李斌，李鑫，范源

1.云南中醫(yī)學院中藥學院，云南 昆明 650200；2.湖南中醫(yī)藥大學中醫(yī)診斷學湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410007

HPLC同時測定三果湯水提物中沒食子酸、柯里拉京及鞣花酸含量

李斌1，李鑫2，范源1

1.云南中醫(yī)學院中藥學院，云南 昆明 650200；2.湖南中醫(yī)藥大學中醫(yī)診斷學湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410007

目的建立 HPLC同時測定三果湯水提物中沒食子酸、柯里拉京及鞣花酸含量的方法。方法 采用Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為乙腈-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脫，檢測波長為260 nm，柱溫30 ℃，流速為1.0 mL/min。結(jié)果 沒食子酸、柯里拉京及鞣花酸3種成分有較好的基線分離，且峰形較好，分別在0.174～2.61 μg、0.04～0.60 μg、0.052～0.78 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；平均加樣回收率分別為99.98%、99.81%、100.12%，RSD均小于2.0%。結(jié)論 本方法快速、準確、重復(fù)性好，可為三果湯水提物的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

三果湯水提物；高效液相色譜法；沒食子酸；柯里拉京；鞣花酸

三果湯由訶子、毛訶子、余甘子3味藥組成，為藏醫(yī)學的重要基礎(chǔ)方，具有清熱、調(diào)和氣血、化解壞血功效[1]?！端牟酷t(yī)典》稱其“主治瘟疫，紊亂熱癥，促使熱癥成型”。研究表明，三果湯主要含鞣質(zhì)酚酸類成分，具有抗氧化、降糖調(diào)脂、抗病原微生物、抗炎、抗腫瘤等多種藥理作用[2-3]。訶子與毛訶子均為使君子科植物的干燥成熟果實。有報道，二者活性成分均為以沒食子酸為主的鞣質(zhì)類物質(zhì)，并對訶子中沒食子酸含量進行了測定[4-7]。而鞣花酸則在植物界中廣泛分布，在訶子中含量較高，有報道將鞣花酸作為訶子的質(zhì)控指標[8-9]。余甘子為大戟科葉下珠屬植物的干燥成熟果實，有機酸類物質(zhì)是其主要成分[10-12]，2015年版《中華人民共和國藥典》規(guī)定以沒食子酸為指標評價余甘子質(zhì)量。目前有較多報道增加了多酚類成分柯里拉京作為余甘子的質(zhì)控指標[13]。

中藥及其制劑質(zhì)量標準的研究與建立已由單一成分向多種成分甚至有效物質(zhì)群發(fā)展。在現(xiàn)有文獻報道中，三果湯的質(zhì)控多以單一沒食子酸或沒食子酸和鞣花酸為指標，不能充分反應(yīng)三果湯的內(nèi)在質(zhì)量[2，14]。本研究選取三果湯中3味藥物的共同藥效成分沒食子酸、訶子中的鞣花酸及余甘子中的柯里拉京為指標，建立HPLC同時測定三果湯水提物中沒食子酸、柯里拉京及鞣花酸含量的方法，為進一步完善三果湯的質(zhì)量控制標準提供參考。

1 儀器與試藥

Agilentt 1200型高效液相色譜儀（美國Agillent公司），包括四元梯度泵、真空在線脫氣機、自動進樣器、柱溫箱、VWD檢測器和 Agillent色譜工作站；YL-080ST型超聲清洗機（深圳仁義行商貿(mào)有限公司）；EYEL4型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛朗儀器有限公司）；FA1004N型1/1萬電子分析天平（上海菁海儀器有限公司）。

沒食子酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號201404）、柯里拉京對照品（四川維克奇生物科技有限公司，批號151125）、鞣花酸對照品（四川維克奇生物科技有限公司，批號140812）；訶子、毛訶子、余甘子（產(chǎn)地云南，批號分別為20160606、20160607，20160722、20160723、20160724、20160725），購自安國中藥材市場，經(jīng)云南中醫(yī)學院中藥學院范源教授鑒定分別為使君子科訶子、毛訶子的干燥成熟果實及大戟科余甘子的干燥成熟果實；乙腈為色譜純（德國Merck公司），純凈水（杭州娃哈哈集團有限公司），其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 混合對照品溶液制備

