祖麗比婭·艾薩,廖光沖，姜述斌

1-磷酸鞘氨醇(S1P)在心室重塑過程中對梗死區(qū)血流恢復(fù)及血管新生的作用研究

祖麗比婭·艾薩1,廖光沖2a，姜述斌2b*

目的 觀察不同時間周期大鼠心肌梗死模型心肌組織中1-磷酸鞘氨醇(S1P)受體在梗死區(qū)的基因表達情況，探討其在心肌梗死后心室重塑過程中對梗死區(qū)血流恢復(fù)及血管新生的作用。方法 采用結(jié)扎左冠狀動脈前降支(LAD)的方法，造成大鼠左室大面積心梗，建立大鼠心肌梗死模型，分別于術(shù)后6、12、24 h觀察心肌梗死后心室重塑過程中血流的變化情況。然后處死大鼠，取其心肌組織，提取組織中的RNA，采用實時定量熒光技術(shù)(PCR)測定心肌組織中S1P受體mRNA在梗死區(qū)的表達情況。結(jié)果 術(shù)后6 h，大鼠心肌血流量和心肌微血管壁通透性隨時間節(jié)點的增加均明顯降低；術(shù)后12 h，這種趨勢趨緩。術(shù)后6 h，S1P1受體mRNA的表達水平呈明顯下降趨勢；與對照組相比，結(jié)扎梗死大鼠梗死區(qū)的S1P2受體mRNA在術(shù)后各時間節(jié)點表達水平均明顯下降。術(shù)后6 h，結(jié)扎梗死大鼠梗死區(qū)的S1P3受體mRNA表達顯著增強，但術(shù)后12 h出現(xiàn)較為明顯的表達抑制現(xiàn)象。結(jié)論 大鼠心肌梗死后的心肌血流恢復(fù)和新生血管早期可能與S1P1受體mRNA下調(diào)有關(guān)，隨后與S1P2受體mRNA、S1P3受體mRNA逐漸上調(diào)有關(guān)。

S1P受體；梗死區(qū)；血流變化；mRNA表達

0 引言

心室重塑是心肌梗死過程中心力衰竭的中心環(huán)節(jié)，具有心臟間質(zhì)纖維化的重要病理特征。傳統(tǒng)心室重塑概念認為心室重塑是非梗死區(qū)心肌組織的變化，并由急性心梗轉(zhuǎn)為慢性心衰的過程。近年來，隨著心力衰竭機制研究的深入，以及干細胞、組織工程等新技術(shù)在臨床醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用，心室重塑被賦予了更為廣泛的概念，其還包含了梗死區(qū)心肌組織的變化。

1-磷酸鞘氨醇(S1P)是細胞膜鞘磷脂代謝過程中產(chǎn)生的一類中間產(chǎn)物，廣泛表達于各類細胞組織中，如主要表達于內(nèi)皮細胞的S1P1、S1P2受體和主要表達于平滑肌細胞的S1P2、S1P3受體[1-2]。血管平滑肌細胞和內(nèi)皮細胞對心室重塑階段血流恢復(fù)和新生血管具有重要的影響[3]。傳統(tǒng)S1P在心肌疾病方面的應(yīng)用多集中在非梗死區(qū)心室重塑方面，對S1P在梗死區(qū)心室重塑方面的研究較少[4]。實時熒光定量PCR檢測技術(shù)可以通過測定聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)循環(huán)后的產(chǎn)物總量，對待測樣品中的特定DNA序列進行定量分析。本文通過實時熒光定量PCR檢測技術(shù)和血流分析技術(shù)檢測不同S1P系列在梗死區(qū)對心室重塑表達水平及血流變化情況的影響，探討心室重塑階段相關(guān)S1P在梗死區(qū)對心肌血流的作用，以期為心肌梗死病理性疾病的治療提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器 選取健康成年雄性SD大鼠(220～250 g)40只(新疆軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供)，動物許可編號：XJSCXK-(軍)2015-0753。實時定量PCR試劑盒、靜脈注射水合氯醛液由上海研卉生物科技有限公司提供；S1P1、S1P2、S1P3系列引物由美國Takaral公司提供。

