韓雨薇，劉秀娟，高 陽，李曉明

·論著·

齊墩果酸通過VEGF-Src通路對蛛網(wǎng)膜下腔出血大鼠模型血管內(nèi)皮緊密連接表達的影響

韓雨薇，劉秀娟，高 陽，李曉明*

目的 探討齊墩果酸對蛛網(wǎng)膜下腔出血后早期腦損傷的保護作用，闡釋其可能的機制。方法 54只成年雄性SD大鼠分成3組(假手術組、SAH模型組、齊墩果酸給藥組)，每組18只。采用頸內(nèi)動脈穿刺法建立大鼠SAH模型，造模1 h后給藥，24 h后進行神經(jīng)功能損傷評分；檢測腦水含量及腦伊文思藍浸出；并利用Western blot方法檢測腦組織Src、VEGF、ZO-1、Claudin-5、Occludin蛋白的表達量。結(jié)果 齊墩果酸高劑量給藥可有效改善神經(jīng)功能損傷(P<0.01)；降低腦組織含水量和腦血管通透性(P<0.01)；增加ZO-1、Claudin-5、Occludin蛋白的表達，降低VEGF水平，抑制Src激活(P<0.05)。結(jié)論 齊墩果酸對SAH后早期腦損傷有顯著的保護作用，可改善腦水腫，其作用機制可能與增加腦組織緊密連接蛋白的表達有關。

齊墩果酸；蛛網(wǎng)膜下腔出血；腦水腫；緊密連接

0 引言

維持血管屏障功能的關鍵在于內(nèi)皮細胞之間的相互作用，內(nèi)皮細胞之間通過緊密連接結(jié)構結(jié)合在一起調(diào)控血管通透性[7]。BBB緊密連接結(jié)構組成主要是由跨膜蛋白Occludin、Claudin及胞質(zhì)附著蛋白ZO家族組成的復合體。屏障功能的破壞、通透性的改變與細胞間的緊密連接狀態(tài)密不可分。

齊墩果酸(3b-hydroxy-olea-12-en-28-oic acid，OA)是廣泛存在于食品和藥用植物中的五環(huán)三萜類化合物，具有多種生物活性，有潛在的抗炎和神經(jīng)保護作用。本研究采用動脈刺破方法建立SAH模型，考察齊墩果酸在SAH大鼠模型中能否通過改善緊密連接保護屏障功能從而減輕早期腦損傷，探討其發(fā)揮藥效的可能機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 藥物齊墩果酸購自天津士蘭科技有限公司；p-Src和Src抗體購自Cell Signaling Technology公司；VEGF、ZO-1，Claudin-5、Occludin抗體購自Santa Cruz公司；HRP二抗均購自Santa Cruz公司；BCA蛋白定量試劑盒、RIPA裂解液及5×loading buffer均購自碧云天公司。

1.2 實驗動物和分組 雄性清潔級SD大鼠(280～350 g)購自沈陽軍區(qū)總醫(yī)院實驗動物中心，實驗動物合格證號0005095。動物飼養(yǎng)于18～22 ℃恒溫室中，12 h/12 h光暗周期，實驗前自由進食、水。54只大鼠隨機分成3組，每組18只：假手術組、模型組、齊墩果酸給藥組(20 mg/kg)。術前禁食，自由飲水，在模型制作完成后1 h給藥，24 h后進行取材。

1.3 模型建立 手術前，10%水合氯醛腹腔麻醉，于頸部正中縱向切開后，分離出頸總動脈、頸外動脈及頸內(nèi)動脈，結(jié)扎頸外動脈遠端，并以手術線臨時阻斷頸總動脈和頸內(nèi)動脈，在頸內(nèi)動脈端用手術剪刀剪一小口，將魚線(直徑0.261 mm)從小口送入頸內(nèi)動脈，推進至大鼠大腦前動脈和中動脈分叉處，并穿破動脈建立SAH模型。假手術組中進行類似的操作，但不穿破動脈。

1.4 SAH嚴重性評價 SAH的嚴重性根據(jù)Sugawara[8]評分標準對SAH血凝塊進行0～3級評分。評分越高表示SAH越嚴重。

1.5 死亡率和神經(jīng)功能缺失的評價 記錄死亡率，并根據(jù)Sugawara[8]評分標準對SAH 24 h 后的各組大鼠進行神經(jīng)功能缺陷評分，即對大鼠自發(fā)性活動、四肢運動對稱、前肢伸展、攀登、雙側(cè)軀干的觸碰反應以及觸須反應6個項目進行測試，并給予0～3分的評價。各項之和作為總評分，得分越低表明神經(jīng)功能損傷越嚴重。平衡木測驗：平衡木為長80 cm、寬2.5 cm的方木棒，平放于距地面10 cm處，將大鼠放在平衡木上，能堅持91～120 s計6分，61～90 s計5分，31～60 s計4分，21～30 s計3分，11～20 s計2分，1～10 s計1分，將大鼠放上平衡木會掉下來計0分[9]。

