趙紅倩，宋風霞，江祥師，沈申燚，尚東亮，李莉蓉*

Plackett-Burman和Box-Behnken試驗優(yōu)化苦蕎蛋白酶解制備抗菌肽的工藝

趙紅倩，宋風霞，江祥師，沈申燚，尚東亮，李莉蓉*

（昆明理工大學云南省食品安全研究院，云南 昆明 650500）

用中性蛋白酶酶解苦蕎蛋白制備抗菌肽，以抑菌率和肽質量濃度為響應值，在底物質量分數(shù)、加酶量、pH值、酶解溫度和酶解時間5 個單因素試驗基礎上，采用Plackett-Burman試驗選出其中影響顯著的因素，再以肽質量濃度為評價指標，用Box-Behnken試驗優(yōu)化抗菌肽制備工藝。最佳工藝為：底物質量分數(shù)3.22%、加酶量4 000 U/g、pH 6.86。在此條件下，苦蕎蛋白酶解產生的肽質量濃度為32.41 mg/mL（預測值為32.12 mg/mL），對大腸桿菌抑菌率為（27.88±2.78）%，對金黃色葡萄球菌的抑菌率為（94.56±0.74）%。結果表明，優(yōu)化中性蛋白酶酶解苦蕎蛋白制備抗菌肽工藝合理。

苦蕎蛋白；酶解；抗菌肽；Plackett-Burman試驗；Box-Behnken試驗

抗菌肽也稱為宿主防御肽，是機體內源性基因編碼的先天性免疫應答物質[1-2]?？咕木哂锌咕钚愿?，抗菌譜廣，還具有抗真菌[3]、抗腫瘤活性[4]、抗病毒[5-6]、降血壓[7]、免疫調節(jié)[8]等活性。另外，抗菌肽選擇性作用于病源生物，對宿主細胞毒性低或沒有毒性；抗菌肽作用于微生物細胞時有多個靶目標，可以減少耐藥產生的風險[9]；抗菌肽在機體內最終被酶解為氨基酸，無殘留毒性。所以，抗菌肽以分子質量較小、溶解性好、抗菌譜廣、抗菌活性強、選擇性好、不易產生耐藥等特點，被作為新型抗菌劑應用于醫(yī)藥[10]、食品工業(yè)[11-12]、農業(yè)[13]等領域。

蕎麥屬于蓼科蕎麥屬的雙子葉植物。蕎麥屬有2 個栽培種，分別為甜蕎和苦蕎。苦蕎，學名韃靼蕎麥，是一種藥食兼用的經濟作物[14]。研究表明蕎麥具有抗氧化、降膽固醇和降糖等功能[15]，是一種極具開發(fā)潛力的食品原料。但目前對蕎麥的報道主要集中在蕎麥黃酮和蕎麥多糖，對蕎麥蛋白質和活性肽的研究相對較少。蕎麥蛋白量豐富，約為8.5%～19%[16-17]。對蕎麥蛋白和活性肽的研究發(fā)現(xiàn)了一些蕎麥降糖蛋白[18]、蕎麥抗氧化肽[19]、抗腫瘤肽[18]和抗菌肽[20]。Fujimura等[21]從蕎麥中分離得到了Fa-AMP1和Fa-AMP2兩種對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌及植物病原真菌的生長均有抑制作用的蕎麥抗菌肽。Leung等[22]從ttian蕎麥中獲得的有抗真菌作用的肽，還可抑制肝癌、乳腺癌、白血病腫瘤細胞的生長以及抑制HIV-1逆轉錄酶的活性。白承之等[23]研究發(fā)現(xiàn)苦蕎肽可抑制鏈格孢霉、白腐菌和綠色木霉的生長。趙琳[24]研究發(fā)現(xiàn)苦蕎萌發(fā)期蛋白具有一定的抗細菌和真菌活性。苦蕎活性蛋白和肽的研究越來越受到關注，這些研究為通過酶解苦蕎蛋白分離出具有抗菌活性的多肽提供了理論依據(jù)。

