周瑞琴 李小巧 楊艷琴

(河南省漯河市第三人民醫(yī)院內(nèi)一科,漯河,462000)

雷公藤多苷對早期糖尿病腎病患者的血管內(nèi)皮功能及T淋巴細(xì)胞亞群的影響

周瑞琴 李小巧 楊艷琴

(河南省漯河市第三人民醫(yī)院內(nèi)一科,漯河,462000)

目的:探討雷公藤多苷對早期糖尿病腎病患者的血管內(nèi)皮功能的影響,同時(shí)觀察該藥對患者T淋巴細(xì)胞亞群的干預(yù)效應(yīng)。方法:選取2010年1月至2016年1月漯河市第三人民醫(yī)院內(nèi)一科住院的早期糖尿病腎病患者80例,隨機(jī)分為對照組和觀察組,每組40例。2組患者均接受常規(guī)控制血糖、改善腎功能方案,觀察組在常規(guī)治療方案基礎(chǔ)上加用雷公藤多苷,2組均接受為期12周的治療,比較2組治療前后血糖、血脂、腎功能指標(biāo)的變化,同時(shí)檢測2組患者干預(yù)前后血管內(nèi)皮細(xì)胞(VEGF)、T淋巴細(xì)胞亞群百分比的變化。結(jié)果:1)治療結(jié)束后2組患者血糖、血脂、腎功能指標(biāo)均有明顯改善,與對照組比較,觀察組改善的幅度更明顯,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。2)治療后2組VEGF濃度均較治療前明顯下降,其中觀察組下降的趨勢更為明顯(P<0.05)。3)治療后觀察組Th17/Treg細(xì)胞百分比低于對照組,Th1/Th2細(xì)胞百分比較對照組明顯升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論:雷公藤多苷可明顯改善早期糖尿病腎病患者的血管內(nèi)皮功能,同時(shí)可糾正患者T淋巴細(xì)胞亞群失衡現(xiàn)象。

糖尿病腎病;血管內(nèi)皮;T淋巴細(xì)胞亞群;雷公藤多苷

糖尿病腎病(Diabetic Nephropathy,DN)是目前臨床常見的糖尿病并發(fā)癥,據(jù)調(diào)查,目前約有30%的糖尿病患者因主要是長期高血糖導(dǎo)致微血管病變,從而出現(xiàn)蛋白尿及腎功能受損,隨著疾病的發(fā)生發(fā)展最終導(dǎo)致終末期腎病及死亡[1-2]。免疫功能紊亂目前已被證實(shí)貫穿于DN發(fā)展過程中,氧化應(yīng)激系統(tǒng)的失調(diào)是DN的直觀體現(xiàn),導(dǎo)致腎臟固有細(xì)胞受損,然而DN處于氧化應(yīng)激狀態(tài)的主要原因是機(jī)體免疫系統(tǒng)功能的紊亂,受破壞的免疫系統(tǒng)導(dǎo)致體內(nèi)的天然抗氧化劑分泌減少從而無法抵御疾病導(dǎo)致氧化反應(yīng),因此我們認(rèn)為修復(fù)機(jī)體的免疫系統(tǒng)是治療DN的根本。上世紀(jì)中藥雷公藤有明顯的免疫干預(yù)效應(yīng)被諸多學(xué)者認(rèn)可,臨床上隨之用于多類腎臟疾病的治療,可明顯降低患者的蛋白尿及修復(fù)腎小球足細(xì)胞,本團(tuán)隊(duì)利用雷公藤多苷對DN患者進(jìn)行干預(yù),亦取得較理想療效,并對其治療機(jī)制進(jìn)一步研究,發(fā)現(xiàn)該藥可一定程度修復(fù)DN患者的內(nèi)皮細(xì)胞及糾正其紊亂的免疫系統(tǒng),現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2010年1月至2016年1月漯河市第三人民醫(yī)院內(nèi)一科住院的早期糖尿病腎病患者80例，隨機(jī)分為對照組和觀察組。每組40例,對照組中男26例,女14例,年齡41～75歲,平均年齡(58.1±4.9)歲,發(fā)現(xiàn)糖尿病病程5～18年,平均病程(9.8±3.2)年。觀察組中男27例,女13例,年齡40～74歲,平均年齡(57.9±4.7)歲,發(fā)現(xiàn)糖尿病病程6～17.5年,平均病程(9.6±3.1)年。2組患者在年齡、性別、發(fā)現(xiàn)糖尿病病程等方面資料比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。所有患者均簽署知情同意書。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn) 所有患者診斷符合我國于2000年制定《中國2型糖尿病防治指南》中關(guān)于糖尿病的診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn) 1)符合1.2診斷標(biāo)準(zhǔn)者;2)糖尿病發(fā)病時(shí)間≥5年者;3)近3個(gè)月內(nèi)連續(xù)2次尿蛋白排泄率20～200 μg/min,且24 h尿蛋白定量<0.5 g。

