田雪蓮，尹顯慧,*，龍友華，蔡 滔，李 洪

獼猴桃潰瘍病菌拮抗菌篩選、鑒定及發(fā)酵條件優(yōu)化

田雪蓮1，尹顯慧1,*，龍友華1，蔡 滔2，李 洪1

（1.貴州大學作物保護研究所，貴州 貴陽 550025；2.貴州省農產品質量安全監(jiān)督檢驗測試中心，貴州 貴陽 550004）

目的：從不同地區(qū)獼猴桃根際土壤中篩選拮抗獼猴桃潰瘍病菌的菌株，優(yōu)化其產生抑菌活性物質的發(fā)酵條件，為獼猴桃潰瘍病的生物防治提供潛在的資源菌。方法：采用平板稀釋法從獼猴桃根際土壤中分離獲得菌株，采用抑菌圈法篩選拮抗菌；通過形態(tài)學特征、生理生化特征及16S rDNA序列分析對其進行鑒定；并采用單因素及正交試驗優(yōu)化培養(yǎng)基組分及發(fā)酵條件。結果：從土壤中共分離到288 株放線菌，其中編號為NA-TXL-1的菌株對獼猴桃潰瘍病菌的拮抗效果最佳，采用預防法、治療法進行盆栽實驗，發(fā)酵原液的防治效果分別為73.06%、55.62%，初步鑒定該菌株為抗生鏈霉菌。其最佳發(fā)酵配方和培養(yǎng)條件為：乳糖30 g/L、酵母粉3 g/L、NaCl 1 g/L、K2HPO40.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、FeSO40.01 g/L，種子培養(yǎng)基為乳糖-酵母粉培養(yǎng)基，接種量為2%，起始pH值為7.0，發(fā)酵原液、上清液、重懸液分別培養(yǎng)5、14、5 d。結論：經鑒定，拮抗菌株為Streptomyces antibioticus。在優(yōu)化的發(fā)酵條件下，該菌株對獼猴桃潰瘍病菌具有更好的拮抗效果。

獼猴桃潰瘍病菌；拮抗菌；篩選；鑒定；發(fā)酵條件優(yōu)化

獼猴桃潰瘍病是由丁香假單胞桿菌獼猴桃致病變種（Pseudomonas syringae pv. actinidiae，Psa）引起的細菌性病害[1]。其發(fā)生具有范圍廣、傳播快、致病性強、防治難度大等特點，可在短期內造成大面積樹體死亡，特別是感病品種，當年病害暴發(fā)，當年或第二年造成全園毀滅慘重損失的現象屢見不鮮，現已被列為中國森林植物檢疫性病害，是獼猴桃生產和發(fā)展中的毀滅性病害[2]。目前防治該病主要采取綜合防治和化學防治相結合的方法，但防治效果都不理想，特別是化學農藥的過量使用，使Psa對一些化學農藥（如硫酸銅和農用鏈霉素）產生抗藥性，更對人類健康造成危害[3]。因此，開展以生物防治為主的綜合防治研究，對該病的防治具有重要意義，而篩選高效拮抗菌是進行生物防治研究的基礎[4]。

利用拮抗菌防治獼猴桃潰瘍病已有研究報道。盛存波等[5-6]從根際土壤中篩選出了芽孢桿菌B56-3，稀釋100倍的B56-3發(fā)酵濾液采用噴霧和病斑刮除涂抹相結合的方法對潰瘍病的治療效果和病斑治愈率分別可達86.5%和91.4%。邵寶林等[7]從土壤中分離出防治效果較好的蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）B2。Tu Xuan等[8]篩選出內生放線菌gCLA4，21 d的gCLA4對Psa相對防治效果可達66.7%。黃以超等[9]篩選出鏈霉菌屬的孢桿鏈霉菌（Streptomyces sporovirgulis）TGNBSA5，進一步研究表明是TGNBSA5的發(fā)酵液中分離出的代謝產物苯甲醇對Psa有抑菌作用。但目前利用微生物資源對獼猴桃潰瘍病進行生物防治的研究還較少。

本研究從不同地區(qū)獼猴桃根際土壤中篩選出一株對獼猴桃潰瘍病菌有較好拮抗作用的生防菌株，并優(yōu)化了拮抗菌的發(fā)酵條件，以期為該病的生物防治增加新的生防菌資源。