利用蛋白酶水解苦蕎蛋白是獲得大量苦蕎抗菌肽的較好方法。目前國內外對酶解制備苦蕎抗菌肽的相關研究報道較少。因此，優(yōu)化酶解蕎麥蛋白制備抗菌肽，對苦蕎抗菌肽的大量制備及應用具有重要意義。本研究用中性蛋白酶水解苦蕎蛋白，以抑菌率和肽質量濃度為指標，用Plackett-Burman試驗和Box-Behnken試驗聯(lián)用優(yōu)化抗菌肽制備工藝，為苦蕎抗菌肽的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大腸桿菌（ATCC 25922）、金黃色葡萄球菌（ATCC 29213）由上海魯微科技有限公司提供。

苦蕎粉 昆明市官渡區(qū)蘇榮調味食品廠；中性蛋白酶（20萬 U/g） 廣西南寧龐博生物工程有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

BXM-30R立式壓力蒸汽滅菌鍋、GSP-9050MBE隔水式恒溫培養(yǎng)箱、SW-CJ-2F超凈工作臺 上海博迅實業(yè)有限公司；TS-200B恒溫搖床 上海天呈實驗儀器制造有限公司；雷磁PHS-3G pH計 上海儀電科學儀器股份有限公司；XMTD-204數(shù)顯恒溫攪拌水浴鍋 金壇市白塔新寶儀器廠；XR1臺式高速冷凍離心機賽默飛世爾科技有限公司；UV-1800PC紫外-可見分光光度計 上海美譜達儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 苦蕎蛋白的制備

參照Ma yuanyuan等[25]的方法稍作修飾提取苦蕎蛋白。取20 g苦蕎粉，加200 mL去離子水，在室溫攪拌溶解10 min，用1.0 mol/L NaOH溶液調節(jié)蕎麥溶液pH值為8.5，在4 ℃條件下攪拌提取2 h。溶液經4 ℃、10 000 r/min離心10 min，取上清液用1.0 mol/L的HCl溶液調節(jié)pH值至4.0，室溫攪拌30 min后10 000 r/min離心10 min取沉淀。沉淀用去離子水洗3 遍后重新溶解在去離子水中，調節(jié)pH值至中性，經真空冷凍干燥得到苦蕎蛋白。

1.3.2 中性蛋白酶酶解苦蕎蛋白

用去離子水配制苦蕎粗蛋白溶液，使底物質量分數(shù)為4%。攪拌溶解20 min后用1.0 mol/L NaOH溶液調節(jié)至最適pH值，置于恒溫水浴鍋中。加入中性蛋白酶，開始酶解反應。水解過程中維持反應溶液的pH值和溫度恒定。酶解完成后將酶解液煮沸10 min以滅酶。冷卻，4 ℃、10 000 r/min離心15 min取上清液，調pH值至中性，即得苦蕎蛋白酶解產物。

1.3.3 肽質量濃度的測定

采用三氯乙酸沉淀結合福林-酚法測定可溶性肽含量[26]。取酶解產物，加入等體積10%的三氯乙酸，渦漩振蕩后靜置20 min。于4 ℃、10 000 r/min離心10 min。取1 mL上清液，加入5 mL堿性銅溶液混勻，室溫放置10 min。加入0.5 mL酚試劑，混勻后置于30 ℃水浴孵育30 min顯色。測定溶液在650 nm波長處的吸光度。以牛血清白蛋白為標準品制作標準曲線，從標準曲線求出可溶性肽質量濃度。

1.3.4 抑菌率測定

參照Tang Wenting等[27]方法測定抑菌率。取對數(shù)期細菌，以無菌生理鹽水洗3 遍后用新鮮Luria-Bertani培養(yǎng)基重懸為1×105CFU/mL的菌懸液。將100 μL酶解產物加入96 孔酶標板中，再加入等體積的菌懸液作為實驗組；以100 μL無菌生理鹽水代替等體積酶解產物作為對照組。在37 ℃條件下培養(yǎng)12 h后，用酶標儀測定620 nm波長處的OD值。按如下公式計算酶解液的抑菌率：

