呂 品，范素芳，趙 勇，孫 勇，張 巖,,*，馬愛進(jìn)*

高效液相色譜-離子阱-飛行時間質(zhì)譜法快速篩查飲料中植物源性成分

呂 品1，范素芳2，趙 勇2，孫 勇3，張 巖1,2,*，馬愛進(jìn)4,*

（1.河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北 石家莊 050017；
2. 河北省食品檢驗研究院 河北省食品安全重點實驗室，河北 石家莊 050071；3.北京食品科學(xué)研究院，中國肉類食品綜合研究中心，北京 100068；4.中國標(biāo)準(zhǔn)化研究院，北京 100191）

采用高效液相色譜-離子阱-飛行時間質(zhì)譜對飲料中生物堿、皂苷和有機(jī)酸等24 種植物源性成分進(jìn)行快速篩查、定性識別和準(zhǔn)確定量。樣品經(jīng)高速離心，過0.22 μm水系濾膜后，以C18色譜柱（2.1 mm×250 mm，3.0 μm）分離，乙腈-0.1%甲酸溶液為流動相進(jìn)行梯度洗脫，正、負(fù)離子模式同時掃描。結(jié)果表明，24 種化合物在50～750 μg/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于0.995。樣品中各化合物的檢出限（以信噪比不小于3計）為8～20 μg/L。在3 種添加量（70、250、700 μg/L）條件下，其平均回收率為63.0%～126.6%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.11%～14.73%。該方法利用精確質(zhì)量數(shù)匹配和自建標(biāo)準(zhǔn)庫檢索，實現(xiàn)快速篩查，并使用多級特征碎片離子進(jìn)行確證，具有快速、高效、準(zhǔn)確等優(yōu)點，適用于飲料中多種植物源性成分的快速篩查和測定。

植物源性成分；液相色譜-離子阱-飛行時間質(zhì)譜；生物堿；皂苷

傳統(tǒng)中藥中包含多種藥物活性物質(zhì)[1]，中藥草已經(jīng)用于各種疾病的治療并且已經(jīng)成為藥物開發(fā)的化學(xué)資源庫[2-8]。飲料中包含多種植物源性成分[9-10]，過去二十年中，以草本植物為原料的產(chǎn)品在世界范圍內(nèi)大量涌現(xiàn)[11]。近年來，中藥成分為基礎(chǔ)的產(chǎn)品快速占領(lǐng)市場。以傳統(tǒng)中藥為原料生產(chǎn)的飲料也在市場占有一定份額，生產(chǎn)商也利用中藥成分的保健功能進(jìn)行宣傳。然而，目前還沒有相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)檢測方法來確認(rèn)產(chǎn)品中是否真的含有配料表中標(biāo)稱的植物成分以及所含的確切含量。同時，加入的植物原料還可能引入有毒的生物堿，對消費者的健康存在潛在的危害[12-14]。

植物源性成分篩查方法目前主要是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR），已經(jīng)有食品中大豆、馬鈴薯、玉米、番茄等植物源性成分的PCR方法[15]，可可粉中大豆粕、芝麻粕、花生殼和板栗殼的PCR檢測[16]，粉絲中綠豆、豌豆、玉米、紅薯與馬鈴薯成分的PCR定性檢測方法[17]等相關(guān)文獻(xiàn)。PCR方法從脫氧核酸水平檢測目標(biāo)物，操作過程涉及引物合成、DNA提取、PCR檢測，過程比較復(fù)雜。近年來高分辨質(zhì)譜已經(jīng)開始應(yīng)用于篩查分析中，有報道高分辨的四極桿-軌道阱質(zhì)譜用于中藥和膳食補(bǔ)充劑中非法添加的磷酸二酯酶（5 種抑制劑）的定性、定量分析[18]。超高效液相色譜-質(zhì)譜已經(jīng)廣泛應(yīng)用于不同基質(zhì)中農(nóng)藥殘留、獸藥殘留、興奮劑的篩查和確證分析[19-22]。液相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜有報道用于廢水和河水、豆芽、化妝品中微量有機(jī)污染物的自動篩查、確證及定量分析[23-25]。氣相色譜-高分辨的飛行時間質(zhì)譜已被應(yīng)用于評價海洋環(huán)境中有機(jī)污染物[26]。超臨界萃取作為一種快速前處理技術(shù)已經(jīng)用于樣品快速篩查的前處理過程中[27-30]。