1 材料與方法

1.1 材料與菌株

土壤：2014年11月分別在貴州省修文縣、大方縣、三穗縣、六盤水，四川蒼溪縣獼猴桃園中采集土壤樣品，風干后進行菌株分離。

供試植株品種為貴長獼猴桃。

供試菌株：從修文縣久長鎮(zhèn)獼猴桃發(fā)病植株上分離，經16S rDNA鑒定為獼猴桃潰瘍病菌，基因登記號為KX769816。

1.2 培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、瓊脂15～20 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.2～7.4，121 ℃滅菌30 min。

高氏一號培養(yǎng)基：可溶性淀粉20 g、KNO31 g、K2HPO40.5 g、MgSO40.5 g、NaCl 0.5 g、FeSO40.01 g、瓊脂15～20 g、蒸餾水1 000 mL，pH 7.2～7.4，121 ℃滅菌30 min。

1.3 方法

1.3.1 拮抗菌的分離篩選

分離：稱取土壤10 g，加入有90 mL無菌水的三角瓶中，200 r/min振蕩60 min，即成10-1菌懸液，然后從所得菌懸液中吸取1 mL加入有9 mL無菌水的試管中，依次稀釋到10-4和10-5的菌懸液。取0.1 mL 10-4和10-5的菌懸液均勻涂布于高氏一號、NA平板上，每個稀釋度重復3次，然后置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)5、2 d，挑取形態(tài)特征相異的單個菌落，經培養(yǎng)純化后作為供試菌株。

初篩：將純化保存的放線菌、細菌活化后，采用噴霧法進行初篩。具體操作如下：將活化的放線菌、細菌分別接種于高氏一號、NA培養(yǎng)基中央，于28 ℃培養(yǎng)3 d、6 h后，將過夜培養(yǎng)16 h的獼猴桃潰瘍病菌1×108CFU/mL菌懸液對其進行噴霧，培養(yǎng)24 h后觀察有無抑菌圈、測量抑菌圈大小，篩選出有明顯抑制作用的拮抗菌菌株，編號保存。

復篩：取初篩中抑菌效果較好的放線菌，先在高氏一號平板上活化，后接種于高氏一號液體培養(yǎng)基中，于28 ℃、120 r/min恒溫搖床中培養(yǎng)7 d后，獲得發(fā)酵原液。以分離到的致病力最強的獼猴桃潰瘍病菌株為靶標菌，采用抑菌圈法測定其抑菌活性，重復3 次。28 ℃培養(yǎng)24 h后，測量抑菌圈直徑大小，本實驗中所指的抑菌圈直徑均為有效抑菌圈直徑，根據公式（1）計算。

式中：濾紙片直徑為6 mm。

1.3.2 拮抗菌NA-TXL-1的鑒定

拮抗菌株的形態(tài)特征[10-11]及生理生化特性的鑒定參照《鏈霉菌鑒定手冊》[12]方法進行，并與《放線菌的分類和鑒定》[13]中相關菌株特征進行比較。16S rDNA序列分析采用細菌基因組提取試劑盒提取T3-5菌株基因組DNA。采用通用引物27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和1492R：5’-GGCTACCTTGTTACGACTT-3’進行菌株16S rDNA PCR擴增。PCR產物電泳檢測回收，交上海生工生物工程有限公司純化并測序。利用NCBI數據庫中BLAST程序對所測序列進行比對分析，選擇GenBank中與之同源性較高菌種的模式菌株16S rDNA序列，利用Clustal X1.8軟件對其進行多重比對，分析菌株T3-5與參比菌株之間的序列相似度，并通過MEGA 4.0軟件的Maximum Parsimony構建系統(tǒng)發(fā)育樹，并進行Bootstrap分析檢驗，重復1 000 次。

1.3.3 拮抗菌NA-TXL-1發(fā)酵條件優(yōu)化

1.3.3.1 不同種子培養(yǎng)基對NA-TXL-1發(fā)酵液抑菌活性的影響

6 種不同初選種子培養(yǎng)基見表1，每組處理設3 個重復，按照雙層瓊脂法[14]測定抑菌活性。

表1 6 種初選種子培養(yǎng)基成分Table 1 Compositions of six seed culture media used for primary screening

