周 林, 邱瑞嬌， 林上龍， 許少萍， 張 英*

(1. 廣東藥科大學(xué) 生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院， 廣東 廣州 510006； 2. 廣州中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院， 廣東 廣州 510006)

·研究報(bào)告——生物質(zhì)能源·

木糖利用融合子D2的制備與乙醇發(fā)酵特性

周 林1, 邱瑞嬌1， 林上龍1， 許少萍2， 張 英2*

(1. 廣東藥科大學(xué) 生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院， 廣東 廣州 510006； 2. 廣州中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院， 廣東 廣州 510006)

以樹干畢赤酵母(Pichiastipitis)1960(Ps1960)與釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)AADY(ScAADY)為親本菌株，采用雙親滅活原生質(zhì)體技術(shù)制備木糖利用融合子，并對(duì)其制備條件進(jìn)行了優(yōu)化。優(yōu)化后的原生質(zhì)體制備條件為Ps1960采用2 %蝸牛酶和1 %纖維素酶在28 ℃酶解45 min，20W紫外燈距離10 cm照射3 min滅活； ScAADY采用1.5 %蝸牛酶和1 %纖維素酶28 ℃酶解50 min，55 ℃水浴50 min滅活；均采用0.6 mol/L山梨醇為滲透壓穩(wěn)定劑。在該條件下，共得到22株融合子。通過測(cè)定各融合子在不同培養(yǎng)基條件下的生物量來評(píng)價(jià)其木糖代謝和乙醇耐受能力，最終獲得能利用木糖高效發(fā)酵產(chǎn)乙醇、遺傳性狀穩(wěn)定的融合子D2，并進(jìn)行乙醇發(fā)酵條件優(yōu)化。結(jié)果表明，在混合糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)8 %、木糖和葡萄糖質(zhì)量比6∶1、5 %接種量、30 ℃、160 r/min 、培養(yǎng)72 h條件下，融合子D2發(fā)酵產(chǎn)乙醇的產(chǎn)量為40.58 g/L。

釀酒酵母；樹干畢赤酵母；原生質(zhì)體融合；滅活；生物乙醇

生物質(zhì)的高效利用在世界各國(guó)的能源發(fā)展戰(zhàn)略中具有重要的地位，木質(zhì)纖維原料因其儲(chǔ)量大而成為生物質(zhì)能研究的重點(diǎn)[1]。近年來，國(guó)內(nèi)外對(duì)木質(zhì)纖維原料轉(zhuǎn)化乙醇進(jìn)行了大量的研究，但工業(yè)生產(chǎn)還存在一定的技術(shù)和經(jīng)濟(jì)瓶頸[2]。木質(zhì)纖維原料經(jīng)過各種物理、化學(xué)工藝降解后產(chǎn)生的微生物可利用碳源主要是木糖和葡萄糖，因而獲得能夠同時(shí)利用木糖和葡萄糖，遺傳性狀穩(wěn)定且乙醇得率高的微生物菌株是解決問題的關(guān)鍵之一[3-4]。樹干畢赤酵母能夠轉(zhuǎn)化木糖為乙醇，但乙醇耐受能力較低；釀酒酵母可快速發(fā)酵葡萄糖，乙醇耐受能力較強(qiáng)，但不能發(fā)酵木糖。原生質(zhì)體融合技術(shù)通過融合2個(gè)或多個(gè)遺傳性狀不同的細(xì)胞的原生質(zhì)體，能夠獲得兼有雙親遺傳性狀的重組子。原生質(zhì)體融合一般包括親本菌株的選擇、原生質(zhì)體的制備、原生質(zhì)體的融合和融合子的檢出等步驟。作為一種有效的育種手段，原生質(zhì)體融合技術(shù)在抗生素工業(yè)發(fā)酵菌株選育中發(fā)揮了重要作用，在生物乙醇產(chǎn)生菌的選育方面也受到廣泛的重視。張明婷等[5]報(bào)道了利用樹干畢赤酵母7124與釀酒酵母2034進(jìn)行融合構(gòu)建木糖發(fā)酵菌株，乙醇產(chǎn)量可以達(dá)到22.52 g/L。雙親滅活原生質(zhì)體技術(shù)的原理是在原生質(zhì)體融合之前，對(duì)雙親原生質(zhì)體進(jìn)行滅活，使其喪失再生的能力，基因重組后的原生質(zhì)體代謝上得到互補(bǔ)而存活。本研究采用雙親滅活原生質(zhì)體技術(shù)制備樹干畢赤酵母(Pichiastipitis)1960與釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)AADY的融合子，優(yōu)化融合子制備、篩選、發(fā)酵條件，獲得高效發(fā)酵木糖和葡萄糖產(chǎn)乙醇的融合子，進(jìn)一步通過生物量(OD600)的測(cè)定快速評(píng)價(jià)融合子的木糖發(fā)酵能力和乙醇耐受能力。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 菌株

