孫瑜嬬，孫理軍，孫耀光，張琪，劉熙如，柏云飛

陜西中醫(yī)藥大學，陜西 咸陽 712046

補腎中藥對腎虛質(zhì)大鼠生長發(fā)育及腦組織膽堿乙?；负康挠绊?/p>

孫瑜嬬，孫理軍，孫耀光，張琪，劉熙如，柏云飛

陜西中醫(yī)藥大學，陜西 咸陽 712046

目的探討補腎中藥對腎虛體質(zhì)大鼠生長發(fā)育及腦組織膽堿乙?；福–HAc）含量的調(diào)節(jié)作用。方法 采用“貓嚇鼠”方法制作先天不足加后天失養(yǎng)復合型腎虛模型。造模大鼠隨機分為模型組、左歸丸組和右歸丸組，空白組大鼠產(chǎn)自正常孕鼠。對仔鼠恐嚇同時開始灌胃給藥，藥物組給予左歸丸和右歸丸混懸液，空白組和模型組予等量生理鹽水，每日1次，連續(xù)3個月。觀察大鼠生長發(fā)育一般狀況，記錄5～8周齡各組大鼠體質(zhì)量和平均食物利用率，ELISA檢測大鼠腦組織CHAc含量。結(jié)果 仔鼠5～8周齡時，模型組較空白組體質(zhì)量明顯減少（P＜0.01），左歸丸組和右歸丸組體質(zhì)量較模型組明顯增加（P＜0.05，P＜0.01），平均食物利用率與體質(zhì)量呈正相關；模型組腦組織CHAc含量較空白組明顯降低（P＜0.01），左歸丸組、右歸丸組較模型組明顯升高（P＜0.01）。結(jié)論 補腎中藥可改善腎虛質(zhì)大鼠生長發(fā)育落后狀態(tài)并調(diào)節(jié)腦內(nèi)CHAc含量，從而提高腎虛質(zhì)大鼠學習記憶能力。

補腎中藥；生長發(fā)育；膽堿乙?；?；大鼠

以腎中精氣虧虛、腎臟功能低下為主要表現(xiàn)的腎虛體質(zhì)，是各類人群中常見的體質(zhì)類型之一。中醫(yī)理論有“腎主生殖、主蟄守位、在志為恐、在竅二陰”。前期研究表明，腎虛體質(zhì)模型動物較正常群體出現(xiàn)精神萎靡、瑟縮不動、敏感易驚、飲食飲水量少、體質(zhì)量偏輕、生長發(fā)育遲緩、皮毛松弛、毛發(fā)稀疏等一系列臨床現(xiàn)象[1]。一方面“腎藏精生髓”，腎精不足無以充髓實腦而致腦失其用；另一方面“恐傷腎”，恐懼不解則致腎精虧虛、腦竅失養(yǎng)。本研究以腎虛體質(zhì)模型大鼠生長發(fā)育情況及腦組織膽堿乙?；福–HAc）含量為研究對象，探討補腎中藥對腎虛體質(zhì)生長發(fā)育及腦功能衰退的調(diào)節(jié)作用。

1 實驗材料

1.1 動物

SPF級12周齡SD大鼠雄性5只、未受孕雌性10只，體質(zhì)量300～350 g，第四軍醫(yī)大學實驗動物研究中心，動物許可證號 SCXK（陜）2014-001，3月齡雄性土貓1只，鮮活小鼠。自由攝食飲水，室溫喂養(yǎng)。

1.2 藥物、試劑和儀器

左歸丸（批號120607）、右歸丸（批號150310），河南宛西制藥股份有限公司。CHAc ELISA試劑盒，艾萊薩生物科技（上海）有限公司，批號3646。全自動酶標儀（瑞士哈美頓），高速組織勻漿機（江蘇金壇中大儀器廠），低速離心機（上海安亭/飛鴿）。

