陳天明，盧 青，李仁翔*

氨茶堿對(duì)慢阻肺模型大鼠炎癥因子及免疫功能的影響

陳天明1，盧 青2，李仁翔1*

目的 探討氨茶堿緩解慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease，COPD)模型大鼠炎癥狀態(tài)及改善機(jī)體免疫功能的有效性。方法 隨機(jī)從60只大鼠中選出20只作為正常組，其余大鼠使用香煙煙霧和細(xì)菌聯(lián)合誘導(dǎo)建立COPD模型。將34只成功建立COPD模型的大鼠隨機(jī)分為氨茶堿組(17只)和陰性組(17只)。對(duì)照組和陰性組每天灌胃生理鹽水(2 mL/只，bid)，氨茶堿組每天灌胃氨茶堿[2.3 mg/(kg·d)，bid]。連續(xù)灌胃2個(gè)月后，進(jìn)行形態(tài)學(xué)檢測(cè)，并進(jìn)行支氣管肺泡灌洗液的炎癥因子檢測(cè)和免疫細(xì)胞計(jì)數(shù)。結(jié)果 與正常組比較，陰性組和氨茶堿組支氣管肺泡灌洗液中IL-6、IL-1β、TNF-α水平均升高(P<0.05)，氨茶堿組上述指標(biāo)低于陰性組(P<0.05)。與正常組比較，陰性組和氨茶堿組支氣管肺泡灌洗液中總細(xì)胞、單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞數(shù)均升高(P<0.05)，并且氨茶堿組的上述指標(biāo)水平低于陰性組(P<0.05)。結(jié)論 氨茶堿能有效減輕COPD大鼠炎癥狀態(tài)，改善機(jī)體免疫功能。

慢性阻塞性肺疾??；大鼠；氨茶堿；炎癥；免疫功能

0 引言

慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是一種具有氣流受限特征的肺部疾病，氣流受限不完全引起肺功能進(jìn)行性減退，嚴(yán)重威脅患者生命安全[1-2]。目前，世界尚無(wú)有效手段治愈COPD，臨床治療COPD主要通過(guò)提高患者的免疫力和減輕氣道炎癥反應(yīng)，降低肺部感染和控制疾病損害。氨茶堿(Aminophylline)為茶堿與乙二胺復(fù)鹽，可松弛支氣管平滑肌，增強(qiáng)膈肌收縮力，尤其在COPD時(shí)作用更顯著，有益于改善呼吸功能[3-4]。目前氨茶堿用于治療COPD已有十幾年的歷史，然而關(guān)于其作用機(jī)制尚不清楚，有關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，其在治療COPD時(shí)，會(huì)對(duì)機(jī)體的免疫功能和氣道的炎癥狀態(tài)產(chǎn)生影響[5]。因此，本研究擬通過(guò)建立COPD大鼠模型，旨在進(jìn)一步觀察氨茶堿對(duì)其免疫細(xì)胞和炎癥因子的影響，探討氨茶堿對(duì)COPD的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 60只清潔級(jí)SD大鼠，雌雄各半，2月齡，無(wú)特定病原體，體重(200±20)g，購(gòu)于武漢大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，許可證號(hào)：SCXK[鄂]2008-0004。實(shí)驗(yàn)前，大鼠于獨(dú)立通風(fēng)籠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，正常飲水、進(jìn)食，飼養(yǎng)環(huán)境溫度為25 ℃，相對(duì)濕度為55%。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物和試劑 氨茶堿片(山西鑫煜制藥有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H14021214，規(guī)格0.1 g)，白細(xì)胞介素1β (IL-1β)、白細(xì)胞介素6 (IL-6)、腫瘤壞死因子-α (TNF-α)。酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司，黃鶴樓香煙(湖北中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，含焦油10 mg、尼古丁1.0 mg、CO 11 mg)。肺炎克雷伯桿菌(菌株：CMCC 46114-8)購(gòu)自武漢省臨床檢驗(yàn)中心，臨用前用生理鹽水配成6×108CFU/mL。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 日立7020全自動(dòng)生化分析儀購(gòu)于日本HITACHI公司，DM4000B正置生物顯微鏡購(gòu)于德國(guó)Leica公司，Elx800-UV酶標(biāo)儀購(gòu)于Bio-tek公司，Editormp601胸部X光片購(gòu)于德國(guó)西門(mén)子公司。

