蘇梅芳

microRNA-130a在慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞耐藥中的作用

蘇梅芳

目的 比較microRNA-130a在伊馬替尼耐藥的慢性粒細(xì)胞白血病(CML)細(xì)胞株K562R和伊馬替尼敏感的CML細(xì)胞株K562中的表達(dá)，探討其與CML細(xì)胞耐藥的關(guān)系。方法 通過實時熒光定量PCR檢測耐藥株K562R和敏感株K562中microRNA-130a的表達(dá)水平。通過電穿孔轉(zhuǎn)染法將microRNA-130a模擬物mimic轉(zhuǎn)入敏感株K562中上調(diào)microRNA-130a的表達(dá)，分別用伊馬替尼處理轉(zhuǎn)染mimic細(xì)胞株及對照siRNA細(xì)胞株，記錄各組細(xì)胞增殖情況。通過AnnexinV和PI雙染法分別檢測各組細(xì)胞凋亡情況。使用不同濃度的伊馬替尼處理轉(zhuǎn)染mimic細(xì)胞株及對照細(xì)胞株，利用MTT法檢測各組細(xì)胞對伊馬替尼的敏感性。結(jié)果 microRNA-130a在耐藥株K562中的表達(dá)明顯高于敏感株K562。轉(zhuǎn)染microRNA-130a模擬物mimic的K562細(xì)胞對伊馬替尼的增殖抑制率明顯低于對照組，凋亡情況也明顯少于對照組。使用不同濃度的伊馬替尼處理轉(zhuǎn)染mimic細(xì)胞株及對照細(xì)胞株，mimic組細(xì)胞增殖抑制率明顯低于對照組，IC50分別為0.13 μmol/L和3.19 μmol/L。結(jié)論 microRNA-130a在伊馬替尼耐藥株K562R中呈高表達(dá)，上調(diào)microRNA-130a的表達(dá)可降低K562對伊馬替尼的敏感性。

慢性粒細(xì)胞白血?。籱icroRNA-130a；伊馬替尼；耐藥

0 引言

慢性粒細(xì)胞白血病(CML)是一類造血干祖細(xì)胞異常增生的惡性克隆性疾病。該類疾病的一個重要特征是染色體t(9;22) (q34;q11)異位形成費城染色體[1]。費城染色體的形成導(dǎo)致融合蛋白BCR-ABL異常高表達(dá)。融合蛋白BCR-ABL具有很強(qiáng)的酪氨酸激酶活性，激活其下游多條信號通路，使細(xì)胞獲得無限增殖的能力。這也是慢性粒細(xì)胞性白血病的主要發(fā)病原因[2-3]。伊馬替尼特異性針對BCR-ABL等酪氨酸激酶抑制劑，臨床主要用于CML的治療。但長期服用伊馬替尼，患者易產(chǎn)生耐藥性，嚴(yán)重影響伊馬替尼的臨床療效[4]。microRNA是一類長度為18～24 nt的小非編碼RNA，通過與目標(biāo)RNA 3′UTR的結(jié)合而抑制靶基因的表達(dá)[5]。microRNA在細(xì)胞增殖、分化、凋亡等多種生命活動中發(fā)揮重要作用[6]。近年研究發(fā)現(xiàn)，microRNA的特異性表達(dá)或沉默與CML的發(fā)生及耐藥性相關(guān)[7-10]。本研究觀察microRNA-130a在伊馬替尼耐藥細(xì)胞株K562中的表達(dá)，探討其與CML細(xì)胞耐藥的關(guān)系，以期為臨床伊馬替尼的耐藥提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞來源 伊馬替尼耐藥株K562R和敏感株K562購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

1.2 試劑和儀器 反轉(zhuǎn)錄試劑AMV逆轉(zhuǎn)錄酶購于Takara公司，SYBR熒光定量試劑盒購于羅氏公司，AnnexinV和PI凋亡檢測試劑盒購于北京全式金生物公司，MTT 細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒購于碧云天公司。二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱購于Thermo公司，實時定量PCR檢測儀購于美國ABI公司，流式細(xì)胞儀FACSCalibur購于美國B&D公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 耐藥株K562R和敏感株K562用含10%胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)于37 ℃的含5% CO2、95%空氣的培養(yǎng)箱中。

