黃欽耿，梁 玲，陳巧紅，吳松剛，黃建忠*

小菜蛾moricin在畢赤酵母中的表達(dá)及抑菌活性分析

黃欽耿，梁 玲，陳巧紅，吳松剛，黃建忠*

（福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，工業(yè)微生物教育部工程研究中心，福建 福州 350108）

抗生素的過(guò)度使用給自然生態(tài)帶來(lái)諸多不利影響，尋找合適的抗生素的替代物，從而減少抗生素的使用正成為當(dāng)下的研究熱點(diǎn)。以來(lái)自于小菜蛾的特異性抗菌肽moricin為研究對(duì)象，研究其酵母異源表達(dá)水平和抑菌性能及生化特性，為進(jìn)一步的開(kāi)發(fā)利用提供理論支持。根據(jù)已有的小菜蛾抗菌肽moricin特異性基因信息，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增其成熟肽基因mor-3，并克隆至pGAPZα A質(zhì)粒中，構(gòu)建組成型分泌表達(dá)載體pGAPZα A-mor3，線性化片段電轉(zhuǎn)化導(dǎo)入畢赤酵母SMD1168菌株，高質(zhì)量濃度Zeocin篩選獲得高拷貝重組轉(zhuǎn)化子。以yPD為培養(yǎng)基進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，重組蛋白獲得高效表達(dá)，分子質(zhì)量約為5 kD，與理論預(yù)測(cè)的基本一致；發(fā)酵60 h，上清液中重組蛋白表達(dá)量達(dá)248.98 mg/L，而且耐熱性能良好，同時(shí)具備較強(qiáng)的耐強(qiáng)酸及強(qiáng)堿的能力，特別在強(qiáng)酸環(huán)境中活性保持穩(wěn)定，體現(xiàn)了較好的機(jī)體內(nèi)環(huán)境的適應(yīng)性潛力；對(duì)部分革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌均具有抑菌作用，特別是對(duì)革蘭氏陰性菌具備特異性較強(qiáng)的抑制作用，對(duì)大腸桿菌的最低抑菌濃度為6.25 μg/mL，而對(duì)金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度僅為124.49 μg/mL。獨(dú)特的抑菌性能和理化特點(diǎn)，使其具備廣闊的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景及良好的社會(huì)與環(huán)保效益。

抗菌肽；moricin；畢赤酵母；高效表達(dá)；抑菌活性；生化特性

抗菌肽是一類(lèi)廣泛存在于生物體內(nèi)的天然免疫的重要介質(zhì)，是宿主防御系統(tǒng)的重要組成部分，在生物體遭受外界異物刺激或病原微生物感染時(shí)能夠快速產(chǎn)生的具有多種生物學(xué)活性的小分子多肽[1-2]。抗菌肽的來(lái)源非常廣泛，而且種類(lèi)繁多，功能多樣，自1962年Kiss等[3]首次從鈴蟾皮膚分泌物中分離出鈴蟾抗菌肽以來(lái)，短短幾十年中，在植物、微生物、昆蟲(chóng)、兩棲類(lèi)以及哺乳動(dòng)物等中已發(fā)現(xiàn)和鑒定抗菌肽一千多種，其中昆蟲(chóng)來(lái)源的抗菌肽已經(jīng)超過(guò)兩百種[4-8]?？咕膶?duì)于細(xì)菌、真菌、原蟲(chóng)、病毒等具有非特異性的抑制作用，能抑殺癌變細(xì)胞，而且可作為免疫效應(yīng)分子來(lái)啟動(dòng)、調(diào)節(jié)生物體的一系列免疫反應(yīng)[2,4,9-10]。另外，抗菌肽殺菌機(jī)制與傳統(tǒng)抗生素不同，多數(shù)抗菌肽通過(guò)細(xì)胞膜電荷的區(qū)別進(jìn)行選擇性殺傷，所以其對(duì)正常哺乳動(dòng)物細(xì)胞幾乎無(wú)毒性，而且由于細(xì)胞膜具有的高度保守性，故耐藥的產(chǎn)生尤其困難甚至幾乎不可能，被認(rèn)為是一類(lèi)天然的肽類(lèi)抗生素[11-13]。也正是由于抗菌肽獨(dú)特的抗菌機(jī)理、高效廣譜的抑菌活性以及綠色安全的特性，使其成為最具開(kāi)發(fā)前景的新型抗菌藥物[14-15]。隨著對(duì)抗菌肽作用機(jī)理及結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系研究的不斷深入，在抗生素廣泛及過(guò)度使用且已引起一系列不利情況的今天，抗菌肽越來(lái)越顯示出了其在藥物開(kāi)發(fā)、食品工業(yè)、植物抗病及飼料科學(xué)等領(lǐng)域的獨(dú)特應(yīng)用價(jià)值[8,16-18]，特別是在推行無(wú)抗養(yǎng)殖、保證食品健康的過(guò)程中，抗菌肽的應(yīng)用研究更是備受青睞。