1.4 排除標(biāo)準(zhǔn) 1)非糖尿病導(dǎo)致的腎功能受損者;2)糖尿病合并嚴(yán)重急性并發(fā)癥則;3)哺乳期或妊娠期婦女;4)既往服用過雷公藤多苷者;5)不予簽署知情同意書者。

1.5 脫落與剔除標(biāo)準(zhǔn) 1)正在參加其他臨床試驗(yàn)的患者;2)取得隨機(jī)號,但未接受全部療程治療的患者;3)不符合納入標(biāo)準(zhǔn)被誤入的患者;4)研究過程中出現(xiàn)嚴(yán)重并發(fā)癥或出現(xiàn)病情惡化,需采取緊急措施者。

1.6 治療方法 根據(jù)患者病情的不同,2組患者都予內(nèi)一科常規(guī)護(hù)理及對癥治療,包括控制飲食,控制血壓,降脂,改善循環(huán),維持電解質(zhì)平衡等,利用口服降糖藥或者皮下注射胰島素進(jìn)行血糖控制。有合并高血壓者予口服降壓藥。觀察組患者在上述基礎(chǔ)治療上加用雷公藤多苷片(遠(yuǎn)大醫(yī)藥黃石飛云制藥有限公司,國藥準(zhǔn)字Z42021212)進(jìn)行治療,20 mg/片,口服,每日每千克體重1～1.5 mg,分3次服用。

1.7 觀察指標(biāo)

1.7.1 血糖、腎功能、血脂等指標(biāo) 治療前后用日立HITACHI7600型全自動(dòng)生化儀測定空腹血糖(FBG)、餐后2 h血糖(2 hPG)、糖化血紅蛋白(HbA1c)、三酰甘油(TG)、血脂總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白-C(LDL-C)、24 h尿蛋白定量(UTP)、尿白蛋白排泄率(UAER)、尿β2微球蛋白(β2-MG)、血肌酐(SCr)水平。

1.7.2 VEGF水平變化 取治療前后患者前臂外周血5 mL置于肝素鈉包被的抗凝管中,用人淋巴細(xì)胞分離液分離出外周血單核細(xì)胞200 μL,加入100 μL裂解液進(jìn)行細(xì)胞分裂,放入4 ℃振蕩器中持續(xù)震蕩30 min,并將液體用移液槍轉(zhuǎn)移至事先預(yù)冷離心管,再次置于4 ℃離心機(jī)中以5 000 r/min轉(zhuǎn)速進(jìn)行離心15 min,用移液槍將上清液抽取至新的離心管中備用。利用BCA試劑盒測定蛋白濃度,并在100 ℃水浴中進(jìn)行蛋白變性7 min,并計(jì)算上樣量。事先配制好SDS-PAGE膠體,用移液槍將蛋白加之膠體中進(jìn)行電泳,隨后將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上,隨后用脫脂奶粉進(jìn)行封閉2 h,用PBS清洗2次,10 min/次,加1∶500稀釋的一抗(VEGF)及內(nèi)參抗體(β-acting,1∶3 000)室溫孵育2 h,用PBS清洗2次，10 min/次,隨后加入辣根過氧化酶HRP-二抗,室溫下輕搖2 h取出繼續(xù)PBS清洗2次，10 min/次,最后利用ECL顯影,拍照,統(tǒng)計(jì)分析。

1.7.3 T淋巴細(xì)胞亞群檢測 取治療前后患者前臂外周血5 mL置于肝素鈉包被的抗凝管中,用人淋巴細(xì)胞分離液分離出外周血單核細(xì)胞200 μL,保持細(xì)胞濃度在1×106個(gè)/mL,將提取的單核細(xì)胞置于10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng),24 h后予培養(yǎng)瓶加入事先配制的工作液進(jìn)行細(xì)胞刺激,并置于37 ℃,5% CO2環(huán)境中進(jìn)行培養(yǎng)4～6 h,培養(yǎng)結(jié)束后予培養(yǎng)瓶中置入PBS沖洗,后進(jìn)行細(xì)胞收集,再加入相應(yīng)的熒光素進(jìn)行細(xì)胞標(biāo)記,隨后將細(xì)胞置于流式細(xì)胞儀中檢測Th1、Th、Th17細(xì)胞、Treg細(xì)胞比例,并計(jì)算Th1/Th2、Th17/Treg比值。