蘆薈苷、齊墩果酸、熊果苷、綠原酸、木犀草苷、黃芪甲苷、連翹苷、連翹酯苷A、芍藥苷、綠化兩面針堿、三七皂苷R1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Re、二苯乙烯苷是常見功能性植物的活性成分，而阿托品、東莨菪堿、喜樹堿、馬錢子堿、鬼臼毒素、毛果蕓香堿、秋水仙堿、次烏頭堿、新烏頭堿、烏頭堿則是植物性成分中有毒生物鍵。同時檢測飲料中這24 種植物源成分，一方面能清楚飲料中的功能成分，同時篩查有毒成分是為保障消費健康。

本實驗建立一個快速液相色譜-離子阱-飛行時間質(zhì)譜的篩查方法用于測定飲料中24 種植物源性成分，旨在為為行政監(jiān)管提供技術(shù)支撐，為執(zhí)法、監(jiān)督和檢測提供依據(jù)，具有非常重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

涼茶、綠茶、碳酸飲料等 市購。

蘆薈苷、齊墩果酸、熊果苷、綠原酸、木犀草苷、黃芪甲苷、連翹苷、連翹酯苷A、芍藥苷、綠化兩面針堿、三七皂苷R1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Re、二苯乙烯苷、阿托品、東莨菪堿、喜樹堿、馬錢子堿、鬼臼毒素、毛果蕓香堿、秋水仙堿、次烏頭堿、新烏頭堿、烏頭堿24 種標(biāo)準(zhǔn)品均購于中國藥品生物檢定所和美國Sigma公司，純度高于92%。甲醇、乙腈、甲酸、乙酸（均為色譜純） 德國Merck公司；乙酸銨、甲酸銨（均為色譜純） 美國Fluka公司；實驗用水為超純水（Milli-pore系統(tǒng)，美國）；其他試劑為分析純級樣品。

高效液相色譜-離子阱-飛行時間質(zhì)譜系統(tǒng)及LC MS Solution V3.6工作站 日本島津公司；3K15高速離心機(jī)德國Sigma公司。

1.2 方法

（3）采用差壓雙塔萃取精餾工藝進(jìn)行節(jié)能改造，經(jīng)過比較分析，節(jié)能7.06%，模擬結(jié)果為對異丙醇-環(huán)己烷共沸體系的分離工藝的工業(yè)設(shè)計提供參考。

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別稱取10.0 mg上述標(biāo)準(zhǔn)品，置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度配制成1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，轉(zhuǎn)入棕色樣品瓶中，于-20 ℃保存。實驗中用甲醇稀釋上述標(biāo)準(zhǔn)儲備液，配制成不同質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)使用液，于4 ℃保存。

1.2.2 樣品處理

取10 mL樣品（涼茶、茶飲料等樣品）于50 mL離心管中，渦旋混勻30 s，10 000 r/min離心10 min，過0.22 μm水系濾膜。

1.2.3 高效液相色譜條件

色譜柱Shimadzu inertsil ODS-4（250 mm×2.1 mm，3.0 μm）；進(jìn)樣體積：1 μL；柱溫：40 ℃；流動相A相為0.1%甲酸溶液，B相為乙腈，流速為0.4 mL/min，梯度洗脫條件見表1。

表1 高效液相色譜梯度洗脫條件Table 1 Gradient elution conditions of HPLC

1.2.4 質(zhì)譜條件

表2 24 種化合物的質(zhì)譜參數(shù)Table 2 Mass spectrometric parameters for 24 compounds

1.2.5 數(shù)據(jù)庫

建立包括24 種目標(biāo)化合物的分子式、精確質(zhì)量數(shù)、離子加和物類型、二級特征碎片離子以及保留時間等信息數(shù)據(jù)庫，用于進(jìn)一步定性確證。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件和高效液相色譜條件的優(yōu)化