1.3.3.2 不同碳源、氮源、無機鹽對NA-TXL-1發(fā)酵液抑菌活性的影響

在培養(yǎng)條件不變的情況下，分別用葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、甘油和乳糖等量代替高氏一號液體培養(yǎng)基中的可溶性淀粉；分別用蛋白胨、牛肉浸汁、硫酸銨、草酸銨、酵母粉等量代替高氏一號液體培養(yǎng)基中的KNO3；分別用KCl、MgSO4等量代替高氏一號液體培養(yǎng)基中的NaCl，按照1.3.3.1節(jié)的方法測定，重復3 次，確定最佳碳源、氮源和無機鹽。

1.3.3.3 營養(yǎng)條件的正交試驗

選擇最佳碳源（乳糖）和氮源（酵母粉）以及無機鹽（NaCl）的含量共3 個因素，設置3 個水平，選用L9（34）正交表進行正交試驗（表2），發(fā)酵實驗重復3 次，抑菌活性按照1.3.3.1節(jié)的方法測定，將3 次的平均值作為實驗結果，分析后獲得最佳發(fā)酵配方。

表2 正交試驗因素和水平Table 2 Code and level of factors used fororthogonal array design

表2 正交試驗因素和水平Table 2 Code and level of factors used fororthogonal array design

水平因素A乳糖含量/（g/L）B酵母粉含量/（g/L）C NaCl含量/（g/L）1 2010.5 2 3021.0 3 4032.0

1.3.3.4 不同培養(yǎng)條件對NA-TXL-1發(fā)酵液抑菌活性的影響

接種量：將NA-TXL-1置于最佳種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 d后，轉接于高氏一號液體培養(yǎng)基中，裝液量為100 mL/250 mL，接種量分別為0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%，30 ℃、160 r/min培養(yǎng)5 d后測抑菌活性；起始pH值：分別調成5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，28 ℃振蕩在優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)5 d后測抑菌活性；培養(yǎng)時間：將NA-TXL-1接種于優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基中，裝液量為100 mL/250 mL，接種量0.2%，28 ℃、160 r/min培養(yǎng)，于第5、8、11、14、17、20天分別測發(fā)酵原液、上清液、重懸液的抑菌活性。

1.3.4 拮抗菌NA-TXL-1的盆栽實驗

當獼猴桃實生苗長出4～6 片真葉時，選取生長比較健壯、植株大小相似的獼猴桃，根系帶土同時將葉片剪去一半移栽到塑料桶中。實驗將拮抗菌發(fā)酵液分別配制成發(fā)酵原液（濃度1×108CFU/mL）、上清液（經0.22 μm濾膜過濾）、重懸液（培養(yǎng)原液離心后，棄上清液，經滅菌水清洗2 次，濃度1×108CFU/mL）、對照（無菌水）共4 個處理，每個處理重復5 次，于2015年2月下旬進行。

預防法：采用噴霧處理的方法，噴施待測發(fā)酵濾液，每隔5 d噴施一次。噴施3 次后，于7 d后采用針刺法接種獼猴桃潰瘍病菌（每個處理接種部位30 個），接菌后保濕48 h，之后進入常規(guī)管理。接種30 d后測量病斑的直徑，并計算發(fā)病率和防治效果。

治療法：采用針刺法先接種獼猴桃潰瘍病菌，接菌后保濕48 h，之后每隔5 d噴施一次拮抗菌，共噴施3 次。接種30 d后測量病斑的直徑，并按公式（2）、（3）計算病情指數和防治效果。

其中，獼猴桃潰瘍病分級標準為：0級，無?。?級，輕病，1/3以下的枝條發(fā)病或者萎蔫死亡、或者主桿病斑不超過莖圍1/3；2級，中病，1/3～1/2的枝條發(fā)病或者萎蔫死亡、或者主桿病斑環(huán)繞莖圍1/3～1/2；3級，重病，1/2～3/4的枝條發(fā)病或萎蔫死亡、或者主桿病斑環(huán)繞莖圍1/2～3/4；4級，全株死亡。

1.4 數據分析

采用SPSS 19.0數據處理系統(tǒng)對實驗數據進行單因素方差分析，采用Duncan’s新復極差法進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 拮抗菌的分離篩選

表3 拮抗菌對獼猴桃潰瘍病菌的抑菌活性Table 3 Antibiotic activity of antagonistic isolates against Pseudomonas syringaepv.actinidiae