1.3.5 單因素試驗設計

根據(jù)中性蛋白酶酶解苦蕎蛋白制備抗菌肽的方法，分別考察底物質量分數(shù)（2.5%、3.0%、3.5%、4.0%、4.5%、5.0%）、加酶量（2 000、3 000、4 000、5 000、6 000、7 000 U/g）、pH值（5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5）、酶解溫度（35、40、45、50、55、60 ℃）和酶解時間（2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5 h）對酶解產物的肽質量濃度和抑菌率的影響，確定最佳因素水平。

1.3.6 Plackett-Burman試驗設計

根據(jù)單因素試驗結果確定底物質量分數(shù)、加酶量、pH值、酶解溫度和時間5 個因素的水平值。利用Design-Expert 8.0.6軟件進行Plackett-Burman試驗設計及數(shù)據(jù)處理，確定影響顯著的因素。

1.3.7 Box-Behnken試驗設計

根據(jù)Plackett-Burman試驗結果，選取底物質量分數(shù)、加酶量、pH值為影響中性蛋白酶酶解制備苦蕎抗菌肽的主要因素，以肽質量濃度為考察指標，利用Design-Expert 8.0.6軟件進行Box-Behnken試驗設計、數(shù)據(jù)處理和預測優(yōu)化最佳工藝條件。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 底物質量分數(shù)對抑菌率和肽質量濃度的影響

如圖1所示，隨著底物質量分數(shù)的增加，酶解產物對大腸桿菌的抑菌率先增加后減小；當?shù)孜镔|量分數(shù)為3.5%時，酶解產物對大腸桿菌的抑菌活性達到最大。不同底物質量分數(shù)酶解產物對金黃色葡萄球菌的抑菌率無顯著差異。酶解產物的肽質量濃度隨底物質量分數(shù)的增加而增加。綜合考慮底物質量分數(shù)對抑菌率和肽質量濃度的影響，選取3.5%底物質量分數(shù)。

圖1 底物質量分數(shù)對酶解產物抑菌率和肽質量濃度的影響Fig. 1 Effect of substrate concentration on antibacterial activity and peptide concentration of hydrolysates

2.1.2 加酶量對酶解產物抑菌率和肽質量濃度的影響

圖2 加酶量對酶解產物抑菌率和肽質量濃度的影響Fig. 2 Effect of enzyme-to-substrate ratio on antibacterial activity and peptide concentration of hydrolysates

由圖2可知，加酶量從2 000 U/g增加到3 000 U/g時，酶解產物對大腸桿菌的抑菌率顯著增加；加酶量從3 000 U/g增加到6 000 U/g時，酶解產物對大腸桿菌的抑菌率之間無顯著差異；加酶量增加到7 000 U/g時，對大腸桿菌抑菌率下降。不同加酶量的酶解產物對金黃色葡萄球菌的抑菌率沒有顯著差異。酶解產物的肽質量濃度隨加酶量的增加呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢，這是由于隨著加酶量的增加，酶與底物接觸增加，肽質量濃度也隨著增加，加酶量繼續(xù)增加反而使酶解產物中部分肽進一步酶解成氨基酸，導致肽質量濃度下降。綜合考慮加酶量對抑菌率和肽質量濃度的影響，故選取3 000 U/g的加酶量。

2.1.3 酶解pH值對酶解產物抑菌率和肽質量濃度的影響

圖3 pH值對酶解產物抑菌率和肽質量濃度的影響Fig. 3 Effects of pH on antibacterial activity and peptide concentration of hydrolysates