根據(jù)待測化合物的結(jié)構(gòu)特征和已有文獻(xiàn)報道，分別在正、負(fù)離子模式下考察各個化合物的質(zhì)譜參數(shù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)有機(jī)酸類化合物易在負(fù)離子模式下電離，形成[MH]-準(zhǔn)分子離子；生物堿易在正離子模式下，形成[M+ H]+準(zhǔn)分子離子；皂苷類化合物在正、負(fù)離子模式下均可電離，有[M+H]+、[M-H]-、[M+HCOO]-多種形式，其中[M+HCOO]-準(zhǔn)分子離子響應(yīng)最大，其中人參皂苷Rb1為[M+2HCOO]2-。因此充分利用離子阱-飛行時間質(zhì)譜快速正、負(fù)極轉(zhuǎn)換功能，對樣品同時進(jìn)行正、負(fù)離子模式掃描，實現(xiàn)一次進(jìn)樣得到所有化合物的質(zhì)譜信息，節(jié)省分析時間。同時優(yōu)化質(zhì)譜的離子源溫度、干燥氣流、檢測器電壓，使所有目標(biāo)化合物都有良好的響應(yīng)信號。

實驗考察了水-甲醇、0.1%甲酸-乙腈、0.1%甲酸-甲醇、5 mmol/L乙酸銨-乙腈和5 mmol/L甲酸銨-甲醇等流動相體系對色譜峰形以及質(zhì)譜強(qiáng)度的影響。通過比較發(fā)現(xiàn)當(dāng)用甲醇作為有機(jī)相時，多數(shù)化合物峰形寬且伴有峰分叉；選擇乙腈作為有機(jī)相時，無此現(xiàn)象，同時有利于化合物的去質(zhì)子化，提高離子化效率。水溶液中添加一定量的乙酸銨有助于化合物的色譜分離，但卻抑制了大多數(shù)化合物的離子化。由于皂苷等在負(fù)離子模式下易形成[M+HCOO]-或[M+CH3COO]-，因此在水溶液中加入0.1%甲酸有利于該類化合物的離子化。綜合考慮上述因素，選擇0.1%甲酸-乙腈作為流動相，梯度洗脫。

2.2 定性篩查及確證

在本研究選定的條件下，樣品基質(zhì)中添加24 種化合物，應(yīng)用高精度的質(zhì)量提取可獲得各化合物特征離子的提取色譜見圖1。通過檢索精確質(zhì)量譜庫，得到每種目標(biāo)物與精確質(zhì)量譜庫中化合物的匹配度。結(jié)果表明24 種化合物的匹配度均較高。因此，根據(jù)保留時間、精確質(zhì)量即可對多種化合物進(jìn)行定性篩查。如圖1所示，提取蘆薈苷的精確分子質(zhì)量時有兩個峰，因此要想準(zhǔn)確定性還需要借助于保留時間和二級質(zhì)譜掃描結(jié)果。篩查出的陽性樣品再經(jīng)二級譜圖掃描，通過二級特征碎片離子標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫檢索進(jìn)行確證。由于本方法是一個開放的體系，可以增加目標(biāo)化合物的分子式、精確質(zhì)量數(shù)和保留時間的數(shù)據(jù)庫，一次進(jìn)樣，在正、負(fù)離子模式下同時掃描，即可完成所有化合物的篩查。對樣品進(jìn)行全掃描，利用分子離子峰精確的質(zhì)量數(shù)和同位素峰以及特征碎片離子，即使在沒有標(biāo)準(zhǔn)品的情況下也能對飲料中植物源性成分進(jìn)行篩查和確證。

2.3 方法的線性關(guān)系及定量限

外標(biāo)法定量，采用空白基質(zhì)配制系列不同質(zhì)量濃度（50～750 μg/L）的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測定，以各組分的峰面積對其質(zhì)量濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到的線性回歸方程和線性相關(guān)系數(shù)見表3。以10 倍信噪比對應(yīng)的樣品添加質(zhì)量濃度作為方法的定量限，以3 倍信噪比對應(yīng)的樣品添加質(zhì)量濃度作為方法的檢出限，經(jīng)樣品添加實驗確定樣品中24 種目標(biāo)物的定量限為20～66 μg/L。

表3 24 種化合物的線性范圍、檢出限、定量限Table 3 Linearity range, limits of detection, and limits of quantitation for 24 compounds

2.4 回收率與精密度實驗結(jié)果

表4 樣品加標(biāo)回收率和精密度（n=6）Table 4 Recoveries and precision of the method (n= 6)

在樣品中分別添加低、中、高3 個水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行添加回收實驗，每個添加水平平行測定6 次，計算回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD），結(jié)果表明24 種化合物的平均回收率為63.0%～126.6%，RSD為4.11%～14.73%（表4）。