圖1 拮抗菌NA-TXL-1抑菌效果Fig. 1 Inhibitory effect of strain NA-TXL-1

采用平板稀釋法從不同地區(qū)獼猴桃根際土壤中共分離出288 株放線菌、649 株細菌，采用噴霧法篩選出了16 株對獼猴桃潰瘍病菌有抑菌活性的拮抗放線菌（表3），其中抑菌圈直徑10～20 mm有9 株，20～30 mm有5 株，40～50 mm有2 株，為Jh16、NATXL-1，而分離出的649 株細菌對獼猴桃潰瘍病菌均無抑制效果。通過抑菌圈法復篩，表明菌株NA-TXL-1對獼猴桃潰瘍病菌的拮抗作用最顯著，初篩、復篩直徑分別達到50.3、21.0 mm（圖1）。

2.2 拮抗菌株NA-TXL-1的鑒定

2.2.1 菌株形態(tài)特征

圖2 掃描電子顯微鏡下拮抗菌株NA-TXL-1的形態(tài)特征Fig. 2 Morphological characteristics of strain NA-TXL-1 under SEM

拮抗菌株NA-TXL-1在高氏一號培養(yǎng)基上呈白色卵圓形，菌落緊密，不透明，表面皺褶，常以鏈狀排列，菌落灰色，有黃色素產生。在掃描電子顯微鏡下發(fā)現，孢子絲螺旋形，長圓形，表明光滑，纖細直長，相互纏繞，基內菌絲多分支，不斷裂，孢子上有泡狀物和膨大物（圖2）。

2.2.2 菌株生理生化特性由表4可知，拮抗菌NA-TXL-1能產生H2S、黑色素，能使牛奶凝固，但不能使明膠液化、淀粉水解，纖維素不分解；能夠利用葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖，但不能利用L-阿拉伯糖、D-甘露醇。而標準Streptomyces antibioticus能產生輕度明膠液化、淀粉水解不明顯，拮抗菌NA-TXL-1實驗中由于現象不明顯故判定為陰性。

表4 拮抗菌株NA-TXL-1的生理生化實驗Table 4 Physiological and biochemical characteristics of strain NA-TXL-1

2.2.3 16S rDNA鑒定

圖3 基于16S rDNA 序列構建的NA-TXL-1菌株系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 3 Phylogenetic tree of strain NA-TXL-1 based on 16S rDNA sequences

NA-TXL-1菌株經測序分析，16S rDNA序列長度為1 300 bp，測序結果提交GenBank注冊，登錄號為KX822009。在GenBank數據庫中進行BLAST同源性檢索，繪制系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3）。通過Maximum Parsimony系統(tǒng)分析，NA-TXL-1與S. antibioticus（NRRL B-1701）聚在一起，支持率為100%。綜合形態(tài)、生理生化特征及16S rDNA序列分析，將拮抗放線菌NA-TXL-1鑒定為抗生鏈霉菌（S. antibioticus）。

2.3 拮抗菌NA-TXL-1發(fā)酵條件優(yōu)化

2.3.1 不同種子培養(yǎng)基對NA-TXL-1發(fā)酵液抑菌活性的影響

圖4 不同種子培養(yǎng)基對菌株NA-TXL-1發(fā)酵液抑菌活性的影響Fig. 4 Effect of different seed media on inhibitory activity of submerged cultured NA-TXL-1

由圖4可知，拮抗菌NA-TXL-1以E為種子培養(yǎng)基時，菌體生長較好，對獼猴桃潰瘍病菌的抑制作用最顯著，抑菌圈為22.3 mm，較D高氏一號培養(yǎng)基提高了12.77%，差異極顯著；其次為種子培養(yǎng)基D、C，而以A、B、F為種子培養(yǎng)基時，抑菌效果最差，差異不顯著。因此，該菌株的最適種子培養(yǎng)基為E。

2.3.2 不同碳源、氮源、無機鹽對NA-TXL-1發(fā)酵液抑菌活性的影響

圖5 不同碳源（A）、氮源（B）對NA-TXL-1發(fā)酵液抑菌活性的影響Fig. 5 Effecst of different carbon and nitrogen sources on inhibitory activity of submerged cultured NA-TXL-1