動物呼吸機SA926-ALC-V8D，由北京中西集團有限公司提供；高通量組織細胞研磨破碎儀TL2020，由鼎昊源科技有限公司提供；PCR專用工作臺，由美國Biocap公司提供；熒光定量PCR儀SLAN2565，購于上海宏石醫(yī)療科技有限公司；酶標儀M362275，由西化儀(北京)科技有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 動物心肌梗死心室重塑模型的建立 采用結(jié)扎左冠狀動脈前降支(LAD)的方法，造成大鼠左室大面積心梗。以0.5%戊巴比妥鈉對大鼠腹腔予以注射麻醉，切開氣管，將動物呼吸輔助機連接到氣管處，無菌條件下在胸骨左側(cè)，沿胸骨平行方向做長2～3 cm的縱切口，依次切開皮膚和胸大肌，凸出肋骨部分。鈍性分離五、六肋間的肋間肌，采用開胸器擴開胸腔，暴露出心臟部分，擠壓出心臟，于LAD根部約2 mm處連同心肌進行結(jié)扎。然后小心將心臟放回胸腔。操作完成后，緩慢加大通氣量，當大鼠左肺充分膨脹后，逐層關(guān)閉胸腔，使其完全閉合，然后在胸廓兩側(cè)緩緩施壓，擠掉胸腔內(nèi)的空氣，當觀察到大鼠出現(xiàn)自主呼吸癥狀時，撤除呼吸輔助系統(tǒng)。對照組：僅打開大鼠胸腔，暴露出心臟后，不參與結(jié)扎手術(shù)。術(shù)后按每組4只給予大鼠保溫飼養(yǎng)，持續(xù)3 d，以15萬 U/d對大鼠注射青霉素。術(shù)后1 h內(nèi)進行心功能測試，以驗證大鼠心肌梗死心室重塑模型是否造模成功。采取尾靜脈靜推法，注射10%氯化鉀溶液處死10組大鼠。開胸，擠出心臟，以0～4 ℃的PBS溶液灌洗心腔，濾干后剪去心底部血管和梗死交界區(qū)組織(附近約2 mm)，左室梗死區(qū)和非梗死區(qū)心肌組織分離后，將其在液氮中迅速冷凍5 s，最后置于-80 ℃冰箱中保存。

1.2.2 心功能測定 以0.4%濃度戊巴比妥鈉將結(jié)扎10 min后的大鼠麻醉，分別在右側(cè)頸總動脈處和左心室插入測壓導(dǎo)管，并連接多導(dǎo)生理儀，依次測定外周平均動脈壓、左心室舒張末期壓、上升/下降的最大速率(左室內(nèi)壓)、左心室收縮壓。

1.2.3 梗死區(qū)心肌血管變化檢測 采用文獻[2]方法以TTC對大鼠心肌梗死模型梗死區(qū)進行染色，以放射性生物微球法檢測局部心肌血流變化情況。心肌微血管壁通透性測定：將各組心肌組織剪碎后，室溫下置于甲酰胺溶液中浸泡2 d，離析得到的上清液于分光光度計比色，參考比色波長620 nm，測定各組心肌組織的光密度值(OD)。分別在大鼠結(jié)扎梗死后6、12、24 h測定血流和心肌微血管壁通透性，并與對照組進行比較。