2.5 實際樣品分析

應(yīng)用本方法對市場上銷售的涼茶、綠茶、碳酸飲料共20 份進(jìn)行了測定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)4 例涼茶飲料中含有8.8～12.7 mg/L的綠原酸，1 份涼茶飲料中含有4.2 mg/L的木犀草苷，生物堿均未檢出。

3 結(jié) 論

本實驗建立了飲料中皂苷、有機(jī)酸和生物堿等24 種植物源性成分的液相色譜-離子阱-飛行時間質(zhì)譜篩查方法。樣品經(jīng)離心過濾，通過離子阱-飛行時間質(zhì)譜的精確質(zhì)量數(shù)匹配和二級特征碎片離子標(biāo)準(zhǔn)譜庫檢索，可實現(xiàn)對不同種類植物源性成分的同時定性篩查和定量分析。該方法前處理過程簡便、靈敏度高、選擇性好，滿足日常檢測要求，為飲料中植物源性成分的監(jiān)控和管理提供了技術(shù)保障，對嚴(yán)格控制食品的產(chǎn)品質(zhì)量具有重要意義。

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Rapid Screening and Confirmation of Plant-Derived Ingredients in Beverage by High Performance Liquid Chromatography-Ion Trap-Time of Flight Mass Spectrometry

Lü Pin1, FAN Sufang2, ZHAO Yong2, SUN Yong3, ZHANG Yan1,2,*, MA Aijin4,*
(1. College of Basic Medicine, Hebei Medical University, Shijiazhuang 050017, China; 2. Hebei Food Safety Key Laboratory, Hebei Food Inspection and Research Institute, Shijiazhuang 050071, China; 3. China Meat Research Center, Beijing Academy of Food Sciences, Beijing 100068, China; 4. China National Institute of Standardization, Beijing 100191, China)

A high performance liquid chromatography-ion trap-time of flight mass spectrometry method was used for rapid screening, confirmation and quantification of 24 alkaloids, saponins and organic acid in beverage. After centrifugation of samples at high speed and filtration through a 0.22 μm drainage membrane filter, the filtrate was separated on a C18column (2.1 mm × 250 mm, 3.0 μm) using a binary solvent system composed of acetonitrile and water containing 0.1% of formic acid through gradient elution. The analysis was carried out both in the positive and negative ion modes. The results showed that good linear relationships were obtained in the range of 50–750 μg/L for all 24 compounds with correlation coefficients of higher than 0.995. The limits of detection (LOD) obtained at signal-to-background noise of 3 for all analytes were in the range of 8–20 μg/L. Average recoveries were between 63.0% and 126.6% at three spiked levels (70, 250 and 700 μg/L) with relative standard deviations (RSDs) of 4.11%–14.73%. Depending on the match of accurate mass number and retrieval in the self-built standard library, rapid screening was achieved and multistage characteristic fragments were also used for confirmation. The method, thanks to its rapidity, high efficiency, and good accuracy, could be used in the rapid screening and determination of multi-plant derived ingredients in beverage.

plant-derived ingredients; liquid chromatography-ion trap-time of flight mass spectrometry; alkaloid; saponin

10.7506/spkx1002-6630-201716039

O657.63

A

1002-6630（2017）16-0245-06

2017-04-13

“十二五”國家科技支撐計劃項目（2015BAK36B03）；“十三五”國家重點研發(fā)計劃重點專項（2016YFF0202300）；國家重大科學(xué)儀器設(shè)備開發(fā)專項（2012YQ03011110）；河北省高等學(xué)校優(yōu)秀青年基金項目（YQ2013018）

呂品（1979—），女，副教授，博士，研究方向為食品安全。E-mail：lvpinzy@163.com

*通信作者：張巖（1979—），男，正高級工程師，博士，研究方向為食品安全。E-mail：snowwinglv@126.com馬愛進(jìn)（1975—），男，研究員，博士，研究方向為食品標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)。E-mail：maaj@cnis.gov.cn

呂品, 范素芳, 趙勇, 等. 高效液相色譜-離子阱-飛行時間質(zhì)譜法快速篩查飲料中植物源性成分[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(16): 245-250. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201716039. http://www.spkx.net.cn

Lü Pin, FAN Sufang, ZHAO Yong, et al. Rapid screening and confirmation of plant-derived ingredients in beverage by high performance liquid chromatography-ion trap-time of flight mass spectrometry[J]. Food Science, 2017, 38(16): 245-250. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201716039. http://www.spkx.net.cn