表1 2組糖尿病腎病患者血糖、血脂代謝比較

注:組內(nèi)治療前后比較,*P<0.05;組間比較，△P<0.05

表2 2組糖尿病腎病患者腎功能各指標(biāo)變化比較

注:組內(nèi)治療前后比較,*P<0.05;組間比較,△P<0.05

2 結(jié)果

2.1 血糖、腎功能、血脂等指標(biāo)變化 治療結(jié)束后2組患者血糖、血脂、腎功能指標(biāo)均有明顯改善,與對照組比較,觀察組改善的幅度更明顯,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1、表2。

2.2 2組治療前后VEGF水平變化 治療后2組VEGF濃度均較治療前明顯下降,其中觀察組下降的趨勢更為明顯(P<0.05)。見圖1。

圖1 治療前后VEGF水平變化圖

2.3 2組治療前后T淋巴細(xì)胞亞群水平的檢測 治療后觀察組Th17/Treg細(xì)胞百分比低于對照組,Th1/Th2細(xì)胞百分比較對照組明顯升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2,圖2。

表3 2組治療前后外周血中Th17/Treg細(xì)胞比例

注:與治療前比較,*P<0.05;與對照組治療后比較，△P<0.05

3 討論

糖尿病腎病屬于中醫(yī)學(xué)“消渴”“水腫”“關(guān)格”等范疇,發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜,古代醫(yī)賢認(rèn)為先天稟賦不足,加之后天飲食不節(jié),嗜食肥甘厚膩而導(dǎo)致脾失健運(yùn),水濕代謝異常,從而濕邪內(nèi)聚,聚濕化熱,邪熱如絡(luò)傷及腎元,而發(fā)為此病。正如《圣濟(jì)總錄》一書中所描述:“消渴日久,腎氣受傷,腎主水,腎氣虛衰,氣化失常,開闔不利,水液聚于體內(nèi)而發(fā)為水腫”,由此可見,脾腎虧虛致濕熱夾雜是DN的主要病機(jī)[4-7]。

圖2 治療前后T淋巴細(xì)胞亞群水平分布圖

雷公藤是衛(wèi)矛科雷公藤屬植物雷公藤的根部,味苦、辛,大毒。歸肝、腎經(jīng)。具有祛風(fēng)除濕、通絡(luò)止痛、消腫止痛、解毒殺蟲之功效。雷公藤多苷[8-10]是雷公藤經(jīng)過現(xiàn)代工藝加工后的提取物,含有雷公藤生物堿及二萜內(nèi)酯等有效成分,其不良反應(yīng)較中藥小,且能最大程度保存療效。我們對2組DN患者進(jìn)行常規(guī)內(nèi)科處理,結(jié)果2組患者的24 h尿蛋白定量、BUN、SCr均較治療前均得有明顯降低(P<0.05),但觀察組與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);在治療后2組患者ALB均明顯升高,與治療前比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),說明雷公藤多苷在對DN具有理想的治療效果,可明顯改善患者腎功能。在研究中我們對2組患者外周血清VEGF的濃度進(jìn)行檢測,結(jié)果顯示DN發(fā)病時(shí)外周血VEGF濃度明顯升高,治療后濃度逐漸下降,其中增加雷公藤多苷干預(yù)的觀察組下降的趨勢更為明顯。VEGF是血管內(nèi)皮細(xì)胞的絲裂原,當(dāng)機(jī)體缺血、缺氧或者高糖狀態(tài)時(shí)其濃度均可受到影響,在正常狀態(tài)下VEGF處于低濃度水平,僅可維持血管密度的生理穩(wěn)定性,DN患者的高血糖狀態(tài)激活了VEGF及其下游基因的表達(dá),從而上調(diào)了VEGF的濃度,改變了DN患者血管內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)及功能,增加了腎小球的通透性,從而加劇蛋白尿等癥狀的發(fā)生,促進(jìn)病情進(jìn)一步惡化。研究結(jié)果顯示雷公藤多苷下調(diào)了DN患者的VEGF,基于此,我們認(rèn)為雷公藤多苷對DN血管內(nèi)皮有一定保護(hù)作用。