1.2.4 實時熒光定量PCR檢測 以異硫氰酸弧法[5]，將各組心肌組織分別用0.01 mol/L的PBS溶液處理后，切碎，置于Trizol試劑進行勻漿10 min，然后將漿液離心后，加入異丙酮溶液,在室溫下繼續(xù)孵育15 min，當上下分層后，棄去上清液，用70%乙醇對下方沉淀塊進行沖洗后，加入DEPC水50 μL溶解，得到RNA溶液。以分光光度計測定其濃度后置于-80 ℃保存?zhèn)溆?。?0 μL上述溶液，依次加入總RNA物質(zhì)5 μg，緩沖液10 μL(10 mmol/L)、RNasin溶液0.5 μL、Oligo物質(zhì)0.25 μg，反轉(zhuǎn)錄酶(M-MLV)溶液3 μL、DTT溶液0.5 μL(0.1 mol/L)后，37 ℃孵育1 h，然后在65 ℃下繼續(xù)反應(yīng)5 min，最后得到反轉(zhuǎn)錄cDNA，置于-20 ℃下保存，以GAPDH基因標準化為參照測定各組mRNA表達水平。

1.2.5 Western蛋白檢測心肌HSP70蛋白表達水平 將各組心肌組織分別用0.01 mol/L的PBS溶液處理后，加入10 μL裂解液冰浴處理15 min，采用細胞刮取少許細胞于EP試管中，在4 ℃、12 000 r/min條件下離心2 min。取上清液與緩沖液按照5∶1體積比混勻后在100 ℃條件下變性5 min，離心后，置于-20 ℃冷凍保存。再通過電泳、轉(zhuǎn)膜、顯色后采用Image軟件對顯色條帶灰度值精細分析，通過與β-actin灰度值比較，得到心肌HSP70蛋白表達水平。

2 結(jié)果

2.1 大鼠結(jié)扎后心功能測試結(jié)果 結(jié)扎手術(shù)結(jié)束后存活38只。與對照組相比，結(jié)扎組大鼠的左心室舒張末期壓、外周平均動脈壓、左心室收縮壓、左室內(nèi)壓上升速率明顯低于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，說明造模成功。見表1。

2.2 梗死區(qū)心肌血管變化檢測結(jié)果 大鼠冠狀動脈結(jié)扎后，與對照組相比，梗死區(qū)心肌血流量在各時間節(jié)點均明顯減少(P<0.01)，血流量在結(jié)扎12 h時達到最低，之后呈增加趨勢。見表2。

2.3 梗死區(qū)心肌血管變化檢測結(jié)果 大鼠冠狀動脈結(jié)扎后，與對照組相比，各結(jié)扎組大鼠梗死區(qū)心肌微血管壁通透性在各時間節(jié)點均明顯減少(P<0.01)，微血管壁通透性在結(jié)扎12 h時達到最低，之后呈增加趨勢。見表2。

表1 大鼠結(jié)扎后心功能測試結(jié)果

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01

表2 大鼠結(jié)扎后梗死區(qū)心肌血流量、微血管壁通透性變化

注：與對照組比較，*P<0.05,**P<0.01

2.4 大鼠心肌mRNA表達情況 與對照組相比，結(jié)扎組大鼠梗死區(qū)S1P1 mRNA在各時間節(jié)點的表達水平均明顯下降(P<0.05)；結(jié)扎梗死12 h后，S1P1 mRNA的表達水平下降幅度趨穩(wěn)。與對照組相比，結(jié)扎組大鼠梗死區(qū)S1P2 mRNA在各時間點的表達水平均明顯下降(P<0.01)，在結(jié)扎梗死12 h時的表達水平達到最低，在結(jié)扎梗死24 h的表達開始有所回升。與對照組相比，結(jié)扎6 h后大鼠梗死區(qū)S1P3 mRNA表達水平出現(xiàn)顯著上調(diào)(P<0.01)，結(jié)扎12 h與24 h后，大鼠梗死區(qū)S1P3 mRNA表達水平呈現(xiàn)不同程度的表達抑制現(xiàn)象，結(jié)扎24 h后，大鼠梗死區(qū)S1P3 mRNA表達水平明顯低于結(jié)扎6 h、12 h后及對照組(P<0.01)。見圖1。

2.5 大鼠心肌HSP70蛋白表達水平 加入不同S1P 6 h后，各組蛋白表達均明顯增強，S1P3對心肌HSP70蛋白表達的作用最強(P<0.01)，而S1P1最弱(P<0.01)。見圖2。