樹干畢赤酵母菌(Pichiastipitis)1960(Ps1960)，購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；安琪釀酒高活性干酵母(Saccharomycescerevisiae)AADY(ScAADY)購(gòu)自安琪酵母股份有限公司。

1.2 試劑

蝸牛酶、纖維素酶，均購(gòu)自廣州華奇盛生物科技有限公司。葡萄糖(天津市百世化工有限公司)，蔗糖(天津市大茂化學(xué)試劑廠)，酵母膏(北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司)，瓊脂粉(廣州瑞舒生物科技有限公司)，蛋白胨(廣州市達(dá)暉生物技術(shù)有限公司)，山梨醇(北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司),甘露醇(天津市大茂化學(xué)試劑廠)，聚乙二醇-PEG 6000(廣東光華化學(xué)廠有限公司)，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。pH值5.8磷酸緩沖液(PBS)：磷酸二氫鉀 8.34 g、三水合磷酸氫二鉀 0.87 g，用蒸餾水定容至1 L。促融劑：2.5 g PEG、0.037 g甘氨酸、0.055 g氯化鈣，用蒸餾水定容至10 mL。

1.3 培養(yǎng)基

酵母蛋白胨葡萄糖(YPD)培養(yǎng)基：20 g/L蛋白胨、20 g/L葡萄糖、10 g/L酵母膏，115 ℃滅菌15 min。

再生培養(yǎng)基：向YPD培養(yǎng)基中分別添加0.6 mol/L的蔗糖、KCl、甘露醇和山梨醇，115 ℃滅菌15 min，得到4種再生培養(yǎng)基。

固體培養(yǎng)基：液體培養(yǎng)基滅菌前加入30 g/L瓊脂粉可制備相應(yīng)的固體培養(yǎng)基。

木糖發(fā)酵培養(yǎng)基：木糖60 g/L、蛋白胨5 g/L、酵母膏5 g/L、KH2PO45 g/L、(NH4)2SO40.2 g/L、MgSO4·7H2O 0.4 g/L，115 ℃滅菌15 min。在木糖發(fā)酵培養(yǎng)基中加入經(jīng)過濾除菌的無水乙醇(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10 %和20 %)作為乙醇耐受性測(cè)試培養(yǎng)基。

混合糖發(fā)酵培養(yǎng)基：在木糖發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，采用不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的混合糖6 %、8 %、10 %(m(木糖)∶m(葡萄糖)=6∶1)，以及不同比例的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8 %的混合糖(m(木糖)∶m(葡萄糖)為3∶1、 6∶1和10∶1)。以質(zhì)量分?jǐn)?shù)8 %混合糖(m(木糖)∶m(葡萄糖)=6∶1)為例：木糖68.58 g/L、葡萄糖11.43 g/L、蛋白胨5 g/L、酵母膏5 g/L、KH2PO45 g/L、(NH4)2SO40.2 g/L、 MgSO4·7H2O 0.4 g/L，用蒸餾水定容至1 L。

1.4 儀器

氣浴恒溫振蕩器,高速冷凍離心機(jī),立式壓力蒸汽滅菌器,電熱恒溫培養(yǎng)箱,紫外可見分光光度計(jì),美國(guó)Agilent 7820A氣相色譜，采用 DB-WAX(60 m×0.25 mm×0.5 μm )毛細(xì)管柱。

1.5 原生質(zhì)體制備、滅活、融合及篩選

1.5.1 原生質(zhì)體制備

1.5.1.1 酶組成和酶濃度對(duì)原生質(zhì)體形成的影響 將4 ℃保存的各酵母菌試管斜面接種至YPD液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜(12～16 h)活化的Ps1960和ScAADY分別于160 r/min， 30 ℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)8 h，6 000 r/min離心5 min，收集細(xì)胞；用PBS離心洗滌2次后用5 mL PBS重懸得到菌懸液。取1 mL菌體重懸液分別加入10 μL經(jīng)過濾除菌的1 %蝸牛酶，1 %蝸牛酶+1 %纖維素酶，1.5 %蝸牛酶，1.5 %蝸牛酶+1 %纖維素酶，2 %蝸牛酶，2 %蝸牛酶+1 %纖維素酶。Ps1960酶解增加3 %蝸牛酶，3 %蝸牛酶+1 %纖維素酶組合(均為質(zhì)量分?jǐn)?shù))。28 ℃水浴條件下酶解，每隔15 min取酶解液于血球計(jì)數(shù)板和普通光學(xué)顯微鏡進(jìn)行原生質(zhì)體計(jì)數(shù)，觀察至45 min。