如圖3所示，隨著pH值從5.5升高到7.0，酶解產物對大腸桿菌的抑菌率增加，但不同pH值組間差異不顯著。pH 8.0時，對大腸桿菌抑菌率最高。在pH 7.5和pH 8.5時，酶解產物對大腸桿菌沒有抑菌活性。在pH 5.5～7.0變化時，酶解產物對金黃色葡萄球菌的抑菌率無顯著差異。pH值由7.0增加到8.5，酶解產物對金黃色葡萄球菌的抑菌活性呈現(xiàn)減小的趨勢。pH 8.5時，酶解產物對金黃色葡萄球菌無抑菌活性，甚至促進菌的生長。綜合考慮pH值對抑菌率和肽質量濃度的影響，選取pH 7.0。

2.1.4 酶解溫度對酶解產物抑菌率和多肽質量濃度的影響

如圖4所示，在35～55 ℃的酶解溫度條件下，酶解產物對大腸桿菌的抑菌率無顯著性差異；酶解溫度繼續(xù)由50 ℃升高至60 ℃，抑菌率降低。酶解產物的肽質量濃度隨溫度增加先增加后減小。綜合考慮酶解溫度對酶解產物的抑菌率和肽質量濃度的影響，選取50 ℃的酶解溫度。

圖4 酶解溫度對酶解產物抑菌率和肽質量濃度的影響Fig. 4 Effects of hydrolysis temperature on antibacterial activity and peptide concentration of hydrolysates

2.1.5 酶解時間對酶解產物抑菌率和多肽質量濃度的影響

圖5 酶解時間對酶解產物抑菌率和肽質量濃度的影響Fig. 5 Effects of hydrolysis time on antibacterial activity and peptide concentration of hydrolysates

由圖5可知，酶解2 h和4.5 h的酶解產物對大腸桿菌的抑菌率最低，其他酶解時間的酶解產物對大腸桿菌的抑菌率無顯著差異；在酶解2 h酶解產物對金黃色葡萄球菌的抑菌率最低，其他酶解時間的酶解產物抑菌率無顯著差異；肽質量濃度在酶解2.5 h時最高，隨時間變化沒有呈現(xiàn)一定的規(guī)律性。當酶解2 h時，肽質量濃度已達到27 mg/mL以上，但此時其抑菌率較其他酶解時間低，因為抗菌肽的活性與肽序列的氨基酸組成密切相關[28-29]，中性蛋白酶作用于苦蕎蛋白時有多個酶切位點，酶解苦蕎蛋白會得到多種序列苦蕎肽，但這些肽活性相對較低。綜合考慮酶解溫度對抑菌率和肽質量濃度的影響，選取酶解時間2.5 h。

2.2 Plackett-Burman試驗結果

Plackett-Burman可通過部分因素的兩水平的試驗設計，比較所考察的因素兩水平的差異與整體的差異來確定因素的顯著性，達到篩選因素節(jié)約試驗資源的目的[30]。利用Plackett-Burman試驗設計對底物質量分數(shù)、加酶量、pH值、酶解溫度、酶解時間這5 個因素進行篩選，得到對酶解產物的肽質量濃度影響顯著的因素，試驗設計及響應值見表1，試驗結果的統(tǒng)計分析見表2。

表1 Plackett-Burman試驗設計及結果Table 1 Plackett-Burman experimental design with experimental results

表2 Plackett-Burman試驗統(tǒng)計分析Table 2 Statistical analysis of the Plackett-Burman design

由表2可知，R2＝0.933 6，即有93.36%試驗數(shù)據(jù)的差異可用該模型解釋。底物質量分數(shù)對肽質量濃度的影響顯著（P＜0.05）；加酶量和pH值對肽質量濃度的影響極顯著（P＜0.01）；酶解溫度和酶解時間對肽質量濃度的影響不顯著（P＞0.05）。故選取底物質量分數(shù)、加酶量和pH值這3 個因素進行Box-Behnken試驗。

