工藝，可為其進一步利用和研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗原料和試劑

海鮮菇廢菌棒：昆山正興食用菌有限公司；葡萄糖、濃硫酸、乙醚、無水乙醇、重蒸苯酚（均為國產分析純）：常熟強盛化工有限公司。

1.2 儀器與設備

普渡RF-02蒸發(fā)器：上海普渡生化科技有限公司；TD5M臺式大容量離心機：上海盧湘儀離心機儀器有限公司；WL 2S-1型微波萃取儀：南京三樂高新技術工程公司微波所；M124A型電子天平：BEL；BL25C33攪拌機：上海知楚儀器有限公司；恒溫水浴鍋：南京丙林電子；LGJ-10冷凍干燥儀：賽飛（中國）有限責任公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 海鮮菇廢菌棒的預處理

用蒸餾水將海鮮菇廢菌棒洗凈，在70℃恒溫干燥箱內烘干。攪拌機粉碎過60目篩，再用95%乙醇回流兩次除去部分脂溶性雜質，得到預處理海鮮菇廢菌棒粉[12-13]。

1.3.2 標準曲線的測定[14]

將干燥后的葡萄糖標準品配置成濃度為0.04mg/mL的標準溶液，分別移取 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL于試管中，補齊至2 mL。在各管滴加1mL 5%重蒸苯酚溶液，再迅速滴入5 mL濃硫酸搖勻并靜置，等待6min后70℃保持15min，冷卻至室溫。用490nm波長檢測不同標樣的吸光度。以葡萄糖標液濃度（μg/mL）為自變量，吸光度做因變量，得標準曲線：y=0.013 8x+0.013 6，R2=0.999 3。

1.3.3 海鮮菇廢菌棒多糖的微波輔助提取

準確稱量海鮮菇廢菌棒粉末樣品，用蒸餾水提取。在不同提取時間、微波功率和液料比條件下各提取2次。冷卻到室溫后，經3 000 r/min離心10 min后將上層清液合并，進行減壓濃縮。用無水乙醇調整溶液至含醇量85%，放置1 d。最后經5 000 r/min離心15 min，取沉淀。得到的沉淀用無水乙醇洗滌兩次，冷凍干燥后得到海鮮菇廢菌棒多糖。

1.3.4 海鮮菇廢菌棒多糖得率計算

選用苯酚-硫酸法來測定海鮮菇廢菌棒多糖含量[15-16]。

1.3.5 單因素試驗

試驗以蒸餾水作溶劑，探究不同提取時間、液料比以及微波功率對海鮮菇廢菌棒多糖得率的影響。再以1.3.3中多糖得率計算方法測出不同條件下海鮮菇廢菌棒多糖得率。

1.3.5.1 提取時間對海鮮菇廢菌棒多糖得率的影響

試驗固定液料比 30∶1（mL/g），微波功率 400 W，按時間將試驗分為 6 組：4、6、8、10、12、14 min，做 3 次平行。

1.3.5.2 微波功率對海鮮菇廢菌棒多糖得率的影響

設定提取時間 10 min，液料比 30∶1（mL/g），考察海鮮菇廢菌棒多糖在微波功率分別為200、300、400、500、600 W時得率的變化。

1.3.5.3 液料比對海鮮菇廢菌棒多糖的影響

試驗提取10 min，微波功率400 W，按液料比不同，試驗劃分為 5 組：15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1（mL/g）。

1.3.6 響應面試驗設計

響應面法在理化試驗、生物工程及食品科學等諸多領域有著深入的應用[17-18]。Box-Behnken Design（BBD）是廣泛應用的一種分析最佳工藝參數的設計方法[19-20]。該試驗中，設計如表1所示三水平三因素試驗方案，探究海鮮菇廢菌棒多糖微波輔助提取的優(yōu)化提取參數。

表1 試驗編碼和試驗參數對照關系Table 1 Therelationship between encode and actual concentration of factor

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果及分析

2.1.1 提取時間對海鮮菇廢菌棒多糖提取率的影響

提取時間對海鮮菇廢菌棒多糖提取率的影響見圖1。

圖1 提取時間對海鮮菇廢菌棒多糖的得率的影響Fig.1 Effects ofextractiontime on the extraction rateof the waste substrate polysaccharide