1.5.1.2 酶解時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體形成的影響 在1 mL Ps1960菌懸液(按1.5.1.1節(jié)方法制備，下同)中加入10 μL已過濾除菌的2 %蝸牛酶+1 %纖維素酶，28 ℃條件下酶解75 min，每隔15 min取樣，觀察計(jì)數(shù)；在1 mL ScAADY菌懸液中加入1.5 %蝸牛酶+1 %纖維素酶，28 ℃條件下酶解70 min，每隔10 min取樣，進(jìn)行原生質(zhì)體計(jì)數(shù)。

1.5.1.3 滲透壓穩(wěn)定劑對(duì)原生質(zhì)體形成的影響 在0.1 mL Ps1960和ScAADY菌懸液中加入0.9 mL濃度為0.6 mol/L的滲透壓穩(wěn)定劑(蔗糖、KCl、山梨醇和甘露醇的PBS溶液)。然后，在Ps1960中加入10 μL含2 %蝸牛酶+1 %纖維素酶的混合酶液；在ScAADY中加入1.5 %蝸牛酶+1 %纖維素酶。28 ℃條件下酶解45 min后分別取酶解液進(jìn)行原生質(zhì)體計(jì)數(shù)。

1.5.1.4 原生質(zhì)體再生培養(yǎng)基的選擇 在上述優(yōu)化的酶解條件下，取0.1 mL Ps1960和ScAADY的酶解液，分別加入0.9 mL的0.6 mol/L山梨醇-PBS和甘露醇-PBS，經(jīng)8層擦鏡紙過濾。取0.1 mL過濾液分別涂布于4種再生培養(yǎng)基平板上。于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)36 h，平板菌落數(shù)計(jì)數(shù)，計(jì)算每種培養(yǎng)基的再生率。

1.5.2 原生質(zhì)體滅活 Ps1960和ScAADY原生質(zhì)體分別采用紫外滅活和熱滅活。取1 mL Ps1960原生質(zhì)體在20 W的紫外燈下，距離為10 cm，照射2、3、4 min，用錫紙避光20 min后分別取100 μL涂布于山梨醇再生培養(yǎng)基。30 ℃培養(yǎng)36 h，觀察菌落數(shù)并計(jì)算不同處理時(shí)間的滅活率。取1 mL ScAADY原生質(zhì)體置于55 ℃恒溫水浴鍋中，在20、30、40、50和60 min分別取100 μL滅活后的原生質(zhì)體涂布于甘露醇再生培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)36 h，觀察菌落數(shù)并計(jì)算不同處理時(shí)間的滅活率。

1.5.3 原生質(zhì)體融合 在優(yōu)化的原生質(zhì)體滅活條件下，各取1 mL滅活的Ps1960和ScAADY原生質(zhì)體，混合后2 000 r/min離心5 min，收集原生質(zhì)體，加入0.75 mL促融劑，30 ℃處理20 min，1 000 r/min離心5 min，去上清，用1.0 mol/L山梨醇溶液洗滌2次，稀釋并分別涂布于含0.6 mol/L甘露醇、山梨醇的再生培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)3 d后觀察，若再生培養(yǎng)平板上有菌落長(zhǎng)出，而滅活后原生質(zhì)體的再生培養(yǎng)平板上未有菌落長(zhǎng)出，即滅活率達(dá)100 %，所得到的菌落初步認(rèn)定為釀酒酵母和樹干畢赤酵母的融合子。

1.5.4 融合子的篩選

1.5.4.1 木糖代謝能力 挑取親本菌株P(guān)s1960、ScAADY和22株融合子，分別接種到含2 mL木糖發(fā)酵培養(yǎng)基的試管中，30 ℃、160 r/min搖床培養(yǎng)，每隔24 h取樣測(cè)其生物量(OD600)，培養(yǎng)至96 h結(jié)束。培養(yǎng)48 h時(shí)，OD600較高的菌株認(rèn)為其木糖代謝能力較強(qiáng)。

1.5.4.2 乙醇耐受性 挑取親本菌株和5株木糖發(fā)酵能力較強(qiáng)的融合子，分別接種至2 mL含有乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10 %和20 %的木糖發(fā)酵培養(yǎng)基試管中，30 ℃、160 r/min搖床培養(yǎng)，每隔24 h取樣測(cè)量其OD600值，培養(yǎng)至96 h結(jié)束。培養(yǎng)48 h時(shí)，OD600較高的菌株認(rèn)為其乙醇耐受能力較強(qiáng)。