3 討論

本研究表明，心肌梗死后，心肌血流微循環(huán)無論是在代謝、形狀還是功能上均出現(xiàn)一系列變化。心肌梗死6 h后，血流量明顯減少，只有正常的3%，同時，梗死區(qū)心肌微血管壁通透性明顯增加，心肌微血管壁通透性只有正常的83.7%。

圖1 術(shù)后各組大鼠梗死區(qū)mRNA表達水平

S1P是細胞膜鞘磷脂代謝過程中產(chǎn)生的一類中間產(chǎn)物，廣泛表達于各類細胞組織中，目前包括8個成員，分別是S1P1(EDG1)、S1P2(EDG2)、S1P3(EDG3)、S1P4(EDG4)、S1P5(EDG5)、S1P6(EDG6)、S1P7(EDG7)、S1P8(EDG8)，其中，關(guān)于S1P1、S1P2、S1P3的研究最多，也最為重要。最新的研究成果顯示，S1P1、S1P2、S1P3通過與膜表面特異的G蛋白結(jié)合，對血流恢復(fù)和毛細血管結(jié)構(gòu)重塑具有非常重要的作用[5-6]。本實驗采用實時熒光定量PCR檢測技術(shù)，分別檢測了心肌梗死后重塑階段S1P1、S1P2、S1P3在梗死區(qū)不同時間節(jié)點的表達情況，結(jié)果表明，大鼠心肌梗死后，梗死區(qū)S1P1、S1P2、S1P3 mRNA均降低，同時血流量與心肌微血管壁通透性明顯改變，說明S1P1、S1P2、S1P3在心肌梗死后對梗死區(qū)血流量與心肌微血管壁通透性有顯著影響，但對不同S1P的影響不同[7]。

大鼠心肌梗死6 h后，梗死區(qū)S1P1、S1P2顯著降低，S1P1、S1P2受體表達通過激發(fā)釋放胞漿，促進細胞分裂和DNA合成，提高血管內(nèi)皮細胞增殖和抗凋亡能力，由于S1P1、S1P2受體降低，細胞增殖能力降低，血管新生減慢，從而導(dǎo)致血管壁通透性降低[8]；心肌梗死12 h后，S1P1的下降趨穩(wěn)，S1P2出現(xiàn)一定程度的升高，而血流量與心肌微血管壁通透性也有所增加，說明由于血管新生能力得到恢復(fù)，相應(yīng)提高了血管的血流量，增加了心肌微血管壁的通透性，二者之間有一定的正相關(guān)關(guān)系[9]。大鼠心肌梗死6 h后，梗死區(qū)S1P3顯著上調(diào)，但12 h后，呈現(xiàn)出不同程度的表達抑制現(xiàn)象，S1P3受體主要表達于血管平滑肌細胞，其不能遷移至毛細血管附近而加強血管結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致血管發(fā)育受限。大鼠心肌梗死6 h后，S1P3受體表達顯著上升，細胞遷移受限，心肌微血管壁出現(xiàn)相應(yīng)的負相關(guān)關(guān)系。大鼠心肌梗死12 h后，這種作用趨緩，心肌血流量、微血管壁也出現(xiàn)了一定的恢復(fù)，S1P3受體影響減弱。

基于以上分析，我們推測：在心室重塑過程中，S1P1信號減弱，梗死早期增強心肌S1P1信號對于心肌細胞新生、改善心功能有益[10]。心肌梗死后，給予S1P1受體選擇性激動劑SEW2871，可能對促進梗死區(qū)心肌細胞新生和凋亡減少，增強心肌功能有一定幫助[11]。S1P2對細胞遷移以及增強和維護內(nèi)皮細胞功能具有明顯的作用，給予S1P2受體拮抗劑，如JTE-013，對心力衰竭相關(guān)肌源反應(yīng)的消除具有積極作用[12]。S1P2在心肌梗死早期表達并不顯著[13]。S1P3受體主要表達于血管平滑肌細胞，不能遷移至毛細血管附近加強血管結(jié)構(gòu)，對心肌纖維化過程不能起到積極作用，伴隨其表達抑制，心肌出現(xiàn)一定的“自救”現(xiàn)象[14]。