從圖1可見，隨著提取時間的增長多糖得率呈現上升趨勢，在4 min～10 min段增長較快，而10 min～14 min段多糖提取率又趨于平緩。這說明試樣中的多糖大部分已被提取，故雖提取時間繼續(xù)延長但多糖得率變化不大。因此，選擇較優(yōu)提取時間為10 min，其多糖提取率為1.81%。

2.1.2 微波功率對海鮮菇廢菌棒多糖提取率造成的影響

微波功率對海鮮菇廢菌棒多糖提取率造成的影響見圖2。

圖2 微波功率對海鮮菇廢菌棒多糖提取率的影響Fig.2 Influence of microwave power on the extraction rate of the waste substrate polysaccharide

從圖2可以看出，在微波功率從200W提至400W時，海鮮菇廢菌棒多糖提取得率變化幅度很大，而在400 W后多糖得率逐漸走低。這是由于隨微波功率提升，細胞壁加速破壞，但隨微波功率繼續(xù)增大，溶液升溫過快反而破壞多糖結構。綜上所述，在此條件下較佳微波功率400 W，其多糖得率為1.82%

2.1.3 液料比對海鮮菇廢菌棒多糖提取率的影響

液料比對海鮮菇廢菌棒多糖提取率的影響見圖3。

圖3 液料比對海鮮菇廢菌棒多糖提取率的影響Fig.3 Influence of material-to-liquid ratio on the extraction rate of the waste substrate polysaccharide

由圖 3 可見，液料比從 15∶1（mL/g）提升至 25∶1（mL/g）過程中，海鮮菇廢菌棒多糖得率變化顯著。這可能是由于液料比過低使海鮮菇廢菌棒粉沒有充分分散于介質中而降低提取率。在液料比達到25∶1（mL/g）后，多糖得率趨于穩(wěn)定。因此選擇30∶1（mL/g）作為海鮮菇廢菌棒多糖提取的最佳液料比，其多糖得率為1.80%。

2.2 響應面試驗結果及分析

2.2.1 組合試驗結果

試驗應用Design-Expert8.06Trial軟件進行試驗數據處理，進組合試驗得到表2的結果。

表2 Box-Behnken試驗設計以及海鮮菇廢菌棒多糖提取結果Table 2 Design and responses values of Box-Behnken design

在這17組數據中，有12個析因點和5個用于估算誤差的零點。

2.2.2 方差分析結果

運用design-expert軟件對表2中的數據做出處理，構建提取率的數學模型，計算出海鮮菇廢菌棒多糖得率回歸方程式：

海鮮菇廢菌棒多糖得率的方差分析見表3。

表3 海鮮菇廢菌棒多糖得率的方差分析Table 3 The variance analysis result of Hypsizygusmarmoreus waste substratepolysaccharide yield

由表3分析可得，該模型的P值＜0.01，說明本試驗模型具有統(tǒng)計學意義；失擬項P值為0.093 1，表明數學模型和實際試驗值擬合度很好，從而回歸方程可近預測真實試驗值。此外，模型中一次項X1、X2、X3，二次項 X12、X22、X32，交互項 X1X2的 P 值都＜0.01，說明本試驗的各個因子以及因子間的交叉作用都對多糖得率有顯著影響。同時注意到在單因素中，對海鮮菇廢菌棒多糖提取率變化貢獻大小為微波功率＞液料比＞提取時間。

圖4 提取時間和微波功率對海鮮菇廢菌棒多糖得率的交互作用響應面圖和等高線圖Fig.4 Effects of extraction time and microwave power on the response rate of polysaccharide in seafood mushroom sticks of a response surface plot and contour lines

圖5 提取時間和液料比對海鮮菇廢菌棒多糖提取率交互作用的響應面圖和等高線Fig.5 Liquid ratio and extraction treatment time on the interaction polysaccharide yield of a response surface plot and contour lines