2.3 Box-Behnken試驗結果

表3 Box-Behnken試驗設計與結果Table 3 Box-Behnken design with response value

表4 Box-Behnken試驗方差分析Table 4 Analysis of variance for the Box-Behnken design

以底物質量分數(shù)（A）、加酶量（B）和pH值（C）為自變量，肽質量濃度為響應值進行Box-Behnken試驗設計，以1、0、-1分別代表自變量的3 個水平，試驗設計水平表及響應值見表3，方差分析見表4。由表4可知方程失擬項不顯著（P＝0.064 0＞0.05），說明回歸方程不失擬，表明所選模型適合，可以用該模型來擬合試驗；方程模型極顯著（P＜0.01），說明多元回歸方程能較好地擬合試驗結果；模型確定系數(shù)R2為0.973 8，R2Adj為0.940 0，表明模型的相關性和解釋度都很好。因此該Box-Behnken試驗設計可靠，模型可以應用于中性蛋白酶酶解苦蕎蛋白制備抗菌肽的理論預測。在該模型中，回歸系數(shù)的顯著性檢驗顯示一次項A和交互項AC的影響達到顯著水平；一次項B，平方項A2、C2和交互項BC的影響均達到極顯著水平；3 個因素對酶解產物肽質量濃度影響大小的排序為：B＞A＞C。軟件擬合出的二次多項回歸方程為：Y＝30.13+1.04A+2.78B-0.66C-0.86AB-1.56AC-2.85BC-3.62A2+0.81B2-4.84C2。

圖6 各因素交互作用對肽質量濃度影響的響應面圖Fig. 6 Response surface plots showing the interactive effects of various factors on peptide concentration

由圖6a可知，無論加酶量處于何種水平，隨著底物質量分數(shù)的增加，酶解產物的肽質量濃度呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，原因可能是酶與底物處于低水平時，酶解不充分，生成抗菌肽的量較少，而處于較高水平時，生成的抗菌肽被酶解為更小的分子片段。無論底物質量分數(shù)處于何種水平，隨著加酶量的增加，酶解產物的肽質量濃度呈現(xiàn)增加的趨勢，原因可能是隨著加酶量的增加，酶與底物接觸更充分。

由圖6b可知，無論pH值處于何種水平，隨著底物質量分數(shù)的增加，酶解產物的肽質量濃度呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，原因可能為底物質量分數(shù)高時，酶解不充分，生成抗菌肽的量較少，而底物質量分數(shù)較高時，生成的抗菌肽被酶解為更小分子的肽和氨基酸。無論底物質量分數(shù)處于何種水平，隨著pH值的升高，酶解產物的肽質量濃度呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢，原因可能為高pH值或低pH值導致蛋白酶活力降低。

圖6c顯示，無論加酶量處于何種水平，隨著pH值的升高，酶解產物的肽質量濃度先升高后降低，原因可能為高pH值或低pH值導致蛋白酶活力降低。pH值處于低水平時，隨著加酶量的增加，酶解產物的肽質量濃度呈現(xiàn)增加的趨勢，原因可能是隨著加酶量的增加，酶與底物接觸更充分；pH值處于高水平時，隨著加酶量的增加，肽質量濃度增加平緩，原因可能是高pH值使酶活降低，增加加酶量對肽質量濃度的增加作用受pH值影響，導致肽質量濃度增加緩慢。

2.4 最佳抗菌肽制備工藝驗證實驗

通過軟件分析可得，中性蛋白酶酶解苦蕎蛋白制備抗菌肽的最佳工藝條件為底物質量分數(shù)3.22%、加酶量4 000 U/g、pH 6.86，酶解產物的肽質量濃度預測值為32.12 mg/mL。在此條件下進行3 次平行驗證實驗，取平均值，實際測得酶解產物的肽質量濃度為32.41 mg/mL，實際值與預測值相對誤差為0.90%，說明采用Box-Behnken試驗優(yōu)化得到的工藝參數(shù)準確可靠，有實際應用價值。測得在此條件下，酶解產物對大腸桿菌抑菌率為（27.88±2.78）%，對金黃色葡萄球菌的抑菌率為（94.56±0.74）%。