由于天然抗菌肽的表達(dá)量低、提取過(guò)程復(fù)雜，導(dǎo)致難以大量獲得；而化學(xué)合成的成本高、價(jià)格昂貴，且對(duì)多數(shù)微生物宿主存在一定的毒性，這也導(dǎo)致抗菌肽的規(guī)?；a(chǎn)應(yīng)用一直受到制約。所以，選用合適宿主，利用基因工程手段進(jìn)行抗菌肽異源表達(dá)的研究一直備受關(guān)注[19]。而酵母由于其背景清晰、蛋白翻譯及后修飾功能完善以及便于培養(yǎng)等特點(diǎn)，使得其表達(dá)體系成為抗菌肽代謝工程研究中應(yīng)用最為廣泛和重要的表達(dá)體系之一[20-22]。

本實(shí)驗(yàn)以蛋白酶缺陷畢赤酵母（Pichia pastoris）菌株SMD1168為宿主，采用pGAPZα A質(zhì)粒為模板構(gòu)建真核表達(dá)載體，將特異性的小菜蛾抗菌肽moricin的成熟肽基因整合至畢赤酵母基因組中，利用GAP啟動(dòng)子及α-factor分泌信號(hào)肽進(jìn)行組成型分泌表達(dá)，以期獲得具有抗菌活性功能的重組蛋白，并對(duì)其相關(guān)抗菌性能及生化特性進(jìn)行研究，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)特異性抗生素替代物的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

大腸桿菌（Escherichia coli）TOP10F’、E. coli CMCC44103、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC25923，由工業(yè)微生物教育部工程研究中心保存。

P. pastoris SMD1168、表達(dá)載體pGAPZα A 美國(guó)Invitrogen公司；pMD19-T Simple vector 日本TaKaRa公司；含特異性小菜蛾抗菌肽moricin完整基因序列的重組質(zhì)粒pEASY-mor由福建農(nóng)林大學(xué)應(yīng)用生態(tài)研究所提供。

1.1.2 工具酶和試劑

pfu Taq DNA聚合酶、限制性?xún)?nèi)切酶AvrⅡ、EcoRⅠ、KpnⅠ、小牛腸堿性磷酸酶（calf intestine alkaline phosphatase，CIAP）、DNA ligation kit、DNA ladder Marker、預(yù)染低分子質(zhì)量蛋白Marker 日本TaKaRa公司；博來(lái)霉素（Zeocin，pGAPZα A載體自帶的選擇性標(biāo)記） 美國(guó)Sigma公司；質(zhì)粒小量提取試劑盒、膠回收試劑盒、Tricine、N,N,N′,N′-四甲基乙二胺、丙烯酰胺、N,N’-亞甲基雙丙烯酰胺、胰蛋白胨、酵母粉 生工生物工程（上海）股份有限公司；Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒 上海美季生物技術(shù)有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

moricin成熟肽基因聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）上下游引物均帶有酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基，而且上游引物中融合起始密碼子ATG，具體如下：

mor3-F：5’-CGGAATTCCGGCGCCCAAGGTCAAC GTC-3’（劃線部分為EcoRⅠ酶切位點(diǎn)）

mor3-R：5’-GGGGTACCCCCTACCCCTGGTTCCT-3’（劃線部分為KpnⅠ酶切位點(diǎn)）

同時(shí)，合成一對(duì)驗(yàn)證引物：Alpha-F：5’-TACTATTGCCAGCATTGCTGC-3’AOX1-R：5’-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3’1.1.4 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g、酵母粉5 g、NaCl 10 g，調(diào)pH值至7.0，蒸餾水定容至1 000 mL，固體培養(yǎng)基在此基礎(chǔ)上添加20 g瓊脂，121 ℃滅菌20 min。