以所選6 種碳源的培養(yǎng)基得到的NA-TXL-1菌株發(fā)酵原液對獼猴桃潰瘍病菌均有一定的抑菌活性，其中以乳糖為碳源的發(fā)酵液抑菌效果最好，抑菌圈大小均值為22.3 mm，大于高氏一號中可溶性淀粉的抑菌圈（20.3 mm），但差異不顯著；其次由高到低依次是甘油、麥芽糖、葡萄糖、蔗糖（圖5A）。因此，選用乳糖作為碳源。所選用的6 種氮源中，以酵母粉為氮源的發(fā)酵液具有最好的抑菌效果，抑菌圈為23.0 mm，其中酵母粉與牛肉浸汁的抑菌效果均優(yōu)于對照（KNO3），而硫酸銨抑菌活性較差，酵母粉與硝酸鉀差異極顯著（圖5B）。因此，選用酵母粉作為氮源。選用NaCl、KCl、MgCl2作為無機鹽，其抑菌圈直徑分別為20.0、16.7、17.3 mm，NaCl與其他處理差異顯著，因此選用NaCl作為無機鹽。

2.3.3 拮抗菌NA-TXL-1營養(yǎng)條件的優(yōu)化

表5 拮抗菌NA-TXL-1發(fā)酵培養(yǎng)基正交試驗及結果Table 5 Orthogonal array design with experimental results for optimization of culture medium for enhanced antagonistic activity of

表5 拮抗菌NA-TXL-1發(fā)酵培養(yǎng)基正交試驗及結果Table 5 Orthogonal array design with experimental results for optimization of culture medium for enhanced antagonistic activity of

試驗號A乳糖含量/（g/L）抑菌圈直徑/mm 12010.521.0±0.6 22021.019.7±0.3 32032.020.7±0.7 43011.022.3±0.3 53022.022.0±0.6 63030.521.7±0.3 74012.020.3±0.3 84020.521.0±0.6 94031.023.8±0.7 k120.46721.20021.233 k222.00020.90021.667 k321.43321.80021.000 R1.5330.9000.667 B酵母粉含量/（g/L）C NaCl含量/（g/L）

由表5可知，3 個因素對獼猴桃潰瘍病菌的抑菌圈影響大小為A乳糖含量＞B酵母粉含量＞C NaCl含量，最佳水平組合為A2B3C2。因此確定NA-TXL-1發(fā)酵培養(yǎng)基配方為乳糖 30 g/L、酵母粉 3 g/L、NaCl 1 g/L、K2HPO40.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、FeSO40.01 g/L。

2.3.4 培養(yǎng)條件的優(yōu)化

圖6 不同培養(yǎng)條件對菌株NA-TXL-1發(fā)酵濾液抑菌活性的影響Fig. 6 Effect of different culture conditions on inhibition activity of submerged cultured NA-TXL-1

選擇合適的接種量有利于菌體形成群體優(yōu)勢而縮短延遲期。由圖6A可知，當接種量在4%～10%，拮抗菌NA-TXL-1大量繁殖，但抑菌效果卻較差，抑菌圈直徑在4.3～10.3 mm之間，而按2%的接種量，其抑菌圈直徑最大，為20.8 mm，與其他處理差異極顯著。因此，選擇的最佳接種量為2%。

pH值會影響微生物對培養(yǎng)基中一些營養(yǎng)物質的吸收利用及代謝物的合成，本研究在確定發(fā)酵培養(yǎng)基配方的基礎上，通過單因素試驗對發(fā)酵pH值進行了優(yōu)化。從圖6B可以看出，當pH值為5、10，拮抗菌NA-TXL-1未生長繁殖，無抑菌效果，隨著pH值的升高，抑菌效果先升高后降低，在pH值為7時，抑菌效果最好，抑菌圈為24.0 mm，其次是pH值為8，抑菌圈為19.3 mm，說明NATXL-1適合在中性偏堿的環(huán)境中生長，其最適pH值為7。

合適的培養(yǎng)時間有助于獲得最佳的抑菌效果，確定發(fā)酵原液、上清液、重懸液最佳發(fā)酵時間。從圖6C可知，發(fā)酵原液、上清液、重懸液在不同培養(yǎng)時間抑菌效果有一定差異。隨著培養(yǎng)時間的延長，發(fā)酵原液、重懸液抑菌活性逐漸降低，上清液抑菌效果先增后降，其中培養(yǎng)5 d，菌體產生的抑菌活性成分較少，上清液抑菌效果不明顯，說明拮抗菌NA-TXL-1在5 d時主要是菌體本身產生抑菌作用；培養(yǎng)5 d，發(fā)酵原液、重懸液抑菌效果均最佳，分別為24.3、17.7 mm，與培養(yǎng)8 d差異不顯著；但在11～20 d，發(fā)酵原液、重懸液抑菌效果均逐漸降低，其中重懸液在20 d時無抑菌活性；而上清液在14 d抑菌圈最大，為16.0 mm，其中11、17 d抑菌效果差異不顯著。