有研究表明，HSP70蛋白表達與心肌細胞凋亡密切相關(guān)，通過加入不同S1P干預(yù)HSP70蛋白表達，可以測定不同S1P在HSP70蛋白表達中的水平。本研究表明，不同S1P均對心肌梗死造成的心肌細胞凋亡具有顯著的保護作用，作為機體內(nèi)源性保護蛋白，在S1P作用后，HSP70表達量增加，但不同S1P對心肌HSP70蛋白表達不一致，S1P3對心肌HSP70蛋白表達水平最高，而S1P1表達低于S1P2、S1P3，因此，在促進梗死區(qū)心肌細胞新生和凋亡減少、增強心肌功能方面，加入S1P對增強HSP70蛋白表達、提高心肌細胞自身修復(fù)具有積極作用。目前，對于心室重塑過程中S1P受體在心肌梗死區(qū)，特別是S1P1、S1P2、S1P3 mRNA變化趨勢對于梗死區(qū)心肌組織影響的報道較少。本文期望通過探討心室重塑階段相關(guān)S1P在梗死區(qū)對心肌血流及心肌微血管壁作用的影響，以期為心肌梗死病理性疾病治療提供更多的理論依據(jù)。

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Role of sphingosine-1-phosphate (S1P) on the recovery of blood flow and angiogenesis in the infarcted area during ventricular remodeling

ZULIBIYA Aisa1，LIAO Guang-chong2a,JIANG Shu-bin2b*

(1.The Fourth Affiliated Hospital of Traditional Chinese Medicine,Xinjiang Medical University,Urumqi 830000,China;2.a ICU,b.CCU,Hospital of Traditional Chinese Medicine of Xinjiang Uygur Autonomous Region,Urumqi 830000,China)

Objective To observe the gene expression of sphingosine-1-phosphate (S1P) receptors in myocardial tissues after myocardial infarction in rats,and to explore its effect on the recovery of blood flow and angiogenesis during ventricular remodeling after myocardial infarction.Methods Ligation of the left anterior descending coronary artery (LAD) was used to cause large area of myocardial infarction in rats′s left ventricule,so as to establish a rat model of myocardial infarction.The change in blood flow during the myocardial infarctio ventricular remodeling process was observed at 6 h,12 h and 24 h after operation.The rats were killed,and the RNA in myocardial tissue was extracted.The expression of S1P receptor mRNA in myocardial tissue in the infarcted area was detected by using real-time quantitative RNA technology (PCR).Results The myocardial blood flow and the permeability of myocardial microvascular wall decreased at 6 h after operation.At 12 h after operation,the decreased tendency was slowed down.The expression level of S1P1 receptor mRNA decreased obviously in the infarcted area at 6 h after operation.Compared with normal group,the expression of S1P2 receptor mRNA decreased at each time point after operation.The expression of S1P3 receptor mRNA was significantly enhanced in the infarcted area at 6 h after operation,but it was inhibited at 12 h after operation.Conclusion The recovery of myocardial blood flow and angiogenesis may be related to down-regulating the expression of S1P1 receptor mRNA in the early stage of myocardial infarction in rats,and up-regulating the expression of S1P2 receptor mRNA and S1P3 receptor mRNA gradually in the later stage.

Sphingosine-1-phosphate receptors;Infarct area;Blood flow changes;mRNA expression

2016-12-01

1.新疆醫(yī)科大學(xué)第四附屬中醫(yī)院，烏魯木齊 830000;2.新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院 a.ICU,b.CCU,烏魯木齊 830000

*通信作者

10.14053/j.cnki.ppcr.201708013