在本研究中我們還對2組患者的T淋巴細(xì)胞亞群百分比進(jìn)行檢測,結(jié)果顯示治療后觀察組Th17/Treg細(xì)胞百分比低于對照組,Th1/Th2細(xì)胞百分比較對照組明顯升高,這說明雷公藤可糾正DN患者紊亂的免疫系統(tǒng)。正常機(jī)體狀態(tài)下T淋巴細(xì)胞各類細(xì)胞因子組成一個(gè)調(diào)解網(wǎng)絡(luò),并處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)。在查閱大量文獻(xiàn)中我們可知處于DN患者機(jī)體靶細(xì)胞聚集大量Th2細(xì)胞,并因此導(dǎo)致其相關(guān)細(xì)胞因子大量分泌[11-13]。我們在研究亦證實(shí)這一現(xiàn)象的確存在于DN患者中,該疾病患者Th1/Th2比例明顯低于健康人群,Th17/Treg細(xì)胞百分比明顯增高,雷公藤多苷可校正上述糾正這一失衡,從而改善腎小球基膜的濾過率從而阻止蛋白的濾出,其療效與糖皮質(zhì)激素類似,并具有一定的特異性。因此我們確信雷公藤多苷能顯著減少腎病患者的蛋白尿,能有效拮抗免疫介導(dǎo)所導(dǎo)致的腎小球足細(xì)胞損傷,從而減輕足細(xì)胞損傷的原因與其可校正患者T淋巴細(xì)胞分布失衡有關(guān)。

綜上所述,雷公藤多苷可明顯改善早期糖尿病腎病患者腎功能,并具有一定的血管內(nèi)皮修復(fù)效應(yīng),同時(shí)可糾正患者T淋巴細(xì)胞亞群失衡現(xiàn)象,臨床建議推廣運(yùn)用。

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(2017-06-05收稿 責(zé)任編輯：王明)

Effect of Tripterygium Glycosides on Vascular Endothelial Function and T Lymphocyte Subsets in Patients with Early Diabetic Nephropathy

Zhou Ruiqin, Li Xiaoqiao, Yang Yanqin

(TheThirdPeople′sHospitalofLuohe,Luohe462000,China)

Objective:To investigate the intervention effect of Tripterygium glycosides on vascular endothelial function and T lymphocyte subsets in patients with early diabetic nephropathy.Methods:Eighty cases of early diabetic nephropathy patients hospitalized in Endocrinology Department in the hospital during January 2010 to January 2016 were included and were randomly divided into the control group and the observation group, with 40 cases in each group. Patients in both the two groups accepted routine treatment scheme of diabetes control and renal function improvement, while patients in the observation group combined with Tripterygium glycosides on the basis of conventional treatment. Both the two groups were treated for 12 weeks. The changes of blood glucose, blood lipid and renal function index of the two groups before and after the treatment were compared, and changes in the percentage of vascular endothelial cells (VEGF) and T lymphocyte subsets in the two groups before and after the intervention were detected at the same time.Results:1) Blood glucose, blood lipid, renal function indexes markedly of patients in the two groups improved after the treatment. The improvement range of the observation group was more obviously, compared with the control group, with statistically significant differences (P<0.05). 2) The VEGF concentration decreased significantly in both of the two groups after the treatment; the downward trend in the observation group was more obvious (P<0.05). 3) The percentage of Th 17/Treg cells in the observe group was lower than that of the control group after the treatment, and percentage of the Th1/Th2 cells in the observe group increased significantly compared to that of the control group, which showed statistically significant differences (P<0.05).Conclusion:Tripterygium glycosides can significantly improve vascular endothelial function in patients with early diabetic nephropathy and relieve the disorder of T lymphocyte subgroup.

Diabetic nephropathy; Vascular endothelium; T lymphocyte subpopulation; Tripterygium glycosides

2014年河南省衛(wèi)生廳衛(wèi)生政策研究課題計(jì)劃項(xiàng)目(YWZY201407) 作者簡介：周瑞琴(1973.01—)，女，本科，副主任醫(yī)師，研究方向:原發(fā)性和繼發(fā)性腎小球疾病、糖尿病腎病，E-mail：zhourq@163.com

R285.6

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10.3969/j.issn.1673-7202.2017.08.029