褚 靖，汪勁松，張新潮，王衛(wèi)東，潘繼承

(湖北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 黃石 435002)

楊梅素對精氨酸激酶結(jié)構(gòu)與功能的影響

褚 靖，汪勁松，張新潮，王衛(wèi)東，潘繼承

(湖北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 黃石 435002)

精氨酸激酶(arginine kinase，AK)是無脊椎動物能量代謝關(guān)鍵酶，楊梅素是一種黃酮類物質(zhì)，具有多種生物活性。本文研究的是楊梅素對AK結(jié)構(gòu)和功能的影響，采用AK活性分析、熒光光譜、圓二色光譜等技術(shù)研究楊梅素對精氨酸激酶結(jié)構(gòu)與功能影響。研究結(jié)果表明：楊梅素可以有效地抑制AK活性，并導(dǎo)致AK二級結(jié)構(gòu)和構(gòu)象發(fā)生明顯變化。為設(shè)計開發(fā)生物殺蟲劑提供了理論依據(jù)。

楊梅素； AK ； 抑制劑 ； 結(jié)構(gòu)； 功能

精氨酸激酶 (Arginine Kinase，AK) 是無脊椎動物體內(nèi)參與細(xì)胞能量代謝的一種磷酸原激酶，是磷酸原激酶家族中的重要一員。 通過催化可逆性的反應(yīng)

在ATP和精氨酸之間運輸高能磷酸鍵，以此來調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)ATP的水平[1-3]。反應(yīng)產(chǎn)生的ADP可以作為合成ATP的前體物質(zhì)，磷酸精氨酸可以作為合成ATP的高能磷酸鍵供體，通過這個可逆反應(yīng)來維持體內(nèi)ATP的穩(wěn)態(tài)[4-6]。AK是節(jié)肢動物體內(nèi)唯一的磷酸原激酶，在昆蟲肌肉劇烈運動時，磷酸精氨酸是唯一能在合成ATP時提供磷?；墓w。當(dāng)昆蟲劇烈運動時，可以提供大量能量，且能維持ATP的恒定水平[4，7-9]，當(dāng)昆蟲靜止時，磷酸精氨酸又可以作為能量緩存庫[10]。綜上所述，AK是無脊椎動物能量代謝的關(guān)鍵性酶，它控制了無脊椎動物的整個生命活動的能量系統(tǒng)，維持無脊椎動物體內(nèi)的能量動態(tài)平衡，AK的活性對無脊椎動物的生命活動至關(guān)重要。抑制AK的活性，能有效抑制無脊椎動物的能量代謝，使無脊椎動物的能量代謝過程發(fā)生紊亂，最終導(dǎo)致無脊椎動物的死亡。黃酮類物質(zhì)是一種廣泛分布在植物界的多酚類物質(zhì)，是柑橘類水果和其他食物的主要成分，在許多國家作為健康飲食[10]。黃酮類物質(zhì)具有多種生物學(xué)功能，包括抗癌癥，防癌癥，抗骨質(zhì)疏松，降血脂，降血壓，有益于心腦血管等功能。本文報道的是黃酮類物質(zhì)楊梅素對精氨酸激酶結(jié)構(gòu)與功能的影響，以期為開發(fā)新型生物殺蟲劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

含有AK基因大腸桿菌Rosseta，由本實驗室構(gòu)建并保存；LB培養(yǎng)基( 1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、1%NaCl，pH7.0)；IPTG ( 異丙基硫代-β-D-半乳糖苷) 購自Sigma公司，瓊脂糖親和柱(Ni)購自Novagen公司，其它所用試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 實驗儀器

Ultrospec 4300 pro型紫外分光光度計(Amersham bioscience)，熒光分光光度計F4500，圓二色光譜儀J-810，AKTA Purifier層析儀，高壓滅菌鍋(型號ZDX-35，上海申安醫(yī)療器械廠)

1.3 實驗方法

AK的制備：取本實驗室已構(gòu)建成功的含有pET-21b-AK的E.coli BL21甘油菌20 μL接種于6 mL的LB試管培養(yǎng)基(已加入氨芐，工作濃度為100 μg/mL)，置于37 ℃搖床，恒溫培養(yǎng)12 h；向大體積LB培養(yǎng)基中加入0.5%已活化好的菌液，置于37 ℃搖床，恒溫培養(yǎng)2-3 h；擴(kuò)大培養(yǎng)至菌液OD值在0.6～0.8之間時，向菌液中加入IPTG使其工作濃度為0.2 mM，置于20 ℃搖床，恒溫培養(yǎng)12 h；將誘導(dǎo)后的菌液離心(5000 rmp，10 min)收集細(xì)胞沉淀，以蒸餾水洗沉淀一次；將細(xì)胞沉淀重懸于細(xì)胞裂解液中，于冰浴中超聲破壁，于4 ℃，離心(12000 rpm，10 min)，取上清，即為粗蛋白提取液；采用His-tag/Ni親和層析方法純化，SDS-PAGE分析。