1.6 腦組織含水量測定 每組取6只大鼠，造模24 h后，取出大鼠腦組織，將其切分為左右半腦及小腦三部分，擦去表面血跡分別稱量其濕重后，放入110 ℃烘箱內(nèi)烘干72 h。稱量其干重，按照公式計算其腦含水率：腦含水率(%)=(濕重-干重)/濕重]×100%。

1.7 腦血管通透性測定 每組取6只大鼠，于取材前1 h尾靜脈給予2%伊文思藍溶液(5 mL/kg)，全身循環(huán)1 h后，進行生理鹽水灌注，迅速取出腦組織，將其切分為左右半腦及小腦三部分，即稱重。按10 mL/g的體積將組織浸潤到甲酰胺溶液中，60 ℃恒溫孵育24 h待伊文思藍浸出，收集浸出液于酶標儀620 nm處測定其OD值。

④遙感技術具有數(shù)據(jù)穩(wěn)定、方法科學、手段先進等特點，隨著國產(chǎn)自主高分辨率衛(wèi)星技術的發(fā)展以及生態(tài)清潔小流域規(guī)劃審批新工作模式的實踐與完善，其在北京市生態(tài)清潔小流域建設審批工作中的應用效果也將不斷提升，并可進一步向其他生態(tài)建設工程的規(guī)劃評審工作推廣。

1.8 Western blot檢測蛋白表達 大鼠過量麻醉致死，取大鼠患側(cè)大腦皮層，稱重后加入1 mL裂解液(含PMSF)，勻漿裂解30 min后，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清即為蛋白溶液；BCA法測定蛋白濃度，按照蛋白溶液體積的1/4加入5×loading buffer混合，100 ℃煮沸5 min，卻后-70 ℃保存；用10% SDS-聚丙烯胺凝膠電泳，向加樣孔中加入40 μg總蛋白樣品，恒流轉(zhuǎn)至PVDF膜；5%脫脂牛奶室溫封閉1 h；一抗VEGF和ZO-1、Claudin-5、Occludin的稀釋比例為1∶200，Src稀釋比例為1∶600，p-Src稀釋比例為1∶400，β-actin一抗的稀釋比例為1∶1 000，4 ℃過夜；將HRP標記的二抗用TBST稀釋，與膜室溫孵育1 h；TBST洗后經(jīng)Pro-light HRP化學發(fā)光檢測試劑盒發(fā)光，用X-ray顯影。

2 結(jié)果

2.1 齊墩果酸對大鼠SAH分級的影響 如圖1所示，SAH模型組蛛網(wǎng)膜下腔出血嚴重，SAH評分顯著降低，而齊墩果酸給藥能夠減輕SAH出血的發(fā)生，降低SAH的評分。

圖1 齊墩果酸給藥對蛛網(wǎng)膜下腔出血24 h后SAH評分的影響

2.2 齊墩果酸對SAH大鼠神經(jīng)功能損傷的影響 依照行為學評分標準，分值越低表明神經(jīng)損傷越嚴重，反之亦然。與假手術組相比，SAH模型組大鼠均出現(xiàn)了嚴重的神經(jīng)損傷癥狀(P<0.001)。而齊墩果酸給藥(20 mg/kg)能夠顯著改善大鼠的神經(jīng)功能(P<0.01)。見圖2。

圖2 齊墩果酸給藥對蛛網(wǎng)膜下腔出血24 h后神經(jīng)功能損傷的影響

2.3 齊墩果酸對SAH大鼠腦水腫和腦血管通透性的影響 與假手術相比，SAH模型組腦含水量明顯增加，而齊墩果酸給藥組能夠顯著降低腦含水量(P<0.01)。SAH模型后，伊文思藍浸出明顯增加，說明腦血管通透性增強，齊墩果酸給藥降低腦內(nèi)伊文思藍含量，對腦血管通透性具有顯著的改善作用(P<0.01)。見圖3。

圖3 齊墩果酸對SAH大鼠腦組織含水量

2.4 齊墩果酸對SAH大鼠VEGF-Src信號通路的影響 如圖4所示，SAH組大鼠腦組織中VEGF表達明顯增加，而齊墩果酸給藥后，VEGF的表達顯著降低(P<0.01)。對p-Src和Src的表達進行檢測發(fā)現(xiàn)，SAH模型組大鼠腦組織Src活化，磷酸化Src表達增加，而齊墩果酸給藥組顯著抑制Src的磷酸化。

圖4 齊墩果酸對SAH大鼠VEGF-Src信號通路的影響

2.5 齊墩果酸對SAH大鼠腦組織黏附連接蛋白表達的影響 如圖5所示，與假手術組相比，SAH組ZO-1、Claudin-5、Occludin蛋白表達顯著降低(P<0.01)。與模型組相比，齊墩果酸給藥后能夠顯著恢復這種變化，增加ZO-1、Claudin-5、Occludin蛋白的表達(P<0.05)。