3 結 論

本研究利用用Plackett-Burman試驗和Box-Behnken試驗聯(lián)用分析中性蛋白酶酶解苦蕎蛋白制備抗菌肽過程中的底物質量分數(shù)、加酶量、pH值、酶解溫度和時間對酶解產物肽質量濃度和抑菌活性的影響。確定的顯著影響因素為底物質量分數(shù)、加酶量和pH值，最佳工藝參數(shù)為底物質量分數(shù)3.22%、加酶量4 000 U/g、pH 6.86，酶解產物肽質量濃度預測值為32.12 mg/mL。經驗證實際值為32.41%，該模型準確可靠。該模型下，酶解產物對大腸桿菌抑菌率為（27.88±2.78）%，對金黃色葡萄球菌的抑菌率為（94.56±0.74）%。該研究表明利用中性蛋白酶酶解苦蕎蛋白制備抗菌肽是可行的，研究為苦蕎抗菌肽的制備和利用提供參考。

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Optimization of Enzymatic Hydrolysis of Tartary Buckwheat Protein for Preparing Antibacterial Peptides by Plackett-Burman and Box-Behnken Designs

ZHAO Hongqian, SONG Fengxia, JIANG Xiangshi, SHEN Shenyi, SHANG Dongliang, LI Lirong*
(Yunnan Institute of Food Safety, Kunming University of Science and Technology, Kunming 650500, China)

The enzymatic hydrolysis of tartary buckwheat protein with neutral protease to produce antibacterial peptides was optimized using Plackett-Burman and Box-Behnken designs. One-factor-at-a-time experiments were carried out to investigate the effect of substrate concentration, enzyme-to-substrate ratio, pH, hydrolysis temperature and time on the antibacterial activity and peptide concentration of hydrolysates. The factors with a significant influence on the response variables were selected using Plackett-Burman design and optimized for maximum peptide concentration using Box-Behnken design. The optimum parameters for enzymatic hydrolysis were determined as follows: substrate concentration 3.22%, enzyme-to-substrate ratio 4 000 U/g and pH 6.86. Under these conditions, the peptide concentration was 32.41 mg/mL, in good agreement with the predicted value (32.12 mg/mL), and the percentage inhibition of antimicrobial peptides was (27.88 ± 2.78)% against E. coli and (94.56 ± 0.74)% against S. aureus. In conclusion, this optimized procedure was reasonable.

tartary buckwheat protein; enzymatic hydrolysis; antibacterial peptides; Plackett-Burman design; Box-Behnken design

10.7506/spkx1002-6630-201716025

TS201.1

A

1002-6630（2017）16-0158-07

趙紅倩, 宋風霞, 江祥師, 等. Plackett-Burman和Box-Behnken試驗優(yōu)化苦蕎蛋白酶解制備抗菌肽的工藝[J]. 食品科學, 2017, 38(16): 158-164. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201716025. http://www.spkx.net.cn

ZHAO Hongqian, SONG Fengxia, JIANG Xiangshi, et al. Optimization of enzymatic hydrolysis of tartary buckwheat protein for preparing antibacterial peptides by Plackett-Burman and Box-Behnken designs[J]. Food Science, 2017, 38(16): 158-164. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201716025. http://www.spkx.net.cn

2016-10-24

國家自然科學基金地區(qū)科學基金項目（31460424）；云南省省級人培項目（KKSY20140505）；昆明理工大學大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項目（201610674099）

趙紅倩（1995—），女，本科生，研究方向為食品科學與工程。E-mail：617956328@qq.com

*通信作者：李莉蓉（1980—），女，副教授，博士，研究方向為食品營養(yǎng)與功能因子。E-mail：lilirong-lily@126.com