1.4 動(dòng)物分組及模型制作 隨機(jī)從60只大鼠中選出20只作為正常組，其余大鼠建立COPD模型。COPD模型建立采用香煙煙霧和細(xì)菌暴露法[6]：將大鼠置于自制的熏箱中，每天完全暴露于煙霧中持續(xù)3個(gè)月，前2周每天點(diǎn)燃6支煙制造煙霧(早、晚各3支)，第3周至第12周每天點(diǎn)燃15支煙制造煙霧(早、中、晚各5支)。此外，在前8周每隔5 d向大鼠兩個(gè)鼻孔中緩慢滴入新配制的肺炎克雷伯桿菌溶液0.1 mL。12周后通過(guò)胸部X光片進(jìn)行評(píng)估，出現(xiàn)明顯增厚肺組織和陰影形態(tài)不規(guī)則表明COPD模型建立成功。將34只成功建立COPD模型大鼠隨機(jī)分為氨茶堿組和陰性組，每組17只。

1.5 藥物干預(yù) 成功建立COPD模型后，對(duì)照組和陰性組每天灌胃生理鹽水(2 mL/只，bid)，氨茶堿組每天灌胃氨茶堿[2.3 mg/(kg·d)，bid]。每周根據(jù)大鼠體重調(diào)整劑量，連續(xù)灌胃2個(gè)月后處死大鼠，進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。

1.6 形態(tài)學(xué)檢測(cè) 取大鼠右肺中下葉組織以4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋切片，進(jìn)行HE染色。

1.7 支氣管肺泡灌洗液炎癥因子測(cè)量和免疫細(xì)胞計(jì)數(shù) 在麻醉下，對(duì)各組大鼠進(jìn)行開(kāi)胸手術(shù)，向支氣管注入生理鹽水進(jìn)行灌洗，然后回收灌洗液，每次5 mL，重復(fù)進(jìn)行5次。將收集的支氣管肺泡灌洗液離心后，取上清液采用ELISA試劑盒檢測(cè)IFN-γ、IL-6和TNF-α含量，取沉淀進(jìn)行瑞氏染色，根據(jù)細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行分類(lèi)，并對(duì)總細(xì)胞、單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠胸部X線(xiàn)片觀察 如圖1所示，正常組大鼠肺結(jié)構(gòu)完整；陰性組大鼠出現(xiàn)嚴(yán)重的肺組織病理學(xué)變化，如增厚無(wú)序、高密度斑塊、多云陰影和右肺下葉的邊緣模糊；氨茶堿組較陰性組炎癥癥狀明顯減輕，沒(méi)有明顯的大量滲透。

2.2 各組大鼠肺組織病理態(tài)學(xué)變化 如圖2所示，正常組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)完整，未見(jiàn)管壁增厚，纖毛無(wú)脫落且排列整齊，未見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；陰性組大鼠顯示嚴(yán)重的病理變化，如肺泡隔明顯增厚、細(xì)支氣管狹窄，肺泡腔膨脹，肺泡破壞，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和黏膜增生；氨茶堿組病變較陰性組明顯好轉(zhuǎn)，部分肺泡融合，上皮細(xì)胞少量脫落，有較少炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。

圖1 各組大鼠胸部X線(xiàn)片觀察

圖2 各組大鼠肺組織病理學(xué)變化(HE，50×)

2.3 各組大鼠支氣管肺泡灌洗液中炎癥因子比較 與正常組相比，陰性組和氨茶堿組支氣管肺泡灌洗液中IL-6、IL-1β和TNF-α水平均升高(P<0.05)，且氨茶堿組低于陰性組(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠炎癥因子水平比較