1.5.4.3 傳代穩(wěn)定性 將融合子在6 %混合糖(m(木糖)∶m(葡萄糖)=6∶1)固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，14 d傳代一次，連續(xù)傳代15次后觀察融合子的形態(tài)，并檢測(cè)融合子發(fā)酵木糖產(chǎn)乙醇的能力。

1.6 發(fā)酵產(chǎn)乙醇條件優(yōu)化

研究混合碳源(質(zhì)量分?jǐn)?shù)6 %、8 %和10 %，m(木糖)∶m(葡萄糖)=6∶1,5 %接種量，30 ℃、160 r/min培養(yǎng)72 h)；碳源比例(m(木糖)∶m(葡萄糖)=3∶1、 6∶1、10∶1，質(zhì)量分?jǐn)?shù)8 %，5 %接種量，30 ℃，160 r/min培養(yǎng)72 h)；接種量(2 %、 5 %、 8 %，質(zhì)量分?jǐn)?shù)8 %混合碳源，m(木糖)∶m(葡萄糖)=6∶1，30 ℃，160 r/min培養(yǎng)72 h)；培養(yǎng)溫度(30、 34、 37 ℃，8 %接種量，質(zhì)量分?jǐn)?shù)8 %混合碳源，m(木糖)∶m(葡萄糖)=6∶1，160 r/min培養(yǎng)72 h)；發(fā)酵液初始pH值(5、6、7，質(zhì)量分?jǐn)?shù)8 %混合碳源，m(木糖)∶m(葡萄糖)=6∶1，接種量8 %，30 ℃，160 r/min培養(yǎng)72 h)；發(fā)酵時(shí)間(48、72、96 h，8 %接種量，質(zhì)量分?jǐn)?shù)8 %混合碳源，m(木糖)∶m(葡萄糖)=6∶1，30 ℃，160 r/min)對(duì)融合子生物量(OD600)、糖利用率以及乙醇產(chǎn)量的影響。

1.7 分析與測(cè)定

1.7.1 原生質(zhì)體形成率 原生質(zhì)體形成率=(酶解前菌落數(shù)-酶解后菌落數(shù))/酶解前菌落數(shù)×100 %。

1.7.2 原生質(zhì)體再生率 原生質(zhì)體再生率=(再生平板上的菌落數(shù)-普通平板上的菌落數(shù))/鏡檢原生質(zhì)體數(shù)×100 %。

1.7.3 原生質(zhì)體滅活率 原生質(zhì)體滅活率=(滅活前再生菌落數(shù)-滅活后再生菌落數(shù))/滅活前再生菌落數(shù)×100 %。

1.7.4 生物量(OD600)的測(cè)定 用移液器取100 μL的樣品于微量比色皿，置于紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定其OD600。采用相應(yīng)的空白培養(yǎng)基調(diào)零，每隔24 h測(cè)定一次。

1.7.5 還原糖含量的測(cè)定 參考文獻(xiàn)[6]采用DNS法測(cè)還原糖含量。

1.7.6 乙醇產(chǎn)量測(cè)定 參考文獻(xiàn)[7]的方法采用氣相色譜(GC)測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 原生質(zhì)體制備條件的優(yōu)化

2.1.1 酶組成和酶濃度 表1為酶組合對(duì)Ps1960和ScAADY原生質(zhì)體形成率、再生率的影響。由表1可知，復(fù)合酶的組成和濃度均影響2種原生質(zhì)體的形成率和再生率。單獨(dú)使用蝸牛酶時(shí)，隨著蝸牛酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)從1 %增加到3 %，Ps1960原生質(zhì)體的形成率、再生率均呈上升趨勢(shì)，分別從37.0 %增加到91.4 %和從11.6 %增加到42.1 %。與單一的蝸牛酶相比，相同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的蝸牛酶加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)1 %的纖維素酶共同作用時(shí)，原生質(zhì)體形成率進(jìn)一步增加；然而，當(dāng)復(fù)合酶中蝸牛酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)從2 %增加到3 %時(shí)，原生質(zhì)體再生率從46.1 %減少至38.1 %。故制備Ps1960原生質(zhì)體的最佳酶組合為2 %蝸牛酶+1 %纖維素酶。類似的制備ScAADY原生質(zhì)體的最佳酶組合為1.5 %蝸牛酶+1 %纖維素酶。蝸牛酶和纖維素酶是常用的真菌脫壁酶，不同種類微生物細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)與化學(xué)組成存在差異，采用合適濃度的復(fù)合酶共同作用才能達(dá)到適度的酶解效果。