LLB培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基NaCl添加量減半，調(diào)pH值至7.5。

YPD培養(yǎng)基：酵母粉10 g、蛋白胨20 g、葡萄糖20 g，pH值自然，蒸餾水定容至1 000 mL，固體培養(yǎng)基在此基礎(chǔ)上添加20 g瓊脂，121 ℃滅菌20 min。

YPDS培養(yǎng)基：酵母粉10 g、蛋白胨20 g、葡萄糖20 g、1 mol/L山梨醇，pH值自然，蒸餾水定容至1 000 mL，固體培養(yǎng)基在此基礎(chǔ)上添加20 g瓊脂，121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

PCR儀 美國(guó)Applied Biosystems公司；電轉(zhuǎn)化儀、光密度掃描儀 美國(guó)Bio-Rad公司；自動(dòng)凝膠圖像分析儀 上海培清科技有限公司；離心機(jī) 長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；核酸及蛋白電泳儀 北京市六一儀器廠；恒溫培養(yǎng)箱、電熱恒溫水槽 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；恒溫?fù)u床 上海智城分析儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 特異性抗菌肽moricin3成熟肽基因mor-3的擴(kuò)增及純化

采用mor3-F/R為引物對(duì)，以pEASy-mor質(zhì)粒為模板，采用pfu Taq DNA聚合酶按如下體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增：10×pfu Buffer 5 μL、mor3-F與mor3-R各2 μL、模板0.5 μL（約50 ng）、酶1 μL，加ddH2O補(bǔ)至50 μL。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性40 s，57 ℃退火40 s，72 ℃延伸25 s，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃條件下保存。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并將其目的條帶割膠回收、純化并進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

1.3.2 重組表達(dá)載體pGAPZα A-mor3的構(gòu)建

對(duì)PCR回收產(chǎn)物及抽提的pGAPZα A空載體分別進(jìn)行EcoRⅠ與KpnⅠ雙酶切，分別回收酶切的目的基因及載體片段，然后進(jìn)行T4 DNA連接酶連接并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coli TOP10F’感受態(tài)細(xì)胞，采用LLB（含50 μg/mL Zeocin）平板進(jìn)行抗性篩選，并用驗(yàn)證引物進(jìn)行菌液PCR陽(yáng)性重組子鑒定，送交上海生工測(cè)序驗(yàn)證。

1.3.3 重組表達(dá)載體pGAPZα A-mor3轉(zhuǎn)化畢赤酵母SMD1168

將獲得的重組載體用AvrⅡ線性化并進(jìn)行回收后，取20 μL線性化的載體與80 μL的畢赤酵母SMD1168感受態(tài)細(xì)胞混合，冰中放置30 min后，電轉(zhuǎn)儀（電壓2 000 V、電容25 μF）電擊轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞。將轉(zhuǎn)化后的SMD1168細(xì)胞涂布含100 μg/mL Zeocin的YPDS平板，30 ℃條件下倒置培養(yǎng)至單菌落出現(xiàn)。單克隆出現(xiàn)后，采用煮沸-凍融法進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，篩選陽(yáng)性克隆轉(zhuǎn)化子。同時(shí)，采用含100～300 μg/mL的Zeocin的YPDS平板進(jìn)行mor-3基因多拷貝整合的篩選，用于獲得高效表達(dá)特異性抗菌肽moricin3的重組菌株。

1.3.4 重組菌目的蛋白的組成型表達(dá)

挑取抗高質(zhì)量濃度Zeocin的克隆，于裝有30 mL YPD液體培養(yǎng)基中進(jìn)行種子培養(yǎng)，至OD600nm為3～4時(shí)，按20%移種量（10 mL種子液轉(zhuǎn)接于40 mL YPD培養(yǎng)基中）轉(zhuǎn)接，30 ℃、220 r/min培養(yǎng)60 h，收集上清液。采用Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定上清液中的總蛋白濃度。采用光密度掃描儀掃描十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）膠中目的條帶所占總蛋白百分比，計(jì)算上清液中重組蛋白的表達(dá)量。采用Tricine-SDS-PAGE（16.5%分離膠、10%成層膠、4%積層膠）分析產(chǎn)物分泌表達(dá)情況。