分別精密稱取沒食子酸、柯里拉京、鞣花酸對照品8.7、2.0、2.6 mg，置于50 mL量瓶中，加二甲基亞砜溶解，超聲5 min，取出，定容至刻度，過0.45 μm微孔濾膜，即得沒食子酸、柯里拉京、鞣花酸濃度分別為174、40、52 μg/mL的混合對照品溶液。

2.2 供試品溶液制備

取訶子、毛訶子、余甘子（去核）各5 g，搗碎，加入100 mL蒸餾水，浸泡30 min，煎煮3次，每次20 min，過濾，合并濾液，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮成含原藥材0.5 g/mL的三果湯水提物，冷藏，備用。精密吸取三果湯水提物1 mL，置于50 mL量瓶中，加50%甲醇溶解并定容至刻度，過0.45 μm微孔濾膜，即得。

2.3 色譜條件

色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18（4.6mm× 250 mm，5 μm），流動相A為0.1%-磷酸水溶液、B為乙腈，梯度洗脫（0～6 min，3%～10%B；6～15 min，10%～15%B；15～18 min，15%～20%B；18～25 min，20%～42%B；25～26 min，42%～55%B；26～30 min，55%B），流速為1.0 mL/min，檢測波長為260 nm[10]，柱溫為30℃，進樣量為10μL。在此色譜條件下，樣品中沒食子酸、柯里拉京和鞣花酸的色譜峰與其他相鄰峰的分離度均大于1..5，且無陰性干擾，理論塔板數(shù)按沒食子酸峰計算均不低于5000，色譜圖見圖1。

圖1 三果湯中食子酸、柯里拉京及鞣花酸HPLC圖

2.4 線性關(guān)系考察

取混合對照品溶液，在“2.3”項色譜條件下，分別進樣1、3、5、7、10、15 μL進行測定，記錄峰面積，以進樣量為橫坐標，色譜峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，進行線性回歸，得3種成分的回歸方程，見表1。

表1 沒食子酸、柯里拉京及鞣花酸線性關(guān)系考察結(jié)果

2.5 精密度試驗

精密吸取混合對照品溶液10 μL，在“2.3”項色譜條件下連續(xù)進樣6次進行分析，記錄峰面積，結(jié)果3種成分峰面積的RSD分別為2.14%、1.54%、2.81%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性實驗

取同一供試品溶液，室溫放置，于0、2、4、6、8、12 h分別進樣10 μL進行測定，記錄峰面積，結(jié)果沒食子酸、柯里拉京與鞣花酸峰面積的RSD分別為2.61%、2.52%、1.13%，表明室溫條件下供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗

取同一批訶子、毛訶子、余甘子（去核），按“2.2”項下方法制備供試品溶液，共6份，分別進樣10μL進行測定，記錄樣品中3種有效成分的峰面積，結(jié)果沒食子酸、柯里拉京及鞣花酸峰面積的 RSD分別為1.46%、0.88%、1.59%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗

取原藥材含量為0.5 g/mL的三果湯水提物0.5 mL，精密吸取9份，置于50 mL量瓶中，分別精密加入80%、100%、120%已知含量混合對照品溶液，平行3份，加甲醇溶解，定容至刻度，過0.45 μm微孔濾膜，分別進樣10 μL進行測定，記錄峰面積，計算加樣回收率，結(jié)果見表2。其中，供試品溶液以10 μL進樣分析，測得沒食子酸、柯里拉京和鞣花酸的量分別為1.574～1.921 μg、0.365～0.457 μg、0.462～0.579 μg，均在標準曲線線性范圍內(nèi)。

表2 加樣回收率試驗

2.9 樣品測定

取訶子、毛訶子及余甘子（去核）各5 g，共 6批，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，每批平行測3份，分別進樣10 μL進行測定分析，并分別計算含原藥材0.5 g/mL的三果湯水提物中沒食子酸、柯里拉京及鞣花酸的含量，結(jié)果見表3。