2 實驗方法

2.1 分組、造模和給藥

參照本課題組前期研究方法[1]，大鼠適應性飼養(yǎng)7 d，10只雌鼠隨機分成恐嚇組6只、正常組4只，分別與雄鼠合籠交配。成功受孕后恐嚇組孕鼠置于特質(zhì)鼠籠，每日9:00－21:00置于貓籠旁被恐嚇，同時在貓籠內(nèi)放置鮮活小鼠令其捕食，使孕鼠在旁觀望持續(xù)處于恐慌狀態(tài)至產(chǎn)子；正常組不予恐嚇自然分娩。待2組所產(chǎn)仔鼠4周齡時，將正常組孕鼠所產(chǎn)仔鼠隨機 8只作為空白組，將恐嚇組母鼠所產(chǎn)仔鼠隨機 24只分為模型組、左歸丸組和右歸丸組，每組8只，繼續(xù)對此3組仔鼠進行恐嚇，持續(xù)4周。按文獻[2]公式換算，大鼠用藥量約為成人6.25倍。左歸丸成人服藥量18 g/d，大鼠給藥量為1.875 g原藥材/（kg.d），蒸餾水配制成1.875 g/mL混懸液備用。右歸丸成人服藥量9 g/d，大鼠給藥量為0.937 5 g原藥材/（kg.d），蒸餾水配制成0.937 5 g/mL混懸液備用。對仔鼠恐嚇的同時開始灌胃給藥，藥物組給予上述制備好的混懸液，空白組每日給予等量生理鹽水10 mL/kg，每日1次，每周用藥5 d停2 d，連續(xù)3個月。

2.2 生長發(fā)育觀察

每日8:00觀察各組大鼠活動狀態(tài)，記錄5～8周齡各組仔鼠體質(zhì)量和進食情況。

2.3 膽堿乙?；负繖z測

末次給藥1 h后斷頭處死，冰上迅速剝離海馬，4 ℃生理鹽水沖洗，濾紙吸干水分，稱重后置液氮凍存。制備10%海馬組織勻漿，3000 r/min離心5 min，取上清液，嚴格按照ELISA試劑盒說明書進行操作，于酶標儀450 nm處測定CHAc含量。

3 統(tǒng)計學方法

4 結(jié)果

4.1 一般狀況

模型組較其他各組精神萎靡、瑟縮不動、敏感易驚、飲食水量少、體質(zhì)量輕、生長發(fā)育遲緩、皮毛松弛、毛發(fā)稀疏且光澤度低、大便質(zhì)軟/不成形、小便多。

4.2 補腎中藥對仔鼠體質(zhì)量的影響

模型組仔鼠自5周齡開始至8周齡，體質(zhì)量均較空白組下降（P＜0.01），提示腎虛質(zhì)模型動物生長緩慢。經(jīng)藥物干預后，周齡相同的左歸丸組與右歸丸組仔鼠體質(zhì)量均較模型組更趨向正常水平（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)果見表1。

表1 各組仔鼠5～8周齡體質(zhì)量比較（±s，g）

表1 各組仔鼠5～8周齡體質(zhì)量比較（±s，g）

注：與空白組比較，△△P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別 只數(shù) 5周齡 6周齡 7周齡 8周齡空白組 8 1 1 6 . 0 ± 0 . 7 1 6 3 . 7 ± 7 . 6 2 0 9 . 9 ± 1 4 . 2 2 1 7 . 3 ± 1 0 . 8模型組 8 1 0 7 . 4 ± 2 . 2△△ 1 4 3 . 4 ± 7 . 2△△ 1 8 0 . 1 ± 1 5 . 0△△ 1 9 1 . 1 ± 1 5 . 8△△左歸丸組 8 1 1 2 . 9 ± 2 . 1** 1 5 4 . 9 ± 4 . 0** 1 9 3 . 6 ± 1 5 . 3** 2 0 8 . 7 ± 1 5 . 2*右歸丸組 8 1 1 2 . 9 ± 1 . 9** 1 5 8 . 7 ± 9 . 2** 1 9 6 . 3 ± 1 6 . 7** 2 0 9 . 1 ± 1 2 . 6*