2.4 拮抗菌株NA-TXL-1的盆栽實驗結果

表6 拮抗菌NA-TXL-1不同處理液的盆栽實驗Table 6 Effect of NA-TXL-1 in preventing and controlling Pseudomonas syringaepv.actinidiae in pot cultivated plants

由表6可知，拮抗菌NA-TXL-1采用預防法與治療法對獼猴桃潰瘍病的防控效果均較好。其中采用發(fā)酵原液噴霧防治效果最佳，預防法、治療法的防治效果分別為73.06%、55.62%，其次是重懸液，防治效果較差的是上清液，除了預防法中的發(fā)酵原液與重懸液差異不顯著，其他均達極顯著水平，說明拮抗菌NA-TXL-1菌體對獼猴桃潰瘍病的防控效果最好，代謝產物次之。

3 討 論

目前，采用生防菌對植物病害進行防治以其廣闊的應用前景而迅速發(fā)展為國內外的研究熱點。鏈霉菌（Streptomyces）是一種可產生多種抗生素、天然代謝產物、植物激素等活性物質的高等放線菌，對提高植物的抗病、抗逆性能具有重要作用，具有開發(fā)生物農藥的潛力[15-17]。目前已有學者分離到對植物病害取得良好防治效果的鏈霉菌。陸錚錚等[18]從煙草根圍土壤中篩選出3 株對煙草青枯病菌具有較好抑制效果的鏈霉菌。王飛等[19]分離出對香蕉枯萎病病原菌拮抗性能最好的諾爾斯氏鏈霉菌（S. noursei）8N-10。涂璇等[20]從植物內生放線菌中篩選出對供試12 種靶標真菌均具有較好的抑菌效果的淡紫灰鏈霉菌（S. lavendularectus）。本研究使用抗生鏈霉菌拮抗獼猴桃潰瘍病菌，報道抗生鏈霉菌拮抗植物病害，所獲得的菌株NA-TXL-1具有較高的殺菌活性，進一步驗證了鏈霉菌是植物病害生物防治的良好資源，具有較大的開發(fā)潛能。

鏈霉菌產生的抗菌活性物質多為次級代謝產物，其產量的高低不僅與菌種自身的性能相關，而且還要有最佳的發(fā)酵條件，因此，發(fā)酵條件的優(yōu)化對鏈霉菌產生目標代謝物必不可少[21]。本研究采用單因素和正交試驗進行NATXL-1菌株發(fā)酵條件的優(yōu)化，結果表明NA-TXL-1菌株最佳碳源、氮源、無機鹽分別為乳糖、酵母粉、無機鹽，初始pH 7、接種量2%時，發(fā)酵液的抑菌活性顯著提高。這與前人報道的淡紫灰鏈霉菌（S. lavendulae）[22]、極暗黃鏈霉菌（S. fulvissimus）[23]、加利利鏈霉菌（S. galilaeu）[24]產生拮抗物質的發(fā)酵條件有所不同，這說明同一菌屬的不同種類菌株產生拮抗活性物質的種類及代謝途徑有可能不同，從而導致培養(yǎng)條件的不同。此外，本研究對抗生鏈霉菌的發(fā)酵條件進行優(yōu)化，但尚未考慮交互作用和發(fā)酵成本，故后續(xù)將重點放在發(fā)酵培養(yǎng)基中各成分的利用情況與發(fā)酵液活性之間的關系及大規(guī)模的發(fā)酵條件進行研究。