1.3.5 重組菌發(fā)酵上清液的抗菌活性分析及最低抑菌濃度的測(cè)定

采用改良的瓊脂孔穴擴(kuò)散法[23]進(jìn)行抗菌活性的分析。分別接種S. aureus ATCC25923和E. coli CMCC44103的斜面，并制備菌懸液，其OD600nm為10；然后，取0.4 mL菌懸液至70 mL、50 ℃左右的LB固體培養(yǎng)基內(nèi)，迅速混勻后，倒入21 cm×14 cm×0.3 cm的玻璃平板的長(zhǎng)方體槽內(nèi)，靜置冷卻至完全凝固，放入白瓷盒內(nèi)。用滅菌的打孔器（直徑8 mm）打孔，每孔加入20 μL重組菌發(fā)酵表達(dá)上清液，同時(shí)加入等體積的pGAPZα A空載體轉(zhuǎn)化的SMD1168細(xì)胞表達(dá)上清液和原始SMD1168細(xì)胞表達(dá)上清液為陰性對(duì)照，加入5 μL 100 mg/mL Amp為陽(yáng)性對(duì)照，加樣后，小心地將白瓷盒移入4 ℃冰箱放置2 h。將含有待測(cè)樣品的玻璃平板轉(zhuǎn)移至37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，24 h后，觀察并測(cè)量抑菌圈直徑。采用管碟法測(cè)定重組菌表達(dá)上清液的最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）[24]。

1.3.6 重組菌發(fā)酵上清液的溫度及酸堿敏感性分析

溫度耐受性分析：將重組菌發(fā)酵上清液分別沸水浴處理10、20、30 min，以未處理為對(duì)照組，分別檢測(cè)不同處理樣品對(duì)E. coli CMCC44103抑菌活性。

酸堿敏感性分析：取相同體積的重組菌發(fā)酵上清液分別用1 mol/L的HCl或NaOH溶液處理10、20、30 min，作用結(jié)束后，分別用等體積1 mol/L的NaOH或HCl溶液進(jìn)行中和，以未經(jīng)處理的重組菌上清液為對(duì)照，測(cè)定不同處理方式、不同處理時(shí)間的樣品對(duì)E. coli CMCC44103的抑菌活性影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 成熟肽基因mor-3的克隆及鑒定

圖1 成熟肽mor-3基因的PCR擴(kuò)增Fig. 1 PCR Amplification of mor-3 gene

以pEASY-mor質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增成熟肽基因mor-3，產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)，獲得大小約為100 bp的單一條帶，與預(yù)測(cè)的條帶大小（129 bp）基本一致（圖1）。PCR產(chǎn)物的測(cè)序結(jié)果顯示，成熟肽基因總長(zhǎng)度129 bp（含終止密碼子），可編碼42 個(gè)氨基酸與從小菜蛾基因組中克隆的另外2 個(gè)moricin的成熟肽基因存在3 個(gè)氨基酸的突變，分別位于成熟肽的第10位（R10K）、14位（R14H）、17位（R17K），其與pEASY-mor完整基因的成熟肽序列完全一致，說(shuō)明抗菌肽moricin3的成熟肽基因（mor-3）克隆成功。

2.2 表達(dá)載體pGAPZα A-mor3的構(gòu)建與鑒定

圖2 重組載體的菌落PCR驗(yàn)證Fig. 2 Identification of recombinant plasmids by colony PCR

圖3 表達(dá)載體pGAPZαA-mor3的酶切鑒定Fig. 3 Identification of pGAPZ α A-mor3 by restriction enzyme digestion