表1 酶組合對(duì)Ps1960和ScAADY原生質(zhì)體形成率、再生率的影響

2.1.2 酶解時(shí)間 酶解時(shí)間的長(zhǎng)短直接影響原生質(zhì)體的形成率。酶解時(shí)間過短，導(dǎo)致脫壁不完全；酶解時(shí)間過長(zhǎng)，會(huì)使原生質(zhì)體脫水皺縮，再生率下降。由圖1可知，當(dāng)酶解時(shí)間為45 min時(shí)，Ps1960原生質(zhì)體的數(shù)量達(dá)到2×106個(gè)/mL，45 min后隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)原生質(zhì)體的數(shù)量呈逐漸下降的趨勢(shì)。因此，Ps1960最佳的酶解時(shí)間為45 min。類似的，可以確定ScAADY最佳酶解時(shí)間為50 min。

圖1 酶解時(shí)間對(duì)Ps1960和ScAADY原生質(zhì)體數(shù)量的影響Fig. 1 Effect of enzymolysis time on the protoplast quantities of Ps1960 and ScAADY

2.1.3 滲透壓穩(wěn)定劑 滲透壓穩(wěn)定劑可以維持細(xì)胞內(nèi)外滲透壓的平衡，避免原生質(zhì)體膨脹破裂，同時(shí)有助于酶和底物的結(jié)合。不同的菌株所采用的滲透壓穩(wěn)定劑不盡相同。本實(shí)驗(yàn)過程中，在ScAADY和Ps1960的菌懸液中分別加入0.6 mol/L的蔗糖、KCl、山梨醇和甘露醇4種滲透壓穩(wěn)定劑。通過測(cè)定ScAADY中原生質(zhì)體數(shù)量分別為6.7×106、8.5×106、1.1×107、1.1×107個(gè)/mL，0.6 mol/L山梨醇和甘露醇可以顯著增加原生質(zhì)體的數(shù)量，且效果相當(dāng)，其次是KCl和蔗糖溶液。在Ps1960中相應(yīng)的原生質(zhì)體數(shù)量分別為3.6×106、4.5×106、5.8×106個(gè)/mL，4種滲透壓穩(wěn)定劑對(duì)Ps1960原生質(zhì)體形成的影響與ScAADY相似。

2.1.4 原生質(zhì)體再生培養(yǎng)基的確定 再生培養(yǎng)基中滲透壓穩(wěn)定劑是原生質(zhì)體保持形狀完整的重要因素，同時(shí)也是原生質(zhì)體再生的關(guān)鍵因素。分別加入0.6 mol/L KCl、蔗糖、山梨醇和甘露醇，Ps1960原生質(zhì)體再生率分別為12.3 %、14.7 %、37.3 %和52.7 %，ScAADY原生質(zhì)體再生率分別為28.3 %、22.7 %、38.0 %和36.7 %。可見山梨醇和甘露醇作為滲透穩(wěn)定劑優(yōu)于蔗糖和KCl。綜合滲透壓穩(wěn)定劑對(duì)于原生質(zhì)體酶解以及再生的影響，確定采用0.6 mol/L山梨醇作為原生質(zhì)體酶解和再生培養(yǎng)基的滲透壓穩(wěn)定劑。

表2 Ps1960和ScAADY原生質(zhì)體滅活方式和滅活時(shí)間對(duì)滅活率的影響

2.2 原生質(zhì)體的滅活條件

由表2可知，ScAADY原生質(zhì)體在55 ℃水浴50 min，Ps1960原生質(zhì)體在20W紫外燈下距離10 cm照射3 min，滅活率達(dá)到100 %。目前認(rèn)為，溫度滅活原生質(zhì)體主要作用于細(xì)胞質(zhì)，使核糖體或核糖體RNA受到損傷，影響細(xì)胞內(nèi)功能蛋白的合成或活性，產(chǎn)生致死作用。而紫外線對(duì)原生質(zhì)體造成的致死損傷主要集中在DNA，且不同的原生質(zhì)體細(xì)胞中作用位點(diǎn)可能存在很大差異[8-9]。雙親滅活的原生質(zhì)體經(jīng)PEG等融合劑促融合，損傷互補(bǔ)修復(fù)后再生。

2.3 融合子的篩選

圖2 雙親菌株和5株融合子在木糖發(fā)酵培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)曲線Fig. 2 Growth curves of parental strains and 5 fusants on xylose fermentation medium

經(jīng)滅活的Ps1960與ScAADY原生質(zhì)體融合液在再生培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d后，平板上長(zhǎng)出了白色菌落，共獲得22株融合子，選取其中5株木糖發(fā)酵能力較強(qiáng)的融合子進(jìn)一步篩選。