鏈霉菌對植物病害的生防作用機制包括分泌抗菌物質、競爭營養(yǎng)和空間、直接寄生病原菌和誘導植物抗性等方面[25-28]。本研究篩選出的抗生鏈霉菌NA-TXL-1，其發(fā)酵原液、上清液、重懸液均對Psa有較好的抑制作用，在培養(yǎng)5～11 d時，發(fā)酵原液抑菌活性優(yōu)于上清液，而14～20 d，上清液抑菌活性卻高于發(fā)酵原液，分析其可能的原因主要有兩方面：第一，抗生鏈霉菌NA-TXL-1開始是直接寄生病原菌產生拮抗作用，而后是通過分泌的抗菌物質產生拮抗作用；第二，優(yōu)化后的發(fā)酵條件更有利于該菌產生抑菌物質，發(fā)酵時間適當延長，產生的抑菌活性物質增多。同時也說明生防作用機制可能不是單方面的，而是幾種方式共同作用的結果，而NA-TXL-1生防機制可能是菌株直接寄生病原菌和分泌抗菌物質共同作用。此外，本研究將對NA-TXL-1進行抗菌物質的分離純化與鑒定，并對活性物質的抗菌機理進行探索，以期為獼猴桃潰瘍病致病機理及田間防治研究提供理論支持。

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Screening, Identification and Optimization of Fermentation Conditions for Antagonistic Actinomycetes against Pseudomonas syringae pv. actinidiae

TIAN Xuelian1, YIN Xianhui1,*, LONG Youhua1, CAI Tao2, LI Hong1
(1. Instictute of Crop Protection, Guizhou University, Guiyang 550025, China; 2. Guizhou Provincial Supervision and Testing Center for Agricultural Product Quality Supervision, Guiyang 550004, China)

Aims: To isolate and screen the antagonistic strains with inhibitory activity against Pseudomonas syringae pv. actinidiae from a soil sample collected from the rhizosphere of kiwifruit in different areas and to optimize the fermentation conditions for enhanced production of antibacterial substances. Methods: Antagonistic strains were isolated by pour plate method, screened by inhibition zone method, and identified by morphological, physiological and biochemical characteristics and 16S rDNA sequence analysis. The optimal medium composition and fermentation conditions were optimized by onefactor-at-a-time and orthogonal array design methods. Results: A total of 288 actinomycetes strains were isolated, among which strain NA-TXL-1 exhibited the strongest inhibitory activity against Pseudomonas syringae pv. actinidiae. The effects of the fermentation broth in preventing and controlling Pseudomonas syringae pv. actinidiae in pot cultivated plants were 73.06% and 55.62%, respectively. Strain NA-TXL-1 was identified as Streptomyces antibioticus. The seed medium, inoculum size and initial pH value were optimized to be lactose-yeast power culture medium, 2%; and 7.0, respectively. The optimal culture medium consisted of 30 g/L lactose, 3 g/L yeast powder, 1 g/L NaCl, 0.5 g/L K2HPO4, 0.5 g/L MgSO4·7H2O, and 0.01 g/L FeSO4at initial pH of 7.0. The optimal culture times for harvesting fermentation broth, the supernatant, and resuspension were 5, 14, and 5 days, respectively. Conclusions: Strain NA-TXL-1 was identified as Streptomyces antibioticus, exhibiting stronger antagonistic effect under optimized fermentation conditions.

Pseudomonas syringae pv. actinidiae; antagonist; screening; identification; optimization of fermentation conditions

10.7506/spkx1002-6630-201716012

S476；Q939.9

A

1002-6630（2017）16-0079-07

2016-10-13

貴州省科技廳農業(yè)攻關資助項目（黔科合NY字（2009）3022）；貴陽市科技局農業(yè)科技攻關計劃資助項目（筑科農合合同字第（2009）2-007）

田雪蓮（1991—），女，碩士研究生，研究方向為有害生物綠色治理及農產品質量安全。E-mail：591358886@qq.com

*通信作者：尹顯慧（1978—），女，副教授，博士，研究方向為有害生物綠色治理及農產品質量安全。E-mail：agr.xhyin@gzu.edu.cn

田雪蓮, 尹顯慧, 龍友華, 等. 獼猴桃潰瘍病拮抗菌篩選、鑒定及發(fā)酵條件優(yōu)化[J]. 食品科學, 2017, 38(16): 79-85. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201716012. http://www.spkx.net.cn

TIAN Xuelian, YIN Xianhui, LONG Youhua, et al. Screening, identification and optimization of fermentation conditions for antagonistic actinomycetes against Pseudomonas syringae pv. actinidiae[J]. Food Science, 2017, 38(16): 79-85. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201716012. http://www.spkx.net.cn