4.3 補腎中藥對仔鼠進食情況的影響

隨著仔鼠周齡的增加，各組仔鼠進食均有所增多。但與相同周齡仔鼠間比較，模型組仔鼠進食均遠低于空白組，且經(jīng)過藥物干預的左歸丸組和右歸丸組仔鼠進食水平較腎虛質(zhì)有所改善且更趨于正常水平。結(jié)果見表2。

表2 各組仔鼠5～8周齡進食情況比較（g）

4.4 補腎中藥對仔鼠腦組織膽堿乙?；负康挠绊?/p>

與空白組比較，模型組仔鼠腦組織CHAc含量顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，左歸丸組和右歸丸組仔鼠腦組織CHAc含量顯著升高（P＜0.01）。結(jié)果見表3。

表3 各組仔鼠腦組織CHAc含量比較（±s，ng/mL）

表3 各組仔鼠腦組織CHAc含量比較（±s，ng/mL）

注：與空白組比較，△△P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01

組別 只數(shù) CHAc空白組 8 72.34±4.89模型組 8 41.11±8.24△△左歸丸組 8 64.79±6.37**右歸丸組 8 68.61±9.35**

5 討論

本實驗采用“貓嚇鼠”經(jīng)典方法造模，觀察被恐嚇孕鼠，其日?；顒用黠@減少，喜蜷縮角落、目光恐懼、極其敏感易驚、大便質(zhì)軟甚至不成形、小便增多，且出現(xiàn)早產(chǎn)現(xiàn)象，正常母鼠基本于合籠后 18～22 d陸續(xù)產(chǎn)子，而被土貓恐嚇的孕鼠合籠后第15日便產(chǎn)子。同時被恐嚇的孕鼠生殖率低于正常孕鼠，上述現(xiàn)象充分體現(xiàn)了中醫(yī)藏象理論中腎主生殖、主蟄守位、在志為恐、在竅二陰的生理特性。

觀察各組仔鼠一般情況發(fā)現(xiàn)，模型組較其他各組出現(xiàn)精神萎靡、瑟縮不動、敏感易驚、飲食飲水量少、體質(zhì)量偏輕、生長發(fā)育遲緩、皮毛松弛、毛發(fā)稀疏且光澤度低、大便質(zhì)軟或不成形、小便較多等一系列符合中醫(yī)腎虛體質(zhì)臨床特點的現(xiàn)象；解剖時發(fā)現(xiàn)模型組2只仔鼠胸廓畸形，胸骨偏向右側(cè)，心臟異位。腎主骨、主生長發(fā)育，腎虛質(zhì)仔鼠骨骼臟器發(fā)育的異常符合中醫(yī)腎虛體質(zhì)的臨床特點。模型組大鼠體質(zhì)量顯著降低，表明腎虛質(zhì)仔鼠由于先天稟賦不足加后天情志損傷，致腎精虧損，出現(xiàn)發(fā)育緩慢甚至畸形的腎虛質(zhì)表現(xiàn)。

“腎虛則智不足”（《醫(yī)學心悟》），“腎藏精生髓”，腦為髓海，主神志思維，司機體運動，故腎虛則精不上承而腦髓空虛、腦竅失養(yǎng)致腦失其用。腎精足，腦髓化生有源，腦髓足，則神旺；腎精虛則髓乏，不能上充于腦，表現(xiàn)為學習記憶能力降低和健忘神衰等[3-5]。