表3 三果湯中3種有效成分含量測定結(jié)果（%，n＝3）

3 討論

藏藥三果湯由訶子、毛訶子及余甘子按1∶1∶1比例組成，現(xiàn)主要用于治療高原紅細胞增多癥、高血壓及心血管疾病等。目前尚未見對三果湯水提物中化學成分進行定量測定的報道。鞣質(zhì)酚酸類物質(zhì)為三果湯的主要藥效成分，其極性大、易溶于水，采用水煎煮方式能較大程度提取有效成分，且具有經(jīng)濟易得、安全性高的特點。另一方面，鑒于三果湯良好的臨床療效，在藏醫(yī)藥體系中有很高的使用頻率，為研究其發(fā)揮作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，本試驗采用HPLC對用于藥效學研究的水提液中沒食子酸、柯里拉京及鞣花酸3種成分進行定量測定。

本試驗考察了50%、80%、100%甲醇及100%乙腈配制的供試品溶液，結(jié)果顯示，樣品在50%甲醇中可完全溶解，且分離度和峰形最佳。此外，鞣花酸微溶于水、醇，用不同濃度的甲醇、乙腈均不能使鞣花酸完全溶解，而用二甲基亞砜作溶媒配制混合對照品溶液進行測定，鞣花酸出峰良好。

本試驗比較分析了乙腈（甲醇）-水、乙腈（甲醇）-0.1%磷酸、乙腈（甲醇）-0.2%磷酸等流動相系統(tǒng)，結(jié)果表明，乙腈-0.1%磷酸水溶液作流動相進行梯度洗脫時，分離度較好且峰形尖銳。另外，還對柱溫（25、30、35、40 ℃）和流速（0.85、1.0、1.25、1.5 mL/min）進行了優(yōu)化，結(jié)果顯示，柱溫30～40 ℃、流速1.0～1.25 mL/min時分離效果較佳，因此選擇柱溫30 ℃、流速1.0 mL/min。

本研究以沒食子酸、柯里拉京與鞣花酸為三果湯水提物質(zhì)量控制指標，建立了HPLC同時測定三果湯水提物中沒食子酸、柯里拉京及鞣花酸含量的方法?？傊摲椒ň苄?、穩(wěn)定性、重復(fù)性均良好，結(jié)果準確，可有效控制三果湯水提物的內(nèi)在質(zhì)量，為藏藥三果湯的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供了依據(jù)。

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Content Determination of Gallic Acid, Corilagin and Ellagic Acid in Aqueous Extract from Sanguo Decoction by HPLC

LI Bin1, LI Xin2, FAN Yuan1(1. School of Chinese Medicine, Yunnan University of Chinese Medicine, Kunming 650200, China; 2. Hunan Provincial Key Laboratory of Diagnostics in Chinese Medicine, Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410007, China)

ObjectiveTo establish an HPLC method for the simultaneous determination of contents of gallic acid, corilagin and ellagic acid in aqueous extract from Sanguo Decoction. Methods The analysis was carried out on an Agilent C18 column (4.6 mm × 250 mm, 5 μm), and the mobile phase was composed of acetonitrile and 0.1% phosphoric acid aqueous with gradient elution. The detection wavelength was 260 nm. The flow rate was 1.0 mL/min at column temperature of 30 ℃. Results Gallic acid, corilagin and ellagic acid were completely separated and the peak shape was good. It showed a good linearity in the concentration range of 0.174–2.61 μg, 0.04–0.60 μg, and 0.052–0.78 μg, respectively. The average recoveries of gallic acid, corilagin and ellagic acid were 99.98%, 99.81% and 100.12%, respectively. The RSD were less than 2.0%. Conclusion This method is rapid, accurate and repeatable, which can provide references for the quality control of Sanguo Decoction.

aqueous extract from Sanguo Decoction; HPLC; gallic acid; corilagin; ellagic acid

10.3969/j.issn.1005-5304.2017.09.019

R284.1

A

1005-5304(2017)09-0076-04

2016-12-26）

（

2017-01-09；編輯：陳靜）

范源，E-mail：1647909799@qq.com