2.3.1 木糖代謝能力測(cè)定 雙親菌株和5株木糖代謝能力較強(qiáng)的融合子(B2、C2、C4、D1和D2)在木糖發(fā)酵液中的生長(zhǎng)曲線見圖2?？紤]到目標(biāo)融合子應(yīng)具有較快的生長(zhǎng)速度，結(jié)合雙親菌株和各融合子0～96 h生物量(OD600)，確定采用48 h的生物量作為評(píng)價(jià)其木糖代謝能力的指標(biāo)。ScAADY在0～96 h內(nèi)生物量幾乎沒有增加，證實(shí)其不能利用木糖；Ps1960在48 h生物量達(dá)到最大值。而5株融合子在48 h內(nèi)的生物量均高于Ps1960，說明這5株融合子遺傳了親本菌株樹干畢赤酵母對(duì)木糖的發(fā)酵能力，且48 h時(shí)木糖代謝能力從高到低依次為D1>C4>B2>D2>C2。

利用生物量評(píng)價(jià)融合子木糖代謝能力，是基于發(fā)酵過程的物質(zhì)和能量守恒。木糖作為篩選過程的唯一碳源，生物量的增加取決于木糖的代謝。當(dāng)然，代謝的木糖可以產(chǎn)生多種產(chǎn)物，在發(fā)酵液中生物量最大，并不意味著乙醇的生產(chǎn)能力最大。乙醇作為次級(jí)代謝產(chǎn)物，與生物量的增加并非同步。因此，需要結(jié)合其他性狀進(jìn)一步篩選目標(biāo)融合子。

2.3.2 乙醇耐受性測(cè)定 圖3為雙親菌株和5株融合子在含不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)乙醇木糖發(fā)酵培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)曲線。由圖3可知，各菌株在含20 %乙醇的木糖發(fā)酵培養(yǎng)基中的生物量比相應(yīng)的含10 %乙醇的培養(yǎng)基低。以48 h時(shí)各菌株的生物量評(píng)價(jià)其乙醇耐受能力，發(fā)現(xiàn)48 h時(shí)，融合子C2、C4、D1和D2的乙醇耐受能力均優(yōu)于ScAADY，且對(duì)20 %乙醇的耐受能力從高到低依次為D2>C2>C4>D1。結(jié)合圖2可知，B2融合子雖然利用木糖的能力較強(qiáng)，但對(duì)酒精的耐受能力相對(duì)較低。故篩選所得的融合子C2、C4、D1、D2遺傳了親本釀酒酵母和樹干畢赤酵母的優(yōu)勢(shì)性狀，木糖發(fā)酵能力和乙醇耐受性能均優(yōu)于2株親本。

圖3 雙親菌株和5株融合子在含乙醇木糖發(fā)酵培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)曲線Fig. 3 Growth curves of parental strains and 5 fusants on xylose fermentation medium with ethanol

對(duì)乙醇較好的耐受性是高產(chǎn)乙醇融合子必須具備的性狀，即融合子對(duì)木糖的代謝能力僅僅是篩選高產(chǎn)乙醇融合子的必要條件，在此基礎(chǔ)上，融合子對(duì)乙醇的耐受性成為關(guān)鍵。因而，D2在木糖代謝能力測(cè)試中并不是最優(yōu)的菌株，但是，結(jié)合乙醇耐受能力的篩選，可推斷融合子D2具有較好的乙醇發(fā)酵能力。采用初始的木糖發(fā)酵培養(yǎng)基，在5 %的接種量條件下，融合子C4、C2、D1、D2培養(yǎng)72 h的乙醇產(chǎn)量分別為6.57、 9.67、 12.02和12.84 g/L，進(jìn)一步證實(shí)了上述分析的合理性。

一般的產(chǎn)乙醇融合子篩選是通過HPLC、GC等直接測(cè)定融合子乙醇的產(chǎn)量[10-11]，雖然結(jié)果準(zhǔn)確，但是實(shí)驗(yàn)工作量較大，測(cè)試成本高，難以開展大規(guī)模的融合子篩選實(shí)驗(yàn)。本研究篩選方法首先考慮了工業(yè)上能夠應(yīng)用的乙醇高產(chǎn)菌株的特點(diǎn)：具有較快的生長(zhǎng)速度和較高的乙醇耐受能力，因而通過木糖代謝能力進(jìn)行初步的快速篩選，然后通過乙醇耐受能力的測(cè)定進(jìn)一步篩選，這兩輪篩選方式在試管水平通過OD600測(cè)定即可完成，可以應(yīng)用于高通量的融合子篩選過程。