1.4 RNA抽提、反轉(zhuǎn)及實時定量PCR檢測 離心收集細(xì)胞，采用Trizol法抽提RNA，并對抽提的RNA進(jìn)行定量。使用AMV逆轉(zhuǎn)錄酶將抽提的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。反轉(zhuǎn)錄的cDNA作為模板進(jìn)行實時定量PCR檢測。

實時定量PCR特異性檢測microRNA-130a引物由上海生工生物公司合成，序列如表1所示。PCR反應(yīng)體系為：2×SYBR Mix：5 μL，正反向引物(10 μmol/L)各0.2 μL，模板cDNA 25 ng，無菌水補(bǔ)至10 μL。反應(yīng)條件為95 ℃ 1 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)數(shù)為40，每個循環(huán)進(jìn)行一次熒光信號的收集。microRNA-130a的相對表達(dá)量采用2-ΔΔt對基因表達(dá)量進(jìn)行相對定量。

表1 核苷酸序列

1.5 microRNA-130a mimic和對照無義鏈siRNA的合成 設(shè)計特異性的microRNA-130a mimic序列和對照無義鏈siRNA序列，所設(shè)計核苷酸序列由上海生工生物公司合成。microRNA-130a mimic和對照無義鏈siRNA序列如表1所示。

1.6 microRNA-130a mimic轉(zhuǎn)染 收集處于對數(shù)生長期的K562細(xì)胞2×107個，無血清PRIM-1640重懸，使細(xì)胞濃度為2×106/mL，將細(xì)胞等分至2個電轉(zhuǎn)杯中，一個電轉(zhuǎn)杯加入對照鏈siRNA，另一個電轉(zhuǎn)杯加入mimic，冰上放置15 min，設(shè)定電壓為250 V，轉(zhuǎn)染濃度為100 nmol/L進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h后，實時定量PCR檢測mimic表達(dá)情況。

1.7 細(xì)胞增殖曲線 分別將轉(zhuǎn)染siRNA和mimic K562細(xì)胞培養(yǎng)于六孔板中，每孔細(xì)胞數(shù)為1×106，每組設(shè)3個副孔，3 μmol/L伊馬替尼處理各孔細(xì)胞，隔天收集細(xì)胞，記錄細(xì)胞數(shù)，繪制細(xì)胞增殖曲線。

1.8 AnnexinV和PI凋亡檢測、MTT檢測細(xì)胞增殖抑制率 分別收集經(jīng)3 μmol/L伊馬替尼處理后的轉(zhuǎn)染siRNA和mimic的K562細(xì)胞，按AnnexinV和PI凋亡試劑盒步驟對細(xì)胞進(jìn)行AnnexinV和PI標(biāo)記，流式儀檢測AnnexinV和PI標(biāo)記的細(xì)胞，分析細(xì)胞凋亡情況。

分別將轉(zhuǎn)染siRNA和mimic的K562細(xì)胞培養(yǎng)于96孔板中，每孔細(xì)胞數(shù)為3×104，按0、1、5、10 μmol/L的伊馬替尼分別處理兩組細(xì)胞，置于37 ℃培養(yǎng)，培養(yǎng)48 h。終止培養(yǎng)前4 h每孔分別加入20 μL MTT試劑，培養(yǎng)48 h后，離心棄上清，加入150 μL DMSO，充分渦旋振蕩混勻，全自動酶標(biāo)儀檢測570 nm波長處的吸光值。計算各組細(xì)胞增殖抑制率，根據(jù)線性回歸方程求得伊馬替尼作用于siRNA和mimic的 K562細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度IC50。

2 結(jié)果

2.1 K562和K562R細(xì)胞中microRNA-130a的表達(dá) 實時定量PCR檢測結(jié)果表明，與敏感株K562相比，microRNA-130a在耐藥株K562R細(xì)胞中的表達(dá)水平顯著提高(P<0.01)，表達(dá)水平為K562的(5.19±0.57)倍。見圖1。