圓二色光譜分析：終濃度為22 μM的AK與不同濃度的黃酮類化合物混勻，于37 ℃恒溫水浴30 min，測定圓二色光譜。

熒光光譜分析：終濃度為22 μM的AK與不同濃度的黃酮類化合物混勻，于37 ℃恒溫水浴30 min，激發(fā)波長295 nm, 掃面波長范圍300-400 nm, 測定其內(nèi)源熒光。ANS熒光檢測：向上述體系中各加入1～3 μL ANS(蛋白濃度約為ANS濃度的25倍)，避光反應(yīng)30 min, 參數(shù)設(shè)定為激發(fā)波長380 nm, 掃描波長范圍400～600 nm,測定ANS熒光光譜。

AK活性分析：將黃酮類化合物與AK混勻，置于30℃水浴10 min，參照文獻(xiàn)[11]測定AK活性。

2 研究結(jié)果

2.1 AK活性分析

圖1 黃酮類化合物與AK反應(yīng)后測活曲線

由圖1可以分析出楊梅素抑制AK活力的能力最強(qiáng)，其次是黃芩苷，槲皮素，山奈酚，小檗堿，而甘草酸二鉀并沒有表現(xiàn)出抑制AK活力的效果。

2.2 內(nèi)源熒光圖譜

圖2 楊梅素與AK作用的內(nèi)源熒光圖

由圖2可以看出，隨著楊梅素濃度的增加，內(nèi)源熒光強(qiáng)度下降，表明楊梅素導(dǎo)致AK色氨酸殘基(Trp)微環(huán)境改變。

2.3 ANS熒光圖譜

圖3 不同濃度的楊梅素對AK的ANS熒光發(fā)射強(qiáng)度的影響

由圖3可以看出，AK與不同濃度楊梅素反應(yīng)之后，其外源熒光峰強(qiáng)逐漸減弱，并且呈濃度依耐性，隨著楊梅素濃度的增加，峰強(qiáng)越來越小，這說明AK與楊梅素作用之后其表面的疏水性減弱。

2.4 圓二色光譜

圖4 楊梅素AK與作用的圓二色光譜

由圖4可以看到，加入楊梅素與AK作用之后，AK在215nm、222nm處的負(fù)橢圓度消失，AK的α螺旋、β折疊都有明顯減少，表明楊梅素對AK的二級結(jié)構(gòu)有明顯影響。

3 討論

上述研究結(jié)果表明，楊梅素、黃芩苷、槲皮素、山奈酚、小檗堿等化合物對精氨酸激酶都表現(xiàn)出不同程度的抑制能力，其中楊梅素展現(xiàn)出的抑制AK的能力最強(qiáng)，進(jìn)一步的研究結(jié)果表明，2×10-4M楊梅素對AK活性的抑制率可以達(dá)到70%。圓二色和熒光光譜研究結(jié)果表明，楊梅素可以導(dǎo)致AK二級結(jié)構(gòu)及其構(gòu)象發(fā)生顯著改變。上述研究結(jié)果為設(shè)計新型殺蟲劑提供了一定的理論依據(jù)。

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(本文文獻(xiàn)格式：褚 靖，汪勁松，張新潮，等.楊梅素對精氨酸激酶結(jié)構(gòu)與功能的影響[J].山東化工，2017，46(04)：39-40，45.)

The Effects of Myricetin on Arginine Kinase's Structure and Function

ChuJing,WangJinsong,ZhangXinchao,WangWeidong,PanJicheng

(College of Life, Hubei Normal University, Huangshi 435002, China)

Arginine Kinase (AK) plays the key role in invertebrate energy metabolism. Myricetin is a kind of flavonoids compounds, with multiple biological activities. This paper focused on the effects of myricetin on AK's structure and function by the means of activity assay, fluorescence and circular dichroism spectrum. The research results indicated that myricetin could effectively inhibit AK's activity and cause the obvious conformation changes, which also provide important clues for rational designing and developing biological insecticide.

myricetin; arginine kinase; structure;function

2016-12-28

褚 靖(1990—), 湖北孝感人，碩士研究生,從事蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的研究；通信作者：潘繼承，教授。

Q55

A

1008-021X(2017)04-0039-02