分別回收EcoRⅠ與KpnⅠ雙酶切的mor-3基因片段與空載體pGAPZα A，連接轉(zhuǎn)化后，對(duì)抗性平板獲得的單克隆以Alpha-F/AOX1-R為引物對(duì)進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，同時(shí)以空載體pGAPZα A轉(zhuǎn)化的大腸桿菌為陰性對(duì)照（理論大小約為265 bp），陽(yáng)性克隆大小約為400 bp，與理論預(yù)測(cè)大?。?94 bp）基本一致（圖2）。挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行質(zhì)粒抽提，并進(jìn)行EcoRⅠ單酶切及EcoRⅠ與KpnⅠ雙酶切的驗(yàn)證，同時(shí)，以pGAPZα A質(zhì)粒為陰性對(duì)照進(jìn)行同樣的酶切，電泳結(jié)果顯示：陽(yáng)性克隆雙切出現(xiàn)大小分別為129 bp與3 100 bp的條帶，單酶切出現(xiàn)約為3 200 bp單一條帶，而pGAPZα A質(zhì)粒單酶切和雙酶切均只有一條帶。結(jié)果說(shuō)明，重組表達(dá)載體pGAPZα A-mor3構(gòu)建成功（圖3）。

2.3 重組菌酵母組成型表達(dá)及重組蛋白表達(dá)量的確定

圖4 重組菌上清液的Tricine-SDS-PAGE分析Fig. 4 Analysis of culture supernatant of recombinant P. pastoris by Tricine-SDS-PAGE

參考Tricine-SDS-PAGE說(shuō)明書(shū)，重組菌的發(fā)酵上清液得到較好的分離，結(jié)果顯示，在重組菌上清液中分子質(zhì)量約為5.0 kD的蛋白獲得表達(dá)，而且其與預(yù)測(cè)的抗菌肽蛋白分子質(zhì)量（4.7 kD）基本一致，原始SMD1168菌株及線性化空載體pGAPZα A轉(zhuǎn)化的SMD1168菌株在相應(yīng)位置均無(wú)明顯亮帶。表明重組蛋白在畢赤酵母SMD1168成功獲得表達(dá)（圖4），以牛血清白蛋白質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，OD595nm為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y＝0.020 4x+0.314 9（R2為0.996 7）。發(fā)酵60 h上清液樣品，稀釋20 倍，測(cè)得OD595nm為0.953，經(jīng)光密度掃描儀掃描目的蛋白占總蛋白的比例為39.8%，計(jì)算得到重組moricin3蛋白的表達(dá)量為248.98 mg/L。

2.4 重組蛋白的抑菌活性分析及最低抑菌濃度測(cè)定

圖5 重組菌上清液對(duì)E. coli CMCC44103（a）及S. aureus ATCC25923（b）的抑菌活性檢測(cè)Fig. 5 Antibacterial activity of culture supernatant of recombinant P. pastoris against E. coli (a) and S. aureus (b)

采用改良瓊脂擴(kuò)散法進(jìn)行抑菌活性的檢測(cè)，圖5結(jié)果顯示：重組菌表達(dá)的moricin3抗菌肽對(duì)革蘭氏陰性菌——E. coli CMCC44103體現(xiàn)了非常好的抑菌活性，能夠形成較大的、清晰明確的抑菌圈，發(fā)酵60 h，上清液抑菌圈直徑最大，達(dá)到19.3 mm（圖5a中5號(hào)孔）；而對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌——S. aureus ATCC25923抑菌活性則較差，抑菌圈較小，而且抑菌圈邊緣模糊，最大抑菌圈直徑也為發(fā)酵60 h后的上清液，僅為5.3 mm（圖5b中5號(hào)孔）。

采用管碟法測(cè)定重組菌上清液表達(dá)的抗菌肽moricin3對(duì)E. coli CMCC44103和S. aureus ATCC25923的MIC值。結(jié)果顯示：抗菌肽moricin3對(duì)E. coli CMCC44103的MIC值為6.25 μg/mL，體現(xiàn)了較強(qiáng)的抑菌效果；抗菌肽moricin3對(duì)S. aureus ATCC25923的MIC值為124.49 μg/mL。

2.5 重組菌上清液中表達(dá)的抗菌肽moricin3對(duì)溫度及酸堿的耐受特性分析

表1 高溫及酸堿對(duì)重組菌發(fā)酵上清液抑菌活性的影響Table 1 Effects of high temperature and acid-base on antibacterial activity of culture supernatant of recombinant strain