3 討論

蛛網(wǎng)膜下腔出血是一種常見的出血性腦血管疾病，多見于動脈瘤的破裂。SAH發(fā)生后，可引起一系列的并發(fā)癥，如腦水腫、腦血管基底動脈痙攣、肺水腫等。其中腦水腫是SAH后較嚴重的并發(fā)癥，也是蛛網(wǎng)膜下腔出血患者致死致殘、預后差的主要原因之一。齊墩果酸具有多種生物活性，有潛在的抗炎和神經(jīng)保護作用。本研究采用顱內(nèi)動脈穿刺法建立大鼠SAH模型，該模型比較接近人類動脈瘤性蛛網(wǎng)膜下腔出血的病理生理過程，但缺點是難以控制出血速度與出血量，由于出血量的不同，SAH的程度不一致，影響實驗結(jié)果的可靠性。出血量的多少可通過改變尼龍絲尖端直徑的大小來控制[10]，本研究采用相同的尼龍線進行實驗操作，盡量避免手術差異，并選取SAH損傷程度相近的模型進行實驗和統(tǒng)計。本研究結(jié)果顯示，齊墩果酸對SAH大鼠的神經(jīng)功能損傷具有顯著的改善作用。大鼠SAH后24 h腦含水量和伊文思藍滲出明顯增加，而齊墩果酸給藥后，大鼠腦含水量和伊文思藍滲透率明顯降低，說明齊墩果酸能有效減輕SAH引起的腦水腫和腦血管通透性的破壞。

圖5 齊墩果酸對SAH大鼠腦組織ZO-1蛋白表達的影響

腦血管內(nèi)皮屏障主要與腦血管內(nèi)皮細胞間的通透性相關。緊密連接是維持內(nèi)皮細胞選擇滲透性屏障功能的關鍵要素，緊密連接蛋白ZO-1、Claudin-5、Occludin是構成緊密連接的重要成分，其表達、功能和結(jié)構的改變可引起緊密連接解離，細胞間隙加大，從而增加血管通透性。研究表明，實驗性蛛網(wǎng)膜下腔出血可以損傷內(nèi)皮屏障功能，導致通透性增加，引起組織或器官水腫和功能障礙。并且，大量研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠SAH模型中，ZO-1、Claudin-5、Occludin表達顯著減低，緊密連接破壞，通透性顯著增加，加重腦水腫的發(fā)生。因而保護屏障功能，降低血管通透性，可能是減輕SAH后早期腦損傷的關鍵環(huán)節(jié)之一。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是一種多效細胞因子，具有促有絲分裂和通透性相關的多種功能。一些研究已經(jīng)證明，VEGF的表達上調(diào)是實驗性SAH后BBB破壞腦水腫形成的發(fā)病機制[11]，并且VEGF活化導致Src酪氨酸激酶的磷酸化[12]。Src介導VEGF對BBB通透性的改變，抑制Src可減弱血管通透性，減少腦水腫及缺血性中風后的腦梗死的發(fā)生[13-14]。

本研究針對齊墩果酸對SAH后大鼠腦組織中ZO-1、Claudin-5、Occludin的表達變化及可能的作用機制進行了考察，發(fā)現(xiàn)假手術組ZO-1、Claudin-5、Occludin蛋白表達明顯，在SAH組大鼠腦組織中其表達顯著減少，而齊墩果酸(20 mg/kg)可以改善SAH 后大鼠腦組織中ZO-1、Claudin-5、Occludin表達降低的情況，增加其蛋白的表達，進而改善腦水腫，對SAH后早期腦損傷有保護作用。

￣綜上所述，齊墩果酸能夠減輕SAH后早期腦水腫，并改善神經(jīng)功能損傷，在SAH后早期腦損傷治療中有良好的應用前景。本文為齊墩果酸改善SAH早期腦損傷、保護屏障功能、減輕腦水腫的可能的作用機制提供了參考依據(jù)，其具體機制仍有待深入研究。

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Effect of oleanolic acid on tight junctions of rat model after subarachnoid hemorrhage through VEGF-Src pathway

HAN Yu-wei,LIU Xiu-juan,GAO Yang,LI Xiao-ming*

(Institute of Neurology,General Hospital of Shenyang Military Command,Shenyang 110016,China)

Objective To explore the effect of oleanolic acid (OA) on early brain injury following subarachnoid hemorrhage (SAH) and explain its possible mechanism.Methods Totally 54 male SD rats were divided into 3 groups:sham group (n=18),SAH group (n=18) and OA-treated SAH group (n=18).The endovascular puncture model was used to induce SAH.Neurological score,brain water content and blood-brain barrier (BBB) were evaluated at 24 h after SAH.The protein expression of ZO-1,VEGF and Src was determined by Western blot.Results High-dose OA administration could significantly improve the neurological scores (P<0.01),reduce the brain water content and BBB permeability (P<0.01),up-regulate the expression of ZO-1,Claudin-5 and Occludin,and inhibit the expression of VEGF and Src phosphorylation (P<0.01).Conclusion OA can protect against the early brain injury after SAH and improve brain edema by increasing the expression of tight junctions.

Oleanolic acid;Subarachnoid hemorrhage;Brain edema;Tight junctions

2017-03-10

沈陽軍區(qū)總醫(yī)院神經(jīng)外科，沈陽 110016

*通信作者

10.14053/j.cnki.ppcr.201708001