注：t1、P1：陰性組與正常組比較;t2、P2：氨茶堿組與正常組比較;t3、P3：陰性組與氨茶堿組比較

2.4 各組大鼠支氣管肺泡灌洗液中免疫細(xì)胞比較 與正常組相比，陰性組和氨茶堿組支氣管肺泡灌洗液中總細(xì)胞、單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞數(shù)均顯著提高(P<0.05)，并且氨茶堿組低于陰性組(P<0.05)。見(jiàn)表2。

3 討論

COPD實(shí)質(zhì)是一種慢性氣道炎癥性疾病，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)刺激大量的炎性介質(zhì)釋放，引起黏液分泌增加，同時(shí)出現(xiàn)免疫功能異常，尤其是免疫細(xì)胞功能紊亂[7-8]。近年來(lái)，已有大量研究證實(shí)香煙煙霧誘導(dǎo)是建立COPD實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷牧己梅椒?，如Lee等[9]和Wang等[10]研究發(fā)現(xiàn)，大鼠完全暴露于香煙煙霧中2個(gè)月，會(huì)引起肺泡合并和支氣管壁增厚，表明香煙誘導(dǎo)的COPD模型建立成功。本研究使用香煙煙霧和細(xì)菌聯(lián)合誘導(dǎo)建立COPD大鼠模型，一方面基于約90%的COPD病例是由于煙霧和細(xì)菌感染誘發(fā)所致，另一方面是因?yàn)樵撃Ｐ捅憩F(xiàn)出類(lèi)似于人的生理效應(yīng)，適用于評(píng)估藥物對(duì)肺部炎癥的影響。目前已證實(shí)煙霧暴露的大鼠伴有支氣管炎、肺氣腫、氣流阻塞、肺泡合并和支氣管壁增厚等癥狀，進(jìn)而引起氣道阻力增加，肺動(dòng)態(tài)順應(yīng)性下降，最終增大肺部空氣的滯留和減少呼氣期間的肺反沖，出現(xiàn)COPD[11]。

表2 各組大鼠支氣管肺泡灌洗液中免疫細(xì)胞比較

注：t1、P1：陰性組與正常組比較;t2、P2：氨茶堿組與正常組比較;t3、P3：陰性組與氨茶堿組比較

氨茶堿是臨床用于治療COPD的常用藥物，但是目前尚無(wú)可靠的臨床數(shù)據(jù)證實(shí)其能抑制肺部炎癥及改善機(jī)體免疫功能。COPD病理變化經(jīng)常發(fā)生在氣道壁和肺實(shí)質(zhì)。在COPD大鼠中，胸部X線(xiàn)片觀察到肺實(shí)質(zhì)存在明顯的炎癥，包括增厚無(wú)序、高密度斑塊、多云陰影和右肺下葉的邊緣模糊。氨茶堿組大鼠經(jīng)氨茶堿治療后，這些病理變化明顯減輕，此外，HE染色顯示部分肺泡融合，上皮細(xì)胞少量脫落，有較少炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。

近年研究發(fā)現(xiàn)，香煙煙霧誘導(dǎo)的肺炎癥反應(yīng)涉及多種細(xì)胞因子和趨化因子。Gessner等[12]發(fā)現(xiàn)，煙霧誘導(dǎo)的小鼠肺組織中TNF-α較正常小鼠高表達(dá)；Ferrari等[13]發(fā)現(xiàn)，COPD患者和健康吸煙人群的血清和痰中IL-6水平高于非吸煙者。TNF-α可通過(guò)刺激介導(dǎo)創(chuàng)傷誘導(dǎo)的炎癥細(xì)胞因子如IL-4、IL-6釋放，最終導(dǎo)致組織和器官出現(xiàn)嚴(yán)重的炎癥性病變。IL-1β參與炎癥介質(zhì)和效應(yīng)細(xì)胞組成的支氣管腔內(nèi)自分泌環(huán)路，Pauwels等[14]研究發(fā)現(xiàn)，IL-1β是香煙煙霧誘導(dǎo)COPD小鼠肺部炎癥的重要介質(zhì)。本研究結(jié)果顯示，陰性組和氨茶堿組大鼠支氣管肺泡灌洗液中IL-6、IL-1β和TNF-α水平均高于正常組，且氨茶堿組低于陰性組，提示經(jīng)氨茶堿治療后COPD大鼠炎癥因子明顯降低，其抗炎作用可能與抑制磷酸二脂酶活性、神經(jīng)肽的釋放、氧自由基等有關(guān)。