將重組菌表達(dá)上清液分別沸水浴和1 mol/L的HCl及NaOH溶液處理10、20、30 min，同時(shí)，以未處理的重組菌發(fā)酵上清液為陽(yáng)性對(duì)照，采用改良的瓊脂擴(kuò)散法測(cè)定處理樣品對(duì)E. coli CMCC44103的抑菌圈直徑。結(jié)果顯示：沸水浴處理對(duì)重組菌發(fā)酵上清液對(duì)E. coli CMCC44103的敏感性影響不大，抑菌圈直徑無(wú)明顯差別，表明重組菌上清液中表達(dá)的moricin3具有一定的耐高溫性能，體現(xiàn)了較好的熱穩(wěn)定性。另外，1 mol/L HCl處理10、20、30 min對(duì)重組菌發(fā)酵上清液的抑菌活性基本沒(méi)有影響，處理30 min，活性仍保持95%以上（表1），說(shuō)明抗菌肽moricin3具有較好的耐酸能力，而且在酸性環(huán)境中較為穩(wěn)定；不同的是，同樣濃度的NaOH溶液處理10 min，moricin3的抑菌活性仍能保持近95%，達(dá)到94.8%，但當(dāng)處理時(shí)間延長(zhǎng)，其抑菌活性顯著下降，處理20 min，抑菌圈直徑減少2.6 mm，抑菌活性降低至86.5%，處理時(shí)間達(dá)到30 min，抑菌圈直徑減少6.1 mm，抑菌活性大幅度降低，僅為未處理對(duì)照的68.4%（表1），說(shuō)明重組菌上清液中的moricin3雖具備一定的耐受強(qiáng)堿性能，但在強(qiáng)堿性環(huán)境中的抑菌活性隨處理時(shí)間呈明顯下降趨勢(shì)，說(shuō)明在堿性環(huán)境中穩(wěn)定性較差。

3 討 論

一般生物體自然條件表達(dá)和分泌的抗菌肽的含量非常低，直接從體內(nèi)獲得天然抗菌肽的成本非常高昂，而且過(guò)程繁瑣?；瘜W(xué)合成的技術(shù)難度大，而且活性往往得不到保證。利用基因工程技術(shù)，采用細(xì)菌或酵母生產(chǎn)抗菌肽就體現(xiàn)了具大的優(yōu)勢(shì)，特別是酵母表達(dá)體系，其遺傳背景清晰，便于利用基因工程手段對(duì)進(jìn)行理性化的改造獲得更具特性的抗菌肽產(chǎn)品，而且發(fā)酵條件簡(jiǎn)單，適合高密度發(fā)酵，非常適合工業(yè)化的生產(chǎn)、純化或是制備含有獨(dú)特抗菌機(jī)制抗菌肽的飼用酵母微生態(tài)制劑。moricin為強(qiáng)堿性抗菌肽，由42 個(gè)氨基酸組成，是一種雙親性α-螺旋結(jié)構(gòu)的線性多肽，具有廣譜的抗菌活性，最早由Hara和yamakawa于1995年在家蠶中發(fā)現(xiàn)[25]，如今，moricin已經(jīng)從其他多個(gè)鱗翅目昆蟲(chóng)中被發(fā)現(xiàn)[26-27]。在鱗翅目昆蟲(chóng)中，家蠶的天然免疫系統(tǒng)是研究最清楚的[28-30]，在抗菌肽moricin方面也有比較多的報(bào)道，同樣為鱗翅目昆蟲(chóng)，關(guān)于小菜蛾抗菌肽，特別是moricin抗菌肽的研究報(bào)道卻比較少。

本研究在前期相關(guān)基因鑒定的基礎(chǔ)上[27,31]，從小菜蛾基因組中克隆到一個(gè)具有廣譜抗菌活性的moricin家族抗菌肽moricin-3基因，其較從小菜蛾基因組中獲得的此家族的另外兩個(gè)抗菌肽moricin-1與moricin-2基因相比，其成熟肽基因有3 個(gè)氨基酸的突變，這些氨基酸差異直接導(dǎo)致了其在凈電荷、等電點(diǎn)及疏水性等理化性質(zhì)的不同，而這可能對(duì)其抗菌譜及抑菌性能都有影響。