圖1 K562和K562R細(xì)胞中microRNA-130a的相對表達(dá)量

2.2 microRNA-130a mimic和siRNA轉(zhuǎn)染K562后microRNA-130a的表達(dá) 實時定量PCR檢測結(jié)果表明，K562轉(zhuǎn)染microRNA-130a mimic后，細(xì)胞總microRNA-130a的表達(dá)水平較對照組明顯增高(P<0.01)，表達(dá)水平為K562 siRNA的(26.72±3.06)倍。見圖2。

圖2 K562細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA和mimic后microRNA-130a的相對表達(dá)量

2.3 microRNA-130a mimic和siRNA轉(zhuǎn)染K562后細(xì)胞增殖情況 K562轉(zhuǎn)染microRNA-130a mimic和siRNA后，分別取等量的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，同時伊馬替尼處理各組別細(xì)胞，分別在第0、2、4、6天測定兩組細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)，繪制增殖曲線。增殖曲線結(jié)果表明，伊馬替尼處理對兩組細(xì)胞增殖抑制作用明顯，mimic組細(xì)胞增殖抑制情況好于siRNA組(P<0.05)。見圖3。

圖3 K562細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA和mimic后伊馬替尼處理細(xì)胞的增殖情況

2.4 microRNA-130a mimic和siRNA轉(zhuǎn)染K562后細(xì)胞凋亡情況 K562轉(zhuǎn)染microRNA-130a mimic和siRNA后，分別取等量的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，同時伊馬替尼處理各組別細(xì)胞，24 h后檢測各組細(xì)胞凋亡情況。流式結(jié)果表明，伊馬替尼處理后，兩組細(xì)胞均表現(xiàn)出明顯的凋亡現(xiàn)象。siRNA組凋亡細(xì)胞約占66.3%±5.62%，mimic組凋亡細(xì)胞約占32.4%±2.15%。兩組細(xì)胞凋亡情況比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見圖4。

2.5 MTT法檢測microRNA-130a mimic和siRNA轉(zhuǎn)染的K562細(xì)胞對伊馬替尼的敏感性 K562轉(zhuǎn)染microRNA-130a mimic和siRNA后，分別取等量的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，同時用0、1、5、10 μmol/L伊馬替尼處理各組別細(xì)胞，MTT法檢測microRNA-130a mimic和siRNA轉(zhuǎn)染的K562細(xì)胞對伊馬替尼的敏感性。MTT結(jié)果顯示，隨著藥物增加，伊馬替尼對mimic和siRNA兩組細(xì)胞的增殖抑制作用呈遞增趨勢。但是mimic細(xì)胞達(dá)到相同抑制率所需要的伊馬替尼的濃度明顯高于siRNA細(xì)胞。伊馬替尼對siRNA和mimic K562的半數(shù)抑制濃度IC50分別為0.13、3.19 μmol/L，兩組細(xì)胞IC50比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見圖5。

圖4 K562細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA和mimic后伊馬替尼處理細(xì)胞的凋亡情況

圖5 K562細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA和mimic后伊馬替尼處理細(xì)胞的增殖抑制率

3 討論

伊馬替尼作為治療慢性粒細(xì)胞白血病常用的酪氨酸激酶抑制劑，多數(shù)患者在用藥初期對藥物敏感，但治療后一段時間往往產(chǎn)生耐藥性[11-15]。近年來，越來越多的研究開始關(guān)注microRNA在白血病發(fā)生、發(fā)展及耐藥中的作用。最近研究表明，microRNA異常表達(dá)與酪氨酸激酶抑制劑的耐藥性相關(guān)[16]。近年來研究報道，在多種腫瘤組織(如卵巢癌[17]、肺癌[18]和胃癌[19-20])中，microRNA-130a表達(dá)明顯上調(diào)。