2.2.3 海鮮菇廢菌棒多糖得率的響應面優(yōu)化

通過回歸模型，可以得到因素及其交叉作用對海鮮菇廢菌棒多糖提取率的相應等高線圖和響應面圖見圖 4～圖 6。

從圖 4 可以看出，在固定液料比 30∶1（mL/g）的情況下，海鮮菇廢菌棒多糖得率隨微波功率變化顯著。在縱坐標方向，隨著提取時間的變化多糖得率變化不太明顯。同時看到等高線為橢圓形，說明這兩個因子之間交互影響作用非常顯著。

從圖5可以看出，在固定微波功率400 W的情況下，液料比因素與提取時間因素交互作用顯著。在液料比 25∶1（mL/g）～35∶1（mL/g）范圍內，多糖得率變化比較明顯；在提取時間8 min～10 min之間，提取率不斷提升。同時注意到隨著液料比的增加及提取時間的延長，得率又一個先增大后減小的過程。

從圖6觀察得出，在固定提取時間10 min時，液料比在 25∶1（mL/g）～35∶1（mL/g）范圍內，多糖得率隨液料比變化不明顯，而隨微波功率從300W提升至400W時，得率變化顯著；隨功率繼續(xù)提升，得率呈下降態(tài)勢。

通過design-expert軟件分析，可得海鮮菇廢菌棒多糖提取工藝的最優(yōu)解：既提取時間為10.24 min，微波功率 424.03 W，液料比 30.86∶1（mL/g），得率 1.99%。參考實際條件，確定實際操作的最優(yōu)方案：提取時間10 min，微波功率 420 W，液料比 31∶1（mL/g）。經過3次平行試驗，測得實際多糖提取率2.01%，這與理論值的相差在1%以下。由此可見，應用響應面法改進微波輔助提取海鮮菇廢菌棒多糖是可行的，具有應用于實際生產的價值。

圖6 微波功率和液料比對海鮮菇廢菌棒多糖提取率的交叉效應的響應面圖和等高線Fig.6 Response surface plot and contour lines of the interaction of liquid-material ratio and temperature on the polysaccharide yield response surface plot and contour lines

3 結論

本文通過響應面法優(yōu)化微波輔助提取多糖工藝，為食用菌企業(yè)處理廢菌棒提供一個可行的方案。響應面優(yōu)化提取海鮮菇廢菌棒多糖，有效的減少了試驗步驟，同時得到相對精確的結論。試驗采用Design expret8.0.5Trial軟件設計試驗，通過響應面分析得到提取率與提取時間、微波功率及液料比因素的模型方程，得到最優(yōu)方案：提取時間10 min，微波功率420 W，液料比 31∶1（mL/g），此條件下多糖得率 2.01%，行之有效的提高了海鮮菇廢菌棒多糖的得率。與此同時，下一步試驗將研究海鮮菇廢菌棒多糖的抗氧化活性，使廢菌棒的資源再利用呈現多元化以及更具有綜合性和全面性。

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Study on the Microwave-assisted Extraction of Polysaccharides from Hypsizygus marmoreus Waste Substrate by Response Surface Methodology

XU Bing，YIN Rui，WANG Zhe，JI Hong*
（College of Biology and Food Engineering，Changshu Institute of Technology，Changshu 215500，Jiangsu，China）

The polysaccharides were extracted from the Hypsizygus marmoreus waste substrate by microwaveassisted extraction，and the extraction process was optimized by controlling the extraction time，microwave power and liquid-to-solid ratio.On the basis of single factor test and obtained by the response surface method，we got obtained by the response surface method：the extraction time was 10 min，the microwave power was 420 W，and ratio of liquid to material was 31∶1（mL/g）.Under these conditions，the extraction efficiency of polysaccharide from waste substrate was the best，and the extraction rate was 2.01%.

Hypsizygusmarmoreuswastesubstrate；microwave-assistedextraction；responsesurfacemethodology

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.17.020

2017-06-10

昆山市科技計劃項目（KN1506）

徐兵（1982—），男（漢），實驗師，碩士，研究方向：食用菌學。

*通信作者：冀宏（1969—），男（漢），教授，博士，研究方向：食、藥用菌工程技術研究及現代農業(yè)技術經濟與管理。