研究發(fā)現(xiàn)，隨著COPD繼續(xù)發(fā)展，炎癥向縱深擴(kuò)展，免疫細(xì)胞數(shù)量之間的平衡遭到破壞，引起肺自身產(chǎn)生異常的免疫應(yīng)答，引起肺損傷，進(jìn)而出現(xiàn)肺氣腫。Reddy等[15]研究發(fā)現(xiàn)，香煙煙霧誘導(dǎo)的肺炎癥反應(yīng)的可能機(jī)制為煙霧刺激肺泡巨噬細(xì)胞釋放大量中性粒細(xì)胞趨化因子，進(jìn)而引起免疫功能降低。因此，免疫細(xì)胞數(shù)量增多是COPD特征性免疫反應(yīng)。本研究中，陰性組和氨茶堿組支氣管肺泡灌洗液中免疫細(xì)胞數(shù)均顯著高于正常組，并且氨茶堿組的免疫細(xì)胞數(shù)顯著低于陰性組，提示氨茶堿能在一定程度上調(diào)節(jié)COPD大鼠肺部免疫細(xì)胞數(shù)量，從而抑制異常炎癥反應(yīng)。

綜上所述，氨茶堿能有效減輕COPD大鼠肺實(shí)質(zhì)和氣道壁的炎癥反應(yīng)，其抗炎作用可能與抑制IL-6、IL-1β和TNF-α等炎癥因子釋放和改善機(jī)體免疫功能有關(guān)，但具體的作用機(jī)制仍需分子生物學(xué)研究去證實(shí)。

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Effects of aminophylline on inflammatory cytokines and immune function of rats with chronic obstructive pulmonary disease

CHEN Tian-ming1,LU Qing2,LI Ren-xiang1*

(1.Department of Respiratory,Jingmen First People′s Hospital of Hubei,Jingmen 448000,China;2.Jingchu University of Technology,Jingmen 448000,China)

Objective To discuss the effects of aminophylline on the inflammatory state and immune function of COPD rat model.Methods Twenty rats were randomly selected from 60 rats as normal group,and the other rats were established as COPD model by combining of cigarette smoking with bacteria.Thirty-four COPD rats were randomly divided into aminophylline group (n=17) and negative group (n=17).Control group and the negative group were given normal saline (2 mL/d,bid),and aminophylline group was given aminophylline [2.3 mg/(kg·d),bid].The rats were sacrificed at the end of 2 months,and lung tissue histology and ultrastructure was observed under light and electron microscopes.Results The levels of IL-6,IL-1β and TNF-α of bronchoalveolar lavage fluid in negative group and aminophylline group were higher than those of normal group (P<0.05),and the indexes of aminophylline group were lower than those of negative group (P<0.05).The percentage of total cells,monocytes/macrophages,lymphocytes and neutrophils in bronchoalveolar lavage fluid of negative group and aminophylline group were higher than those of normal group (P<0.05),and the indexes of aminophylline group were lower than those of negative group (P<0.05).Conclusion Aminophylline can effectively improve the inflammatory state of COPD rats and improve the immune function.

Chronic obstructive pulmonary disease;Rat;Aminophylline;Inflammation;Immune function

2017-02-21

1.湖北省荊門(mén)市第一人民醫(yī)院呼吸科，湖北 荊門(mén) 448000；2.荊楚理工學(xué)院，湖北 荊門(mén) 448000

衛(wèi)計(jì)委科研立項(xiàng)項(xiàng)目(WJ2015MB280)

10.14053/j.cnki.ppcr.201708003

*通信作者