2.3.3 融合子的細(xì)胞形態(tài)和傳代穩(wěn)定性 在400倍的光學(xué)顯微鏡下，用亞甲基藍(lán)染色觀察融合子的細(xì)胞形態(tài)： Ps1960近似橢球形，而ScAADY近似圓形。5株融合子細(xì)胞大小與2株親本相似，形態(tài)上卻更加接近Ps1960的橢球形。經(jīng)過15代連續(xù)培養(yǎng)， 5株融合子的細(xì)胞形態(tài)、發(fā)酵木糖產(chǎn)乙醇能力、細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)量未產(chǎn)生明顯的變化(結(jié)果未呈現(xiàn))，表明5株融合子遺傳相對(duì)穩(wěn)定。

2.4 融合子D2產(chǎn)乙醇條件優(yōu)化

對(duì)初始條件下乙醇產(chǎn)量最高的融合子D2的發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果如表3所示。

從表3可知，隨著碳源質(zhì)量分?jǐn)?shù)由6 %增加到10 %，乙醇產(chǎn)量顯著增加，但是混合糖的利用率有所降低。從成本的角度考慮，選擇8 %的混合糖進(jìn)行融合子D2的發(fā)酵。此外，碳源的比例顯著影響乙醇的產(chǎn)生，其中m(木糖)∶m(葡萄糖)=6∶1優(yōu)于3∶1和10∶1。雖然6∶1的混合糖培養(yǎng)條件下生物量低于3∶1和10∶1，但是乙醇的產(chǎn)量達(dá)到40.58 g/L，是優(yōu)化前融合子D2乙醇產(chǎn)量12.84 g/L的3.16倍。3種比例的混合糖條件下，糖的利用率都較高(>97.5 %)。8 %的接種量條件下融合子生物量較低，但是隨著接種量由5 %提高到8 %，乙醇產(chǎn)量有所增加。5 %和8 %接種量相比，糖的利用率接近，但8 %接種量條件下乙醇產(chǎn)量增加約15 %，故選擇8 %的接種量。培養(yǎng)溫度從30 ℃增加至37 ℃，乙醇產(chǎn)量顯著降低。故融合子適宜的產(chǎn)乙醇培養(yǎng)溫度為30 ℃。另外，培養(yǎng)基的滅菌方式會(huì)影響菌體的生物量、糖的利用率以及乙醇產(chǎn)量，通過培養(yǎng)基碳源的分開滅菌，可以顯著提高菌體的生物量、糖的利用率以及乙醇產(chǎn)量。主要原因可能是高糖條件下，混合滅菌導(dǎo)致糖的消耗，并可能生成對(duì)菌體生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制的物質(zhì)。在自然pH值(pH值6)條件下，融合子的生物量和乙醇產(chǎn)量都達(dá)到最高，與酵母菌適合在pH值4～6的弱酸性條件下生長(zhǎng)一致。對(duì)碳源質(zhì)量分?jǐn)?shù)、碳源比例、接種量、培養(yǎng)溫度和發(fā)酵液初始pH值的研究都是在72 h條件下測(cè)定的，但是發(fā)酵時(shí)間的研究表明，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，乙醇產(chǎn)量還可以進(jìn)一步增加。Zhang等[12]通過兩輪基因改組篩選獲得了優(yōu)化的融合子ScF2，ScF2在100 g/L的木糖發(fā)酵培養(yǎng)基上培養(yǎng)72 h的乙醇產(chǎn)量為42 g/L，Harner等[13]綜述了利用木糖發(fā)酵乙醇相關(guān)酵母菌的研究進(jìn)展，Watanabe等[14]研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)紫外誘變的畢赤酵母最大乙醇產(chǎn)量為44 g/L, 與本研究融合子D2在72 h的乙醇產(chǎn)生能力相當(dāng)。近期，融合子D2轉(zhuǎn)化經(jīng)稀硫酸水解的中藥黃芪藥渣也獲得了進(jìn)展，經(jīng)兩步同步糖化共發(fā)酵乙醇質(zhì)量濃度最高為20.4 g/L[15]。

表3 融合子D2培養(yǎng)條件的優(yōu)化

1)*：碳源(木糖和葡萄糖)與培養(yǎng)基其他成分分開滅菌，其他溫度條件下均為混合滅菌carbon sources(xylose and glucose) were separated sterilization from other culture components， other temperatures were mixed sterilization