抗菌肽分子作為一類(lèi)多肽，宿主本身具備的蛋白酶對(duì)其表達(dá)量及穩(wěn)定性都有較大影響[32-33]，鑒于此，本研究采用蛋白酶缺陷型酵母SMD1168為宿主，以非誘導(dǎo)型分泌質(zhì)粒pGAPZα A為載體，將moricin3成熟肽整合至宿主染色體中，并通過(guò)高質(zhì)量濃度Zeocin（300 μg/mL）抗性篩選高拷貝重組菌，實(shí)現(xiàn)了目的基因的高效分泌表達(dá)，重組菌發(fā)酵上清液中表達(dá)量達(dá)248.98 mg/L。采用改良的瓊脂擴(kuò)散法，對(duì)重組菌發(fā)酵上清液進(jìn)行了抑菌活性檢測(cè)，對(duì)E. coli與S. aureus都有抑菌活性，實(shí)驗(yàn)室條件限制，未能進(jìn)行更廣泛的檢菌測(cè)定，但其仍表現(xiàn)了較為廣譜的抗菌潛力，特別是對(duì)于革蘭氏陰性菌，其對(duì)E. coli的MIC值是對(duì)革蘭氏陽(yáng)性的金黃色葡萄球菌的近二十分之一。不僅如此，重組菌表達(dá)的小菜蛾抗菌肽moricin3具備非常好的熱穩(wěn)定性及酸性環(huán)境中的穩(wěn)定性，這不僅對(duì)小菜蛾抗菌肽moricin3后續(xù)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、抗菌機(jī)理及小菜蛾自身免疫機(jī)制等研究具有重要意義，也使得其非常具有開(kāi)發(fā)成為一類(lèi)主抗革蘭氏陰性菌抗菌藥物或酵母制劑的潛力。特別在開(kāi)發(fā)抗菌肽酵母制劑方面，較好的熱穩(wěn)定性使得其能耐受飼料制粒時(shí)的高溫，而且在規(guī)?；a(chǎn)、高溫濃縮的時(shí)候保持抗菌肽活性而不造成工程菌的擴(kuò)散導(dǎo)致環(huán)境生態(tài)問(wèn)題；本身具備的獨(dú)特抑菌及選擇性殺傷機(jī)制，病原菌不易甚至不可能產(chǎn)生耐藥性；良好的酸性環(huán)境中的穩(wěn)定性，使其具備更好的機(jī)體內(nèi)環(huán)境的適應(yīng)性。moricin3抗菌肽具備的高效、獨(dú)特的分子特性、綠色安全、不易產(chǎn)生耐藥性的特點(diǎn)使得其可成為抗生素的替代物之一，從而能夠減少抗生素和化學(xué)藥物的使用及殘留，減少對(duì)自然生態(tài)的危害，為人們提供健康食品的同時(shí)促進(jìn)可持續(xù)發(fā)展，具備良好的社會(huì)效益及環(huán)境效益。

4 結(jié) 論

本研究利用組成型分泌表達(dá)策略在蛋白酶缺陷型畢赤酵母SMD1168中成功表達(dá)了小菜蛾特異性抗菌肽moricin，利用抗性梯度篩選方法獲得高拷貝的重組菌，并實(shí)現(xiàn)了外源抗菌肽基因在畢赤酵母宿主中的高效表達(dá)，同時(shí)，對(duì)表達(dá)的抗菌肽的抑菌活性及耐酸堿和熱穩(wěn)定性進(jìn)行相關(guān)研究，得到如下結(jié)論：1）以載體pGAPZα A為基礎(chǔ)，通過(guò)PCR、酶切、連接等技術(shù)手段，成功構(gòu)建含有小菜蛾特異性抗菌肽成熟肽基因mor-3的組成型表達(dá)載體pGAPZα A-mor3；2）以蛋白酶缺陷型畢赤酵母SMD1168為宿主，成功將mor-3基因整合至宿主染色體上，結(jié)合高質(zhì)量濃度的Zeocin（300 μg/mL）獲得mor-3基因多拷貝整合的工程菌株，并實(shí)現(xiàn)高效分泌表達(dá)，搖瓶發(fā)酵上清液抗菌肽moricin3表達(dá)量達(dá)248.98 mg/L；3）抑菌活性實(shí)驗(yàn)表明，重組菌表達(dá)上清液中的抗菌肽moricin3可能對(duì)革蘭氏陰性和革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌都有抑菌活性，其中對(duì)E. coli CMCC44103和S. aureus ATCC25923的MIC分別達(dá)到6.25 μg/mL和124.49 μg/mL，顯示了對(duì)革蘭氏陰性菌有特異性較強(qiáng)的抑菌活性的潛力；4）重組菌上清液中表達(dá)的抗菌肽moricin3具有較好的熱穩(wěn)定性，沸水浴30 min，抑菌活性保持99%，體現(xiàn)了較好的耐高溫性能；5）重組菌上清液中表達(dá)的抗菌肽moricin3具備較好的耐酸堿性能，而且在酸性環(huán)境中較為穩(wěn)定，1 mol/L的HCl溶液處理30 min，活性仍保持95%以上；但在堿性環(huán)境中穩(wěn)定性較差，在強(qiáng)堿性環(huán)境中的抑菌活性隨處理時(shí)間呈明顯下降趨勢(shì)，1 mol/L的NaOH溶液處理30 min，抑菌活性?xún)H為對(duì)照的68.4%，良好的酸性環(huán)境中的穩(wěn)定性，使其具備更好的機(jī)體內(nèi)環(huán)境適應(yīng)性潛力。