中樞膽堿能系統(tǒng)可通過大腦邊緣系統(tǒng)及大腦皮層調(diào)節(jié)機體的學習記憶能力[6-8]。乙酰膽堿（Ach）是中樞膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)中重要神經(jīng)遞質(zhì)之一，腦內(nèi)細胞外液中 Ach濃度與學習記憶能力密切相關。同時，Ach與不同膽堿能受體結(jié)合后可影響相應腺體的分泌，以及平滑肌的收縮、骨骼肌的發(fā)育、神經(jīng)元的興奮等，故Ach的含量變化可充分反映機體的生長發(fā)育狀況和學習記憶能力。CHAc作為一種轉(zhuǎn)移酶，是膽堿能神經(jīng)元中的特殊標志酶，也是合成Ach的關鍵，只有在CHAc的催化下膽堿才能和乙酰輔酶A結(jié)合生成Ach?？梢哉f腦內(nèi)CHAc與Ach神經(jīng)元幾乎平行分布[9-10]，故CHAc是反映機體學習記憶能力及生長發(fā)育狀況的必要指標。比較各組大鼠腦組織CHAc含量差異發(fā)現(xiàn)，與空白組比較，模型組顯著降低；與模型組比較，左歸丸組和右歸丸組顯著升高；左歸丸組和右歸丸組間雖存在差異但無統(tǒng)計學意義。故腎虛質(zhì)大鼠生長發(fā)育遲緩及學習記憶能力降低的機制與其腦內(nèi)CHAc含量的減少密切相關，同時左歸丸和右歸丸對其具有改善和提高作用。先天不足加后天失養(yǎng)的復合型腎虛質(zhì)動物模型體現(xiàn)了中醫(yī)整體觀念，符合中醫(yī)情志致病的病因?qū)W原理，符合中醫(yī)腎的藏象學理論，具有操作的可行性。本實驗結(jié)果表明，通過左歸丸和右歸丸2種補腎藥物的干預治療，可明顯改善腎虛質(zhì)大鼠的生長發(fā)育和升高腦CHAc含量，為臨床腎虛體質(zhì)相關疾病和亞健康的防治提供實驗依據(jù)。

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Effects of Kidney Reinforcing Medicine on Growth and Development and Brain Choline Acetyl Transferas Content of Rats with Kidney-deficiency Constitution

SUN Yu-ru, SUN Li-jun, SUN Yao-guang, ZHANG Qi, LIU Xi-ru, BO Yun-fei (Shaanxi University of Chinese Medicine, Xianyang 712046, China)

ObjectiveTo discuss the adjustment effects of kidney reinforcing medicine on growth and development and the content of choline acetyl transferase (CHAc) in rats with kidney-deficiency constitution. Methods The method of “cats scare rats” was used to build composite offspring rat models with deficiency and acquired dystrophy, and then the models were divided into model group, Zuogui Pill group and Yougui Pill group. The rats in blank group came from normal pregnant rats. Baby rats were scared and

gavage at the same time. All administration groups received suspension of Zuigui Pills or Yougui Pills. Blank group and model group received the same amount of normal saline, once a day, for 3 months. Growth and development of rats were observed. Weight and food utilization of rats aged 5–8 weeks in each group were recorded. The content of brain CHAc was detected by ELISA. Results When offspring were 5–8 weeks old, weights of rats in the model group were lower than blank group (P＜0.01); while weights of rats in Zuogui Pill group and Yougui Pill group increased significantly (P＜0.05) and the food utilization was positively correlated with weight; the CHAc content in the model group decreased significantly compared with blank group (P＜0.05, P＜0.01); while the CHAc content in Zuogui Pill group and Yougui Pill group increased significantly compared with the model group (P＜0.01). Conclusion Kidney reinforcing medicine can improve backward growth and development of rats with kidney-deficiency constitution and adjust CHAc in the brain, so as to promote the learning and memory ability of rats with kidney-deficiency constitution.

kidney reinforcing medicine; growth and development; CHAc; rats

10.3969/j.issn.1005-5304.2017.09.012

R285.5

A

1005-5304(2017)09-0048-03

2017-02-13）

（

2017-03-15；編輯：華強）

陜西省重點實驗室研究項目（15JS026）

孫理軍，E-mail：1246503262@qq.com