需要說明的是，本研究發(fā)酵條件的優(yōu)化采用了分批培養(yǎng)的方式進(jìn)行。部分實(shí)驗(yàn)在相同的培養(yǎng)條件下測(cè)試，但生物量和乙醇產(chǎn)量發(fā)生了較大的變化，如碳源比例(6∶1)和接種量(5 %)實(shí)驗(yàn)。原因可能與培養(yǎng)時(shí)的種子液質(zhì)量以及缺乏平行實(shí)驗(yàn)有一定的關(guān)系。未采用平行實(shí)驗(yàn)主要是便于快速初篩，但實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用了多個(gè)時(shí)間點(diǎn)的連續(xù)數(shù)據(jù)以提高觀察的準(zhǔn)確性。如開展高通量篩選實(shí)驗(yàn)，可以通過設(shè)置平行對(duì)照提高數(shù)據(jù)的精度。同時(shí)也表明下一步的發(fā)酵罐放大實(shí)驗(yàn)應(yīng)注意控制種子液的質(zhì)量和活性。

3 結(jié) 論

3.1 以Ps1960和ScAADY為親本，采用雙親滅活原生質(zhì)體技術(shù)制備木糖利用融合子，并優(yōu)化了制備條件，共獲得22株融合子，從中篩選出4株能利用木糖發(fā)酵生產(chǎn)乙醇且具有乙醇耐受性的融合子C4、C2、D1、D2。優(yōu)化后的制備條件為Ps1960采用2 %蝸牛酶和1 %纖維素酶在28 ℃酶解45 min，20 W紫外燈距離10 cm照射3 min滅活；ScAADY采用1.5 %蝸牛酶和1 %纖維素酶28 ℃酶解50 min，55 ℃水浴50 min滅活；0.6 mol/L山梨醇為較優(yōu)的滲透壓穩(wěn)定劑。

3.2 采用雙親滅活原生質(zhì)體融合技術(shù)，結(jié)合基于生物量測(cè)定融合子木糖代謝能力以及乙醇耐受能力的篩選策略，進(jìn)一步篩選獲得了遺傳性狀穩(wěn)定、能利用木糖高效發(fā)酵產(chǎn)乙醇的Ps1960與ScAADY的融合子D2。

3.3 優(yōu)化了融合子D2搖瓶乙醇發(fā)酵條件，采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)8 %的混合碳源，木糖與葡萄糖質(zhì)量比為6∶1， 5 %接種量，30 ℃，pH值6，培養(yǎng)72 h，乙醇產(chǎn)量可以達(dá)到40.58 g/L，是優(yōu)化前的3.16倍。

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Preparation of Xylose Metabolic Fusant D2 and Its Ethanol Fermentation Characteristics

ZHOU Lin1, QIU Ruijiao1, LIN Shanglong1, XU Shaoping2, ZHANG Ying2

(1. School of Biosciences and Biopharmaceutics,Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510006, China; 2. School of Chinese Herbal medicine,Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510006, China)

The xylose metabolic fusants were prepared by fusion of inactivated parental protoplasts withPichiastipitis1960(Ps1960) andSaccharomycescerevisiaeAADY(ScAADY) as parental strains. And the preparation conditions were optimized. The results showed that the Ps1960 protoplast was prepared by enzymolysis with 2 % snailase and 1 % cellulase for 45 min at 28 ℃, and then inactivation with 20 W ultroviolet lamp 10 cm away from the culture for 3 min. While ScAADY protoplast was prepared by enzymolysis with 1.5 % snailase and 1 % cellulase for 50 min at 28 ℃, and inactivation in water bath for 50 min at 55 ℃. And 0.6 mol/L sorbitol was used as osmotic stabilizer. And then, 22 fusants were obtained. The biomasses of the fusants under different culture medium conditions were determined to evaluate the ability of metabolism of xylose and ethanol tolerance. Thus, from 22 fusants, the fusant D2, which could ferment ethanol from xylose, with good hereditary feature was selected for ethanol fermentation. Furtherly, fusant D2 could produce 40.58 g/L ethanol under the conditions of 8 % mixed sugar, mass ratio of xylose and glucose 6∶1, inoculum size of 5 % and cultured for 72 h with shaking 160 r/min at 30 ℃.

Saccharomycescerevisiae;Pichiastipitis;protoplast fusion;inactivation;bioethanol

10.3969/j.issn.1673-5854.2017.04.003

2016-12-23

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(8140140277)；廣州中醫(yī)藥大學(xué)“青年英才培養(yǎng)工程”資助(QNYC20140112);廣東藥科大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(201510573024)

周 林(1977— )，男，湖北隨州人，講師，博士，從事生物技術(shù)研究；聯(lián)系電話：18620005915；E-mail：zhoulin@gdpu.edu.cn

*通訊作者：張 英(1976— )，女，副教授，博士，從事生物質(zhì)資源化利用研究；聯(lián)系電話：13527768825；E-mail：tjxyzy@gzucm.edu.cn。

TQ35;TK6;Q939.97

A

1673-5854(2017)04-0017-08