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High-Level Expression and Antibacterial Properties of Antimicrobial Peptide Moricin in Pichia pastoris

HUANG Qingeng, LIANG Ling, CHEN Qiaohong, WU Songgang, HUANG Jianzhong*
(Engineering Research Center of Industrial Microbiology, Ministry of Education, College of Life Science, Fujian Normal University, Fuzhou 350108, China)

The excessive use of antibiotics has brought about many adverse effects to natural ecology. Finding suitable alternatives to antibiotics to reduce the use of antibiotics is becoming a research hotspot. The aim of this study was to highly express the antimicrobial peptide moricin derived from the diamondback moth Plutella xylostella in Pichia pastoris, and study its antibacterial properties and biochemical properties. The mature peptide gene mor-3 of moricin from Plutella xylostella (L.) was amplified by PCR, and then cloned into the pGAPZα A vector, and an expression plasmid of pGAPZα A-mor3 was constructed. The linearized plasmid pGAPZα A-mor3 was transformed into P. pastoris SMD1168 by electroporation, and the high copy recombinant transformants were screened out by using high concentration of Zeocin. The molecular mass of the recombinant protein expressed in P. pastoris SMD1168 was approximately 5 kD, corresponding to the theoretical molecular mass of this target peptide. Up to 248.98 mg/L recombinant protein in the supernatant after 60 h fermentation was obtained. The recombinant protein in the supernatant showed obvious antibacterial activity against several microorganisms detected by an improved agar diffusion method, including Escherichia coli and Staphylococcus aureus. The minimum inhibitory concentration (MIC) against E. coli CMCC44103 was 6.25 μg/mL, while that against S. aureus ATCC25923 was only 124.49 μg/mL. It showed potent antibacterial activity against both Gram-positive and Gramnegative bacteria, especially Gram-negative bacteria. In addition, the recombinant protein also had good thermal stability, and strong resistance to acid and alkali. In particular, the antimicrobial activity was maintained in an acidic environment, and so it had good adaptability to the animal intestinal environment. Due to these unique antibacterial properties and biochemical characteristics it has a broad development and application prospect with good social and environmental benefits.

10.7506/spkx1002-6630-201716006

Q812

A

1002-6630（2017）16-0036-07

2016-10-20

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863計(jì)劃）項(xiàng)目（2015AA021005）

黃欽耿（1984—），男，高級(jí)工程師，博士研究生，研究方向?yàn)槲⑸锷笆称肺⑸锕こ?。E-mail：quenyhuang@163.com *通信作者：黃建忠（1966—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槲⑸锕こ碳捌涔こ袒?。E-mail：hjz@fjnu.edu.cn

黃欽耿, 梁玲, 陳巧紅, 等. 小菜蛾moricin在畢赤酵母中的表達(dá)及抑菌活性分析[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(16): 36-42. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201716006. http://www.spkx.net.cn

HUANG Qingeng, LIANG Ling, CHEN Qiaohong, et al. High-level expression and antibacterial properties of antimicrobial peptide moricin in Pichia pastoris[J]. Food Science, 2017, 38(16): 36-42. (in Chinese with English abstract)

10.7506/ spkx1002-6630-201716006. http://www.spkx.net.cn

Key words: antimicrobial peptides; moricin; Pichia pastoris; efficient expression; antimicrobial activity; biochemical characteristics