伊馬替尼作為酪氨酸激酶抑制劑，開啟了白血病分子靶向治療的新紀(jì)元。本研究發(fā)現(xiàn)，伊馬替尼耐藥株K562R細(xì)胞中，microRNA-130a表達(dá)較敏感株K562明顯上調(diào)，提示microRNA-130a在CML細(xì)胞中表達(dá)，并且其表達(dá)水平可能與伊馬替尼的敏感性有關(guān)。為此，筆者在敏感株K562細(xì)胞中過表達(dá)microRNA-130a的類似物mimic，轉(zhuǎn)染mimic的K562細(xì)胞microRNA-130a相對表達(dá)量明顯高于對照組。結(jié)果表明，外源microRNA-130a的類似物mimic在敏感株K562中過表達(dá)成功。為了進(jìn)一步明確microRNA-130a如何調(diào)控CML對伊馬替尼的敏感性，本研究分別檢測了轉(zhuǎn)染mimic和siRNA的K562細(xì)胞的增殖情況。伊馬替尼對過表達(dá)microRNA-130a的K562細(xì)胞抑制作用明顯減弱，表明microRNA-130a明顯加速了K562對伊馬替尼的耐藥性。通過流式分析檢測細(xì)胞凋亡情況，經(jīng)伊馬替尼處理后，過表達(dá)microRNA-130a的K562細(xì)胞凋亡情況明顯改善。流式分析檢測提示，過表達(dá)microRNA-130a通過抵抗凋亡進(jìn)而降低白血病細(xì)胞對伊馬替尼的敏感性。進(jìn)一步耐藥實驗結(jié)果表明，過表達(dá)microRNA-130a的K562的IC50從0.13 μmol/L提升至3.19 μmol/L，過表達(dá)microRNA-130a后，白血病細(xì)胞對伊馬替尼更不敏感。microRNA-130a表達(dá)上調(diào)可減弱K562細(xì)胞對伊馬替尼的敏感性，增強(qiáng)其耐藥能力，其耐藥能力的增強(qiáng)可能與細(xì)胞的凋亡相關(guān)，但具體的作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。microRNA-130a作為抑癌基因，對CML的耐藥性及敏感性有重要意義。microRNA-130a在伊馬替尼敏感和耐藥的患者中的差異表達(dá)，可作為臨床上伊馬替尼的治療依據(jù)，并且為個體化治療提供了潛在的治療靶點。今后的研究應(yīng)深入探討microRNA-130a在CML耐藥中的具體機(jī)制，以期為臨床實踐提供基礎(chǔ)資料，為白血病耐藥防治提供新的作用靶點。

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Role of microRNA-130a in drug resistance of chronic myeloid leukemia

SU Mei-fang

(Huanggang Central Hospital,Huanggang 430000,China)

Objective To compare the expression of microRNA-130a in imatinib-resistant K562R cells and imatinib-sensitive K562 cells,and to investigate the relationship between microRNA-130a and drug resistance of chronic myeloid leukemia (CML).Methods The expression of microRNA-130a in imatinib-resistant K562R cells and imatinib-sensitive K562 cells was detected by real-time RT PCR.MicroRNA-130a mimic was transferred into K562 cells by electro-transfection.K562/mimic and the control cells were treated with imatinib,then the cell proliferation was recorded and apoptosis was detected by flow cytometry with AnnexinV/ PI staining.MTT method was used to detect the proliferation ability of K562/mimic and the control cells treated with imatinib.Results The expression level of microRNA-130a in imatinib-resistant K562R cells was higher than that of imatinib-sensitive K562 cells.The proliferation inhibition rate to imatinib and the apoptosis rate of K562/mimic were lower than those of control cells,and the IC50was 0.13 μmol/L and 3.19 μmol/L respectively.Conclusion MicroRNA-130a is highly expressed in imatinib-resistant K562R cells,and up-regulating the expression of microRNA-130a can decrease the sensitivity of imatinib to CML.

Chronic myeloid leukemia;MicroRNA-130a;Imatinib;Drug resistance

2016-12-22

黃岡市中心醫(yī)院，武漢 黃岡 430000

10.14053/j.